TWI739738B - 貽貝水溶性萃取物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種藉由酶水解貽貝材料所產生之貽貝水溶性萃取物。該萃取物包含高比例之低分子量肽且展現出消炎性質。

Description

貽貝水溶性萃取物
本申請案主張2015年3月24日申請之紐西蘭(New Zealand)臨時申請案706298之優先權，其以引用的方式併入本文中。
本發明係關於貽貝水溶性萃取物、包含其之組合物及其於類藥劑營養品及藥物應用中之用途。
已知貝類、尤其貽貝富含有助健康之化合物。貝類萃取物為全球市場上已建立之類藥劑營養品類別。
一些貝類萃取物具有消炎及其他藥物功效，常常宣稱源自脂質部分。發炎與各種病況相關，包括關節炎、動脈粥樣硬化及癌症。發炎之當前醫學治療在很大程度上依賴於非類固醇消炎藥(NSAID)，諸如阿司匹靈(aspirin)，許多非類固醇消炎藥具有不當副作用。因此，十分期望副作用較少之類藥劑營養品貝類製劑。
已描述過許多貝類類藥劑營養品製劑。此類製劑之真正的化學組成視諸多因素而定，該等因素包括：(a)源材料，包括貝類之物種、其年齡及其生長環境條件；及(b)用於獲得製劑之方法，例如選擇性消除、保留、破壞或改變某些種類之化合物的步驟，將影響最終製劑之化學組成。
迄今為止，貝類類藥劑營養品製劑一直聚焦於整個動物萃取物 或材料之脂質部分。已廣泛地使用超臨界CO2萃取經冷凍乾燥之材料來產生貽貝脂質萃取物，尤其青殼貽貝(green-shelled mussel)脂質萃取物，諸如以商品名LyprinolTM出售之彼等貽貝脂質萃取物。
然而，貽貝全粉不可溶且一般具有難聞的「魚腥」味，此味道使得其不適合包含於許多食物產品中。貽貝脂質萃取物亦不可溶且「魚腥」味/臭味會隨著氧化而加劇，氧化可能發生於許多標準食品加工步驟期間。其一般必須以經脂質填充之膠囊形式投與，從而掩飾難聞的氣味及味道。
因此，提供一種具有藥用益處之貽貝水溶性萃取物係為有利的，該萃取物不存在與類似的貽貝全粉及/或脂質萃取物相關的缺點。
本發明之目標為提供此類萃取物，或至少向公眾提供有用的選擇。
在一個態樣中，本發明提供一種貽貝水溶性萃取物。
在一個實施例中，貽貝水溶性萃取物包含以固體計至少約45重量%之肽，較佳低分子量肽。
在一個實施例中，貽貝水溶性萃取物包含以固體計約45重量%至約65重量%之肽，較佳約50重量%至約60重量%之肽。
在一個實施例中，超過90重量%、較佳超過95重量%之肽小於5KDa。
在一個實施例中，超過75重量%、較佳超過80重量%之肽小於2KDa。
在一個實施例中，超過35重量%、較佳超過40重量%之肽小於1KDa。
在一個實施例中，貽貝水溶性萃取物包含以固體計不超過約5重 量%之脂質。
在一個實施例中，貽貝水溶性萃取物具有消炎活性。
在另一態樣中，本發明提供一種用於產生貽貝水溶性萃取物之方法，該方法包含以下步驟：(a)使用一或多種蛋白水解酶使貽貝材料之水性懸浮液水解；(b)使水解混合物中之酶變性，及(c)自水解混合物中移除不可溶材料，得到貽貝水溶性萃取物。
在一個實施例中，在酶變性之後，將水解混合物調整至pH 4。
在一個實施例中，純化及/或濃縮貽貝水溶性萃取物。
在一個實施例中，貽貝選自下組，該組包括(但不限於)青殼(或青邊)貽貝(GSM)(紐西蘭殼菜蛤(Perna canaliculus))、藍貽貝(紫殼菜蛤(Mytilus edulis))及羅紋貽貝(毛利(Maori)名科帕科帕(kopakopa))(Aulacomya atra maoriana)。較佳地，貽貝為GSM。
在一個實施例中，貽貝材料為整個新鮮貽貝。在另一實施例中，貽貝材料為由乾燥整個新鮮貽貝產生之貽貝粉末。在另一實施例中，貽貝材料為由超臨界流體萃取貽貝粉末或其他貽貝材料產生之貽貝超臨界殘渣。
在另一態樣中，本發明提供一種類藥劑營養品組合物，其包含本發明之貽貝水溶性萃取物及一或多種可食用賦形劑。
在一個實施例中，類藥劑營養品組合物包含麥芽糊精及/或抗氧化劑。
在一個實施例中，類藥劑營養品組合物包含食品組合物、食品添加劑組合物、膳食增補劑或醫療食品。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之貽貝水溶性萃取物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
在一個實施例中，醫藥組合物包含口服劑型，較佳散劑。
在另一態樣中，本發明提供一種用於減輕有其需要之個體之發炎的方法，該方法包含向個體投與治療有效量之本發明之貽貝水溶性萃取物。
在另一態樣中，本發明提供一種用於預防、治療或管理有其需要之個體之與發炎相關之病況的方法，該方法包含向個體投與治療有效量之本發明之貽貝水溶性萃取物。
在一個實施例中，與發炎相關之病況為慢性病況。
在一個實施例中，與發炎相關之病況選自包含以下之群：哮喘；腦炎；發炎性腸道疾病，包括克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎；慢性阻塞性肺病(COPD)；過敏性病症；纖維化；關節炎，包括幼年型關節炎、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎及骨關節炎；牛皮癬；多肌痛；肌腱炎；滑囊炎；喉炎；齒齦炎；胃炎；耳炎；乳糜瀉；憩室炎；動脈粥樣硬化；心臟病；肥胖症；糖尿病；癌症及阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。
在一個實施例中，與發炎相關之病況使發炎性TNFα及/或IL-1β之含量增加。
在一個實施例中，本發明之貽貝水溶性萃取物經口投與。
現將參考圖式來描述本發明之實施例，在圖式中：圖1為展示用於抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之IL-1β的陽性(地塞米松(dexamethasone))及陰性(二甲亞碸，DMSO)分析對照的圖。
圖2為展示GSM殘渣粉末之水溶性萃取物對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之IL-1β的影響的圖。
圖3為展示GSM全粉之兩種水溶性萃取物對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之IL-1β的影響的圖。測試兩種酶組合之 蛋白質水解。
圖4為展示整個新鮮藍貽貝之水溶性萃取物對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之IL-1β的影響的圖。
圖5為展示整個新鮮GSM之水溶性萃取物(含脫脂步驟)對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之IL-1β的影響的圖。
圖6為展示整個新鮮科帕科帕之水溶性萃取物對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之IL-1β的影響的圖。
圖7為展示用於抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的陽性(地塞米松)及陰性(DMSO)分析對照的圖。
圖8為展示GSM殘渣粉末之水溶性萃取物對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的影響的圖。
圖9為展示GSM全粉之兩種水溶性萃取物對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的影響的圖。
圖10為展示整個新鮮藍貽貝之水溶性萃取物對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的影響的圖。
圖11為展示整個新鮮GSM之水溶性萃取物(含脫脂步驟)對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的影響的圖。
圖12為展示整個新鮮科帕科帕之水溶性萃取物對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的影響的圖。
圖13為展示GSM殘渣粉末(中試規模)之水溶性萃取物對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之IL-1β的影響的圖。
圖14為展示GSM殘渣粉末(中試規模)之水溶性萃取物對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的影響的圖。
圖15為展示未水解之GSM殘渣粉末對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之IL-1β的影響的圖。
圖16為展示未水解之GSM全粉對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核 細胞性THP-1細胞中之IL-1β的影響的圖。
圖17為展示未水解之GSM殘渣粉末對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的影響的圖。
圖18為展示未水解之GSM全粉對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的影響的圖。
圖19為由水溶性萃取物PAR 58之LC-MS分析產生的產物陽離子基峰層析圖。
圖20為由未水解之GSM殘渣粉末之LC-MS分析產生的產物陽離子基峰層析圖。
圖21為由未水解之GSM全粉之LC-MS分析產生的產物陽離子基峰層析圖。
圖22為由水溶性萃取物PAR 58之LC-MS分析產生的產物陰離子基峰層析圖。
圖23為由未水解之GSM殘渣粉末之LC-MS分析產生的產物陰離子基峰層析圖。
圖24為由未水解之GSM全粉之LC-MS分析產生的產物陰離子基峰層析圖。
1.1定義
除非另外明確指出，否則如本文所用之「一(a/an)」意謂至少一個/種。
如本文所用，術語「約」係指比由該術語修飾之值高或低不超過10%的值。
如在本說明書及申請專利範圍中所用之術語『包含』意謂『至少部分地由……組成』。當解釋本說明書及申請專利範圍中之包括術語『包含(comprising)』之表述時，亦可在各表述中存在除前面冠以 此術語之特徵之外的其他特徵。諸如『包含(comprise)』及『包含(comprised)』之相關術語將以類似方式解釋。
如本文所用，術語「治療有效量」在向個體投與療法之情況下意謂足以降低或改善病況或其一或多種症狀之嚴重程度、持續時間，預防病況進展，引起病況消退，預防病況復發、發展或發作，或增強或改善另一療法之預防性或治療性作用的量。
如本文所用，術語「管理(manage)」、「管理(managing)」及「管理(management)」在向個體投與療法之情況下係指個體自療法獲得之有益作用，同時未引起病況之治癒。舉例而言，病況之管理包括預防病況惡化。
如本文所用，術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」及「預防(prevention)」在向個體投與療法之情況下係指預防或抑制由投與療法引起的病況復發、發作或發展。
如本文所用，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」及「治療(treating)」在向個體投與療法之情況下係指降低或改善由投與療法引起之病況進展、嚴重程度及/或持續時間，或改善其一或多種症狀。
如本文所用，術語「水溶性」當應用於材料時意謂該材料具有至少45%(w/v)溶解度。
在已參考專利說明書、其他外部文獻或其他資訊來源之本說明書中，此一般係出於提供論述本發明特徵之語境的目的。除非另外特別說明，否則此類外部文獻不應理解為承認在任何司法管轄權限內此類文獻或此類資訊來源為先前技術或形成此項技術中公共常識之一部分。
在本說明書中之描述中，可參考不在本申請案之申請專利範圍的範疇內之標的物。彼標的物應該可輕易地由熟習此項技術者鑑別且可有助於如本申請案之申請專利範圍中所定義實踐本發明。
1.2產生本發明之貽貝水溶性萃取物之方法
本發明之貽貝水溶性萃取物可輕易地使用如下所述之習知處理技術製備。
本發明提供一種用於產生貽貝水溶性萃取物之方法，該方法包含以下步驟：(a)使用一或多種蛋白水解酶使貽貝材料之水性懸浮液水解；(b)使水解混合物中之酶變性，及(c)自水解混合物中移除不可溶材料，得到貽貝水溶性萃取物。
如本文所用之術語「貽貝」係指海洋貽蛤科(Mytilidae)之可食用的雙殼貝類。在一個實施例中，本發明方法中所用之貽貝為紐西蘭貽貝。
在一個實施例中，貽貝選自下組，該組包括(但不限於)GSM、藍貽貝及科帕科帕。較佳地，貽貝為GSM。
在一個實施例中，貽貝材料為「整個新鮮」貽貝。此可藉由收集在移除貽貝外殼、足及須之後剩餘之材料獲得。在另一實施例中，貽貝材料為經乾燥之貽貝粉末。此一般藉由乾燥整個新鮮貽貝，通常藉由冷凍乾燥，且研磨成粉末來獲得。
在另一實施例中，貽貝材料為貽貝超臨界殘渣。術語「殘渣」一般指在諸如植物或動物材料之生物材料的萃取之後剩餘的有機材料。如本文所用，術語「超臨界殘渣」意謂在超臨界流體萃取之後剩餘的有機材料。
如本文所用，術語「貽貝超臨界殘渣」意謂在超臨界流體萃取貽貝肉或貽貝粉末之後剩餘的有機材料。
在一個實施例中，貽貝材料為貽貝超臨界殘渣，較佳GSM超臨界殘渣。
在該方法之第一步中，用一或多種蛋白水解酶水解貽貝材料之 水性懸浮液。
水解藉由在針對所用酶或酶系統最佳化之條件下培育貽貝材料之水性懸浮液與蛋白水解酶來進行。通常，應該將pH調整至介於約5.5至約8之間的某點。視情況，可向水性懸浮液中添加抗氧化劑，例如Oxyless U。
視所用酶系統而定，通常將水性懸浮液加熱至約30℃至約65℃，持續1至24小時。一般而言，將貽貝材料懸浮於冷水中，且將混合物加熱至所需溫度。然而，或者可將貽貝材料懸浮於已加熱之水中。
在水解期間，貽貝材料中所存在之蛋白質會水解為低分子量肽。水解必須以酶促方式進行，從而產生具有適當分子量範圍之肽。舉例而言，用酸進行的化學水解為非選擇性的。不受理論限制，咸信本發明之貽貝水溶性萃取物之消炎性質存在於所存在之特定低分子量肽中。破壞此等肽或防止其形成之處理步驟會改變萃取物之消炎活性。
蛋白水解酶可具有任何類型，例如內型、外型蛋白酶/肽酶、胺基肽酶、絲胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶及其類似者。在一個實施例中，蛋白水解酶之最適pH各自為弱酸性至約中性。在一個實施例中，蛋白水解酶為非動物酶。
適合之蛋白水解酶包括木瓜酶(papain)、鹼性蛋白酶(Alcalase)(枯草桿菌蛋白酶(subtilisin))、伊茲德酶FP(Enzidase FP)(來源於米麴菌變異體(Aspergillus oryzae var.)之所選菌株的內/外肽酶)及中性伊茲德酶(Enzidase Neutral)(來源於解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)之未經遺傳修飾菌株之控制醱酵的金屬中性內肽酶)。
在一個實施例中，蛋白水解酶選自包含以下之群：木瓜酶、伊茲德酶FP、中性伊茲德酶、鹼性蛋白酶及其類似者。
在一個實施例中，蛋白水解酶包含木瓜酶及伊茲德酶FP。
在另一實施例中，蛋白水解酶包含鹼性蛋白酶、中性伊茲德酶及伊茲德酶FP。
在水解期間，貽貝材料之水性懸浮液之溫度不應過熱以致於使酶降解或抑制其活性。水解之持續時間將視所用酶之活性及貽貝材料而定。
水解步驟係在攪拌下進行，從而使酶與貽貝材料之間的接觸達到最佳。
一旦水解完全，酶即變性。在一個實施例中，在足以使蛋白水解酶變性之條件下加熱水解混合物。在一個實施例中，在約80℃至約95℃下加熱水解混合物約30至約40分鐘。在另一實施例中，在約80℃至約95℃下加熱水解混合物約20至約40分鐘。
在一個實施例中，可在酶變性之前視情況處理已水解貽貝材料之水性懸浮液以移除脂質。脂質移除可使用此項技術中已知之任何方法實現，例如使用物理技術，諸如離心或化學萃取。
在化學萃取中，自已水解貽貝材料之水性懸浮液移除水，隨後使其與脂質部分可溶之溶劑接觸。隨後將脫脂產物(貽貝殘渣)再懸浮於水中且水解酶變性。
在另一實施例中，冷凍乾燥已水解貽貝材料之水性懸浮液以形成粉末，用有機溶劑沖洗粉末以移除脂質。可使用之溶劑之實例包括(但不限於)丙酮、乙醇、異丙醇、己烷、乙酸乙酯及二甲基甲醯胺。
在另一實施例中，將已水解貽貝材料之水性懸浮液乾燥且用諸如CO2或CO2/乙醇之超臨界溶劑萃取以移除脂質部分。隨後將脫脂產物(貽貝殘渣)再懸浮於水中且水解酶變性。
在貽貝材料之脂質相當高的情況下可視情況使用脫脂步驟。在貽貝材料具有低脂質含量之情況下，例如整個新鮮貽貝或粉末狀藍貽 貝或當使用貽貝殘渣時，可省略脫脂步驟。
在水解酶變性之後，可將混合物之pH調整至約3.5至約4.2，較佳約4，以防止微生物造成的腐敗。可使用諸如磷酸、檸檬酸或鹽酸之試劑來調整pH。
隨後移除水解混合物中所存在之不可溶材料，得到本發明之貽貝水溶性萃取物。
不可溶材料可藉由此項技術中已知之任何方法移除。在一個實施例中，不可溶材料係藉由離心水解混合物及回收上清液進行移除。
一般而言，在移除不可溶材料之前調整pH，但若不可溶材料含有貝殼碎片，則應該首先移除此不可溶材料，以防止外殼因酸溶解。
本發明之貽貝水溶性萃取物可例如藉由與活性炭接觸加以處理，從而移除造成不當顏色及/或臭味之雜質。該炭可容納在容器中並且使產物通過該容器。或者，可使用塗有矽藻土之壓濾機或等效物移除碳、剩餘碎屑及脂質殘餘物。
貽貝水溶性萃取物亦可藉由移除一些或全部所存在之水進行濃縮。
在一個實施例中，乾燥貽貝水溶性萃取物，得到粉末狀萃取物。可使用此項技術中已知之任何技術進行乾燥，包括冷凍乾燥。
諸如麥芽糊精及抗氧化劑之試劑可添加至本發明之貽貝水溶性萃取物中。
實例1-8描述產生本發明之貽貝水溶性萃取物之方法。
1.3本發明之貽貝水溶性萃取物
上文所述之本發明方法可產生富含肽、尤其低分子量肽之貽貝水溶性萃取物。如本文所用，術語「低分子量肽」意謂分子量為5kDa或小於5kDa之肽。
萃取物具有可接受之味道，無苦味。可冷凍萃取物，且無低溫 沈澱。貽貝萃取物之粉末溶解度特徵不會隨乾式儲存而改變。
本發明之貽貝水溶性萃取物主要包含肽，尤其低分子量肽。如實例1-8中產生的萃取物之分子量分佈中可見，萃取物中所存在之肽超過90%小於5kDa。
本發明之水溶性萃取物所包含之化合物比未水解之起始材料多，如圖19至圖24中可見，該等圖顯示對本發明之GSM貽貝水溶性萃取物及GSM殘渣及全粉起始材料所進行之LC-MS分析之結果。
在一個實施例中，貽貝水溶性萃取物包含以固體計至少約45重量%之肽，較佳低分子量肽。
在另一實施例中，貽貝水溶性萃取物包含以固體計至少約45重量%至約65重量%之肽，較佳約50重量%至約60重量%之肽。
在一個實施例中，超過90重量%、較佳超過95重量%之肽小於5KDa。
在一個實施例中，超過75重量%、較佳超過80重量%之肽小於2KDa。
在一個實施例中，超過35重量%、較佳超過40重量%之肽小於1KDa。
亦可存在一些碳水化合物材料、脂質及其他材料及礦物質。
萃取物之肽含量係基於所存在之「固體」計算，以便保持不受其濃度影響。萃取物中所存在之「固體」構成當移除所存在之任何溶劑(包括水)時剩餘之材料。所存在之「固體」包括肽、碳水化合物及脂質以及任何其他非溶劑材料。
本發明萃取物之溶解度為至少45%(w/v)。溶解度可藉由用萃取物飽和水(1：1比率)，離心，隨後乾燥所得上清液以確定溶解重量來測定。
在一個實施例中，本發明之貽貝水溶性萃取物為乾粉。
計算萃取物中所存在之肽之重量%時不包括添加至萃取物中之固體賦形劑，諸如麥芽糊精及抗氧化劑。
在一個實施例中，本發明提供一種貽貝水溶性萃取物，其包含以固體計至少約45重量%之肽，其中超過90重量%之肽小於5KDa。
在另一實施例中，本發明提供一種貽貝水溶性萃取物，其包含以固體計約50重量%至約60重量%之肽，其中超過95重量%之肽小於5KDa。
1.4本發明之肽水溶性萃取物之用途
發炎為涉及更改生物體之生理學的分子信號及細胞信號之複雜生物級聯的過程。雖然在身體受傷或感染之後急性發炎可保護且癒合身體，但慢性發炎會產生在諸多退化疾病中起重要作用的變化。慢性發炎主要由單核細胞及長壽的巨噬細胞介導。巨噬細胞釋放化學介體，包括IL-1、IL-6家族、TNFα及前列腺素。此等介體觸發其他促炎性細胞因子之上調。IL-1、IL-6及TNFα為主要的發炎性生物標記，其在發炎細胞中存在之含量高於靜止細胞中。
細菌或外來粒子之吞噬作用與嗜中性白血球之攝氧量增加(稱作呼吸爆發(respiratory burst))有關。在此階段期間，產生活性含氧物(reactive oxygen species；ROS)，諸如羥基自由基、超氧陰離子、單態氧及過氧化氫。此等物質殺死入侵的微生物或寄生蟲。
類藥劑營養品可經由若干機制抑制或減少發炎過程，該等機制包括阻斷諸如IL-1及TNFα之促炎性細胞因子之表現，抑制產生ROS之酶的活性或提高ROS清除能力。
如實例9中所闡述，本發明之貽貝水溶性萃取物已發現具有針對已知發炎標記之活性且因此咸信可減輕或預防發炎。所示活性為諸如全粉或殘渣之未水解之起始貽貝材料的消炎活性之若干倍，如表10及表11中所示。
在一個態樣中，本發明提供一種用於減輕有其需要之個體之發炎的方法，該方法包含向個體投與治療有效量之本發明之貽貝水溶性萃取物。
在另一態樣中，本發明提供一種用於預防、治療或管理有其需要之個體之與發炎相關之病況的方法，該方法包含向個體投與治療有效量之本發明之貽貝水溶性萃取物。
在另一態樣中，本發明提供本發明之貽貝水溶性萃取物之用途，其係用於製造供減輕有其需要之個體之發炎用之藥物。
在另一態樣中，本發明提供本發明之貽貝水溶性萃取物之用途，其係用於製造供預防、治療或管理有其需要之個體之與發炎相關之病況用的藥物。
本發明亦提供本發明之貽貝水溶性萃取物，其用於減輕有其需要之個體之發炎。
本發明亦提供本發明之貽貝水溶性萃取物，其用於預防、治療或管理有其需要之個體之與發炎相關之病況。
在一個實施例中，與發炎相關之病況為慢性病況。
在另一實施例中，與發炎相關之病況使發炎性標記TNFα及/或IL-1β之含量增加。
可根據本發明預防、治療或管理之與發炎相關之病況的實例包括(但不限於)哮喘；腦炎；發炎性腸道疾病，包括克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎；慢性阻塞性肺病(COPD)；過敏性病症；纖維化；關節炎，包括幼年型關節炎、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎及骨關節炎；牛皮癬；多肌痛；肌腱炎；滑囊炎；喉炎；齒齦炎；胃炎；耳炎；乳糜瀉；憩室炎；動脈粥樣硬化；心臟病；肥胖症；糖尿病；癌症及阿茲海默氏病。
本發明亦提供一種用於降低有其需要之個體之發炎性標記TNFα 及/或IL-1β之含量的方法，該方法包含向個體投與治療有效量之本發明之貽貝水溶性萃取物。
需要預防、治療或管理與發炎相關之病況的個體為經診斷患有此類病況、具有患此類病況之風險或已自此類病況恢復之個體。個體可能由於遺傳及/或環境因素而易患該病況及/或具有患該病況之風險。
在一個實施例中，個體為哺乳動物，較佳人類。在另一實施例中，個體為伴侶動物或馬。
本發明之貽貝水溶性萃取物之投與可經由醫藥組合物或類藥劑營養品組合物。
在一個態樣中，本發明提供一種類藥劑營養品組合物，其包含本發明之貽貝水溶性萃取物及一或多種可食用賦形劑。
在一個實施例中，本發明之類藥劑營養品組合物為食品組合物、食品添加劑組合物、膳食增補劑或醫療食品組合物。
如本文所用之術語「可食用」一般意謂適合於或經政府監管機構批准可由動物及人類食用。
如本文所用之術語「食品」意謂任何物質，無論經加工、半加工或生的，其預期由包括人類在內之動物食用且包括(但不限於)飲料及口香糖。本發明之食品組合物包含本發明之貽貝水溶性萃取物以及食品。
如本文所用之術語「食品添加劑」係指通常本身不作為食品食用但出於技術目的添加至食品中的任何物質。實例為天然及人工甜味劑、著色劑、固化及酸洗劑、調味劑、乳化劑、脂肪替代品、硬化劑、膨鬆劑、潤滑劑、保濕劑、防腐劑、穩定劑及增稠劑。本發明之食品添加劑組合物包含本發明之貽貝水溶性萃取物以及一或多種食品添加劑。
如本文所用之術語「膳食增補劑」係指旨在增補膳食之產品，其包括以下成分中之一或多者：維生素、礦物質、香草、代謝物、萃取物及其類似者。膳食增補劑通常不打算作為一餐的僅有項目使用，但可獨立於任何食品食用。本發明之膳食增補劑包含本發明之貽貝水溶性萃取物以及一或多種膳食增補劑。
如本文所用之術語「醫療食品」係指經調配用於在開業醫師監督下食用或經腸投與之食品。醫療食品預期用於具有獨特營養需求之病況的膳食管理。醫療食品之實例包括(但不限於)唯一來源營養產品、口服復水溶液及預期用於代謝障礙之膳食管理的產品。本發明之醫療食品組合物包含本發明之貽貝水溶性萃取物以及醫療食品。
在一個實施例中，本發明之類藥劑營養品組合物為食品組合物。本發明之水溶性萃取物尤其適用作食品組合物，因為其氣味及味道令人愉悅，且因此可直接添加至食品中。不同於其他貽貝產品，其不需要進行囊封。實例11描述兩種本發明之水溶性萃取物中所存在之揮發性有機化合物的分析。表13及表14中所示之結果與品嘗起來令人愉悅的組合物一致。
在一個實施例中，食品組合物為焙烤產品，包括(但不限於)麵包、比薩餅餅底(pizza base)、蛋糕、英式鬆麵包(muffin)、甜甜圈、餅乾、玉米薄餅、卷餅(wrap)、印度烤餅(naan)、麵條及意大利麵(pasta)。
在另一實施例中，食品組合物為液體食品，包括牛奶、果汁、冰沙(smoothies)、酸奶、湯及軟飲料。本發明之貽貝水溶性萃取物亦可添加至乾混合物中，諸如速食湯(instant soup)、飲料、布丁(pudding)及蛋糕粉(cake mix)。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之貽貝水溶性萃取物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
如本文所用之術語「醫藥學上可接受」意謂經政府監管機構批准用於動物、尤其人類中。
如本文所用之術語「賦形劑」包括媒劑、載劑、稀釋劑、佐劑、穩定劑或填充劑，本發明之貽貝水溶性萃取物與其一起儲存、運輸或投與。適合賦形劑已為熟習藥學技術者所熟知且包括(但不限於)澱粉(及其衍生物，諸如麥芽糊精)、葡萄糖、蔗糖、麵粉、矽膠、甘油、氯化鈉、水、抗壞血酸及乙醇。特定賦形劑是否適合併入本發明之醫藥組合物中將視劑型之投與方式而定。
本發明之醫藥組合物可藉由任何適合途徑投與，包括(但不限於)非經腸、經口、鼻內、局部、經皮、經黏膜及經直腸。
劑型之組成及形狀通常將視用法而改變。劑型之實例包括(但不限於)錠劑、膠囊、丸劑、集結粒、含有液體之膠囊、糖衣錠、口含錠、分散劑、栓劑、鼻用噴霧劑或吸入劑、凝膠、懸浮液、乳液、溶液及酏劑。
在一個實施例中，本發明提供本發明之貽貝水溶性萃取物之口服劑型。由於其無論作為類藥劑營養品組合物或作為醫藥組合物均易於投與，所以口服劑型較佳。典型的口服劑型係藉由將經乾燥之本發明之貽貝水溶性萃取物與至少一種適用於固體口服劑型之賦形劑組合來製備。隨後使產品成形成所要劑型。
此類賦形劑包括(但不限於)稀釋劑、成粒劑、濕潤劑、懸浮劑、填充劑、潤滑劑、黏合劑及崩解劑。
黏合劑之實例包括(但不限於)玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或其他澱粉、明膠、膠狀物(諸如阿拉伯膠(acacia)及瓜爾膠(guar))、海藻酸鈉、粉末狀黃蓍、纖維素及其衍生物，包括羧甲基纖維素、預膠凝纖維素、羥丙基纖維素及微晶纖維素。填充劑之實例包括(但不限於)滑石、碳酸鈣顆粒或粉末、微晶纖維素、粉末狀纖維素、葡萄糖結合 劑、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇及澱粉。崩解劑確保錠劑在曝露於水性環境時崩解。實例包括(但不限於)洋菜(agar-agar)、碳酸鈣、海藻酸、交聯羧甲纖維素鈉、微晶纖維素、預膠凝澱粉、黏土及膠狀物。潤滑劑包括(但不限於)硬脂酸鈣、輕質礦物油、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇、月桂基硫酸鈉、氫化植物油及瓊脂。濕潤劑包括(但不限於)卵磷脂及聚氧乙烯硬脂酸酯。懸浮劑包括(但不限於)羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素及海藻酸鈉。
錠劑可藉由壓縮或模製來製備。本發明之經口使用劑型亦包括咀嚼錠劑、硬明膠膠囊或軟明膠膠囊。用於經口投藥之液體製劑包括(但不限於)溶液、糖漿或懸浮液且可以使用前經水或另一適合媒劑復原之乾產品呈現。
本發明之貽貝水溶性萃取物之可有效預防、治療或管理與發炎相關之病況的量係隨疾病或病況之性質及嚴重程度及萃取物之投與途徑以及特定針對個體之因素(諸如其年齡、體重、性別及既往病史)而變化。
一般而言，與發炎相關之病況之急性治療中所用之劑型所包含的本發明貽貝水溶性萃取物之量係大於慢性病況之治療中所用之量。類似地，非經腸劑型所含之貽貝水溶性萃取物係少於口服劑型。熟習藥學技術者可輕易地瞭解特定劑型之調配。參考Remington's Pharmaceutical Sciences,Allen等人，第22版ISBN 978-0-85711-062-6。
熟習此項技術者可從源於活體外或動物模型測試之劑量反應曲線來預測有效量。一般而言，本發明之貽貝水溶性萃取物之有效量為每天約100mg至約3000mg，呈單一日劑量形式或在一整天中分次給藥。
現將參考以下實例以非限制性方式說明本發明之各種態樣。
2.實例 2.1材料及方法
Oxyless U源自Naturex(Avignon,France)。麥芽糊精(Maltrin 100或150)來自New Zealand Starch(Auckland,NZ)。Celite HyFlo及Celite 545來自Imerys Filtration Minerals Inc.(San Jose,California,USA)。伊茲德酶木瓜酶6000L、伊茲德酶FP及中性伊茲德酶來自Zymus(Auckland,NZ)。鹼性蛋白酶來自Novozymes(Bagsvaerd,Denmark)。
所有其他化學藥品及試劑均為標準實驗室供應品。
尺寸排阻HPLC設置
管柱：YarraTM 3μm SEC-2000(Phenomenex)。
樣品製備：
1.將經冷凍乾燥之萃取物樣品以10mg/mL之濃度溶解於100mM磷酸鈉緩衝液pH 6.8中。
2.以含4份樣品之磷酸鹽緩衝液與一份10% SDS之比率稀釋溶液，得到最終濃度2% SDS。
3.在50℃下加熱5分鐘。
4.在13 000rpm下離心5分鐘。
5.將上清液加載至小瓶中，在HPLC上操作。
肽之SE-HPLC之操作條件：
Figure 105109130-A0202-12-0019-1
2.2萃取貽貝，產生本發明之水溶性萃取物
根據以下提供之實例處理各種貽貝來源。方法及樣品代碼概述於下表1中。
Figure 105109130-A0202-12-0020-2
實例1：萃取青殼貽貝超臨界殘渣(GSM殘渣萃取物)PAR 15
將藉由超臨界CO2萃取經冷凍乾燥之青殼貽貝(160g)產生的殘渣懸浮於600ml水中。添加Oxyless U抗氧化劑(0.25g)。添加木瓜酶(5ml)且將混合物於震盪型水浴中加熱至55℃，持續1小時。隨後添加伊茲德酶FP(0.5g)且在55℃下於震盪型水浴中再繼續水解1小時。
將水解混合物在90℃下再加熱30分鐘，冷卻至55℃，隨後在10000rpm下離心30分鐘，隨後回收上清液(565ml)。用磷酸將上清液之pH調整至pH 4。添加活性碳(2g)。使用矽藻土(20g預塗層(Celite HyFlo)+20g主體進料(Celite 545))，經由Seitz 900過濾板過濾上清液。回收濾液(510ml)且將其與麥芽糊精(27.2g)及Oxyless U抗氧化劑(0.25g)混合，直至溶解。冷凍乾燥所得溶液，產生126.2g固體產物(GSM殘渣萃取物)。
GSM殘渣萃取物完全水溶，且味道令人愉悅。回收到起始超臨界CO2殘渣中所存在固體之60%。
該程序使用相同酶系統重複若干次(PAR 13、19及30)且用鹼性蛋 白酶替換伊茲德酶FP重複一次(PAR 12)。
如藉由SE-HPLC所分析，產物之分子量分佈示出在下表2中：
Figure 105109130-A0202-12-0021-5
實例2：萃取整個新鮮青殼貽貝(整個新鮮GSM之萃取物)PAR 37
將青殼貽貝之均質化肉(500g)懸浮於400ml水中。添加Oxyless U抗氧化劑(0.25g)。添加鹼性蛋白酶(2.5ml)及中性伊茲德酶(2.5ml)且將混合物於震盪型水浴中加熱至60℃，持續3小時。隨後添加伊茲德酶FP(0.125g)且在60℃下於震盪型水浴中再繼續水解1小時。
將水解混合物在95℃下再加熱40分鐘，冷卻至55℃，隨後在10000rpm下離心30分鐘，隨後回收上清液(795ml)。用磷酸將上清液之pH調整至pH 4。添加活性碳(2g)。使用矽藻土(20g預塗層+20g主體進料)，經由Seitz 900過濾板過濾上清液。回收濾液(750ml)且將其與麥芽糊精(27.2g)及Oxyless U抗氧化劑(0.25g)混合，直至溶解。冷凍乾燥所得溶液，產生固體產物(整個新鮮GSM之萃取物)。
整個新鮮GSM之萃取物完全水溶。回收到貝類原材料中所存在固體之56%。如藉由SE-HPLC所分析，產物之分子量分佈示出在下表3中：
Figure 105109130-A0202-12-0021-3
實例3：萃取GSM全粉(GSM全粉萃取物)PAR 36
將經冷凍乾燥的粉末狀青殼貽貝(160g)懸浮於600ml水中。添加Oxyless U抗氧化劑(0.25g)且將pH自6.0調整至8.0。添加鹼性蛋白酶(2.5ml)及中性伊茲德酶(2.5ml)且將混合物於震盪型水浴中加熱至60℃，持續3小時。隨後添加伊茲德酶FP(0.125g)且在60℃下於震盪型水浴中再繼續水解1小時。
將水解混合物在95℃下再加熱40分鐘，冷卻至55℃，隨後在10000rpm下離心30分鐘，隨後回收上清液(590ml)。用磷酸將上清液之pH調整至pH 4。添加活性碳(2g)。使用矽藻土(20g預塗層+20g主體進料)，經由Seitz 900過濾板過濾上清液。回收濾液(550ml)且將其與麥芽糊精(27.2g)及Oxyless U抗氧化劑(0.25g)混合，直至溶解。冷凍乾燥所得溶液，產生固體產物(GSM全粉萃取物)。
GSM全粉萃取物完全水溶。回收到起始貽貝材料中所存在固體之66%。
用木瓜酶替換鹼性蛋白酶及中性伊茲德酶重複該製程(PAR 36a)。
如藉由SE-HPLC所分析，產物之分子量分佈示出在下表4中：
Figure 105109130-A0202-12-0022-6
實例4：萃取整個新鮮藍貽貝(整個新鮮藍貽貝之萃取物)PAR 40
將藍貽貝之均質化肉(516g)懸浮於300ml水中。添加Oxyless U抗氧化劑(0.25g)。將pH自6.0調整至8.0，隨後添加鹼性蛋白酶(2.5ml)及中性伊茲德酶(2.5ml)且將混合物於震盪型水浴中加熱至60℃，持續3小時。隨後添加伊茲德酶FP(0.125g)且在60℃下於震盪型水浴中再繼續水解1小時。
將水解混合物在95℃下再加熱30分鐘，冷卻至55℃，隨後在10000rpm下離心30分鐘，隨後回收上清液(746ml)。用磷酸將上清液之pH調整至pH 4。添加活性碳(2g)。使用矽藻土(20g預塗層+20g主體進料)，經由Seitz 900過濾板過濾上清液。回收濾液(700ml)且將其與麥芽糊精(27.2g)及Oxyless U抗氧化劑(0.25g)混合，直至溶解。冷凍乾燥所得溶液，產生固體產物(整個新鮮藍貽貝之萃取物)。
整個新鮮藍貽貝之萃取物完全水溶。回收到貝類原材料中所存在固體之83%。如藉由SE-HPLC所分析，產物之分子量分佈示出在下表5中：
Figure 105109130-A0202-12-0023-7
實例5：萃取整個新鮮GSM，包括脫脂步驟(經脫脂之整個新鮮GSM之萃取物)PAR 41
將GSM之均質化肉(507g)懸浮於400ml水中。添加Oxyless U抗氧化劑(0.25g)。將pH自6.5調整至8.0，隨後添加鹼性蛋白酶(2.5ml)及中性伊茲德酶(2.5ml)且將混合物於震盪型水浴中加熱至60℃，持續3小時。隨後添加伊茲德酶FP(0.125g)且在60℃下於震盪型水浴中再繼續水解1小時。
隨後冷凍乾燥經水解之材料(890ml)且回收到100g粉末。用冷丙酮(3×250ml)沖洗粉末以移除脂質。在各沖洗之間經由紙張過濾回收粉末。在氮氣下乾燥最終脫脂粉末。
將脫脂粉末再懸浮於400ml水中，在95℃下加熱40分鐘且隨後冷卻至55℃。隨後在10000rpm下離心經水解之水性懸浮液30分鐘，隨後回收上清液(415ml)。用磷酸將上清液之pH調整至pH 4。添加活性 碳(2g)。使用矽藻土(20g預塗層+20g主體進料)，經由Seitz 900過濾板過濾上清液。回收濾液(375ml)且將其與麥芽糊精(27.2g)及Oxyless U抗氧化劑(0.25g)混合，直至溶解。冷凍乾燥所得溶液，產生固體產物(經脫脂之整個新鮮GSM之萃取物)。
經脫脂之整個新鮮GSM之萃取物完全水溶。回收到貝類原材料中所存在固體之55%。如藉由SE-HPLC所分析，產物之分子量分佈示出在下表6中：
Figure 105109130-A0202-12-0024-9
實例6：工廠規模萃取GSM超臨界殘渣(工廠GSM殘渣萃取物)PAR 43
向冷(19℃)水(500L)中添加Oxyless U抗氧化劑(80g)。相繼攪拌加入木瓜酶(200g)、由超臨界CO2萃取經冷凍乾燥之青殼貽貝產生的殘渣(50.0kg)。將混合物加熱至55℃且消化2小時。隨後添加伊茲德酶FP(160g)且在55℃下再繼續水解1.5小時。
將水解混合物在80-88℃下再加熱20分鐘，冷卻至60℃，隨後經由液-固分離器(liquid-sludge separator)(2×)離心，隨後回收上清液(450L)。用磷酸將上清液之pH調整至4。添加活性碳(200g)。使用矽藻土(6.0kg預塗層+6.0kg主體進料)，經由壓濾機過濾上清液。回收濾液(500L)且將其與麥芽糊精(7.0kg)及Oxyless U抗氧化劑(80g)混合，直至溶解。冷凍乾燥所得溶液，產生24.0kg固體，不包括添加劑(GSM殘渣萃取物)。
GSM殘渣萃取物完全水溶，具有令人愉悅的海鮮味。回收到起始超臨界CO2殘渣中所存在固體之50%。
如藉由SE-HPLC所分析，產物之分子量分佈示出在下表7中：
Figure 105109130-A0202-12-0025-10
實例7：萃取整個新鮮科帕科帕(整個新鮮科帕科帕萃取物)PAR 45
將均質化的科帕科帕肉(501g)懸浮於400ml水中。添加Oxyless U抗氧化劑(0.25g)。不調整pH(6)。添加木瓜酶(5ml)且將混合物於震盪型水浴中加熱至55℃，持續2小時。隨後添加伊茲德酶FP(0.5g)且在55℃下於震盪型水浴中再繼續水解1.5小時。
將水解混合物在95℃下再加熱30分鐘，冷卻至55℃，隨後在10000rpm下離心30分鐘，隨後回收上清液(720ml)。用磷酸將上清液之pH調整至4。添加活性碳(2g)。使用矽藻土(20g預塗層(Celite HyFlo)+20g主體進料(Celite 545))，經由Seitz 900過濾板過濾上清液。回收濾液(575ml)且將其與麥芽糊精及Oxyless U抗氧化劑混合。冷凍乾燥所得溶液，產生固體產物(整個新鮮科帕科帕之萃取物)。
整個新鮮科帕科帕之萃取物完全水溶。回收到科帕科帕原材料中所存在固體之55%。
如藉由SE-HPLC所分析，產物之分子量分佈示出在下表8中：
Figure 105109130-A0202-12-0025-11
實例8：萃取GSM殘渣粉末(中試規模)PAR 58
向150L冷水中添加Oxyless U(24g)。在連續攪拌下添加Papin(500ml)(Zymus伊茲德酶木瓜酶6000L)。添加GSM超臨界殘渣(15.0kg)且將懸浮液在50℃下加熱15小時。添加伊茲德酶FP(50g)且在55℃下再繼續水解2小時。
隨後將懸浮液在80℃下加熱20分鐘，隨後使其冷卻。
經由液-固分離器離心懸浮液，在該過程期間添加60g活性碳。再次回收上清液且用磷酸將其pH改為4。經由液-固分離器離心上清液。回收最終上清液(95L)。添加麥芽糊精(2.4kg)及Oxyless U(24g)且混合直至溶解。
隨後冷凍乾燥本發明之水溶性萃取物，產生水溶性固體產物。回收到貽貝殘渣中所存在固體之69%。味道令人愉悅(可口)。
使用相同酶系統(500ml木瓜酶，在50℃下消化21小時，隨後在55℃下45g伊茲德酶FP再水解2小時)重複該程序(PAR 63)。
回收到超臨界GSM殘渣中所存在固體之83%。產物為水溶性的且具有令人愉悅的可口的味道。
如藉由SE-HPLC所分析，產物之分子量分佈示出在表9中。
Figure 105109130-A0202-12-0026-12
比較PAR 58之近似組成與GSM殘渣起始材料之近似組成。將樣品在103℃下乾燥16小時，重量測定法。AOAC 945.15，第19版。藉由在馬弗爐(muffle furnace)中在600℃下燃燒6小時測定灰分，重量測定法。AOAC 942.05，第19版。使用杜馬斯燃燒(Dumas combustion)測定總氮。AOAC 992.15，第19版。基於總氮×6.25計算總蛋白質。AOAC 992.15，第19版。亦基於係數6.75(其較適合於高度水解之蛋白質，其中已遍及肽鍵添加大量水)給出總蛋白質之值。使用Bligh,E.G.及Dyer,W.J.(1959)「A rapid method of total lipid extraction and purification」,Can.J.Biochem.and Physiol.,37(8),911-917之方法測定脂質。
下表10顯示結果。
Figure 105109130-A0202-12-0027-13
該等值為每100g不含任何添加劑之經冷凍乾燥之材料中的公克數。
2.3本發明之水溶性萃取物之消炎性質 實例9：藉由本發明之水溶性萃取物抑制單核細胞性THP-1細胞中之經TLR4(LPS)刺激之IL-1β及TNFα分泌
IL-1β及TNFα為發炎反應之關鍵介體，其引發一連串調控人體對入侵微生物或創傷之天然防禦的事件。在正常條件下，此等促炎性細胞因子侷限於某一地方且壽命短。然而，在慢性發炎病況下，其表現延長，且在某些情況下，擴散至全身。此舉使促炎性反應持久化且成為免疫細胞之異常募集及活化的基礎。
因此，在慢性發炎病況中，限制IL-1β及TNFα表現及生物活性將抑制慢性發炎。此外，各種免疫細胞顯示可在慢性發炎期間表現IL-1β及TNFα。然而，其表現之觸發非常不同且其為對入侵微生物之異常免疫細胞信號傳導之結果。
作為天然防禦系統之一部分，人類已發展出複雜的細胞表面標記，包括稱為Toll樣受體(TLR)之群組，其識別外來物質且觸發恰當的細胞防禦過程。
利用活化單核細胞性免疫細胞中之TLR4的細菌配體來上調IL-1β及TNFα之表現，從而探索貽貝萃取物在慢性發炎病況中抑制此等促炎性細胞因子之表現方面的功效。
方法：在哺乳動物細胞培養條件下，將生長於含有10% FBS(胎牛血清)之RPMI(羅斯威爾公園紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute))培養基中之單核細胞性細胞株THP-1(2×106個細胞/毫升)與TLR4-脂多醣[LPS](0.5-50ng/mL)一起培育6小時。收集上清液且使用市售ELISA量測IL-1β及TNFα產量。使用最佳劑量之TLR4(最大生物活性之約70%)檢查貽貝萃取物對IL-1β及TNFα分泌之影響。使用已知免疫抑制劑地塞米松(0.001-10μM或0-3.925μg/mL)驗證此生物分析。
評定貽貝萃取物在慢性發炎情況下減弱IL-1β及TNFα之表現的有效性。首先用最佳劑量之TLR4刺激THP-1細胞30分鐘，引起IL-1β及TNFα表現上調。隨後添加貽貝萃取物(通常1-100μg/mL)且將其與該等細胞一起再培育6小時。隨後(藉由對細胞短暫離心)收集培養基且藉由ELISA量測IL-1β及TNFα分泌。按細胞因子pg/mL計算資料且資料呈現為經TLR4刺激之IL-1β或TNFα分泌之抑制百分比。
結果顯示於圖1至圖18中。所測試之所有本發明之水溶性萃取物均展現出消炎活性(圖1至圖14)。
圖15至圖18為對照實驗之結果，其中在上文所述之分析中測試未水解之貽貝材料。
圖15及圖16顯示GSM殘渣粉末及GSM全粉在抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之IL-1β方面的影響。
圖17及圖18顯示相同材料對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的影響。
下表10顯示各種GSM產品當以100μg/mL施用於分析中時對抑制 經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之IL-1β的影響。將經冷凍乾燥之產品再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或二甲亞碸(DMSO)中，隨後添加至分析中。
關於各管柱，結果按相對於賦值為1之可溶性萃取物之作用(最高抑制)表示。
Figure 105109130-A0202-12-0029-15
下表11顯示各種GSM產品當以100μg/mL施用於分析中時對抑制經TLR4(LPS)刺激之單核細胞性THP-1細胞中之TNFα的影響。將經冷凍乾燥之產品再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或二甲亞碸(DMSO)中，隨後添加至分析中。
關於各管柱，結果按相對於賦值為1之可溶性萃取物之作用(最高抑制)表示。
Figure 105109130-A0202-12-0029-14
2.4分析本發明之水溶性萃取物 實例10：本發明之GSM殘渣、全粉及水溶性萃取物之LC-MS分析方法
按比例取樣且藉助於渦旋將樣品混合於0.5%甲酸水溶液中以溶解極性組分，然而一些樣品仍然存在一些未溶解的固體，如下表12中 所示。
Figure 105109130-A0202-12-0030-16
LC-MS系統由以下組成：Thermo Electron Corporation(San Jose,CA,USA)Finnigan Surveyor MS泵、Thermo Accela Open自動進樣器(PAL HTC-xt與DLW)、Finnigan Surveyor PDA plus偵測器及ThermaSphere TS-130管柱加熱器(Phenomenex,Torrance,CA,USA)。
藉由水性正相層析(CogentTM Diamond-HydrideTM，4μm，100Å，150×2.1mm，MicroSolvTM Technologies Corporation,USA)，維持在30℃下，流動速率為200μl/min，用由0.1%甲酸/水(A)及0.1%甲酸/乙腈(B)組成之移動相分離所製備之各萃取物之2μL等分試樣。施加梯度：0-2min，5% A；30-39.5min，90% A；40-45min，5% A。
藉由API-MS(LTQ，2D線性離子阱，Thermo-Finnigan,San Jose,CA,USA)與電噴霧電離(ESI)-MS，以陰離子模式及陽離子模式，針對在m/z 100-2000amu範圍內之前體質量，獲取產物離子之資料。結果顯示於圖19至圖24中。本發明之水溶性萃取物之LC-MS層析圖(圖19及圖22)指示較複雜的組成，其中峰比起始貽貝材料之LC-MS層析圖(圖20、21、23及24)中所見多得多。
實例11：GSM水溶性萃取物之固相微萃取-GC-MS分析
藉由SPME-GC-MS，使用Tuckey、Day及Miller之方法(Tuckey,N.P.L.、Day,J.R.及Miller,M.R.(2013).Determination of volatile compounds in New Zealand GreenshellTM mussels(Perna canaliculus) during chilled storage using solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry.Food Chemistry,136(1),218-223)，經過適當修改，分析貽貝萃取物PAR 58及PAR 63中之揮發性有機化合物。將經冷凍乾燥之萃取物樣品(1.20g)置放於安裝有自密封隔片之20mL玻璃瓶中。給兩個小瓶準備各萃取物且一式兩份地分析各小瓶。將小瓶在40℃下在攪拌下培育4分鐘，隨後使用85μm carboxen經聚(二甲基矽氧烷)塗佈之SPME纖維(Supelco,Bellefonte,PA,USA)吸附揮發物20分鐘。在各分析操作之前及在各分析操作之間操作空白纖維樣品以確保乾淨的基線。藉由GC-MS分析所吸附之揮發物。GC-MS系統由與GCMS-QP2010質譜分析單元(Shimadzu,Kyoto,Japan)耦合且配備有AOC-5000自動注射器(PAL,CTC Analytics,Zwingen,Switzerland)之GC-2010氣相層析組成。GC-MS分析條件如下：注射溫度250℃；不分流模式；在注射器中解吸附2min；Rtx-5Sil MS毛細管柱-30m×0.25mm ID×0.25μm膜厚度(Restek,Bellefonte,PA,USA)；烘箱溫度程式：開始時50℃，保持1min，以10℃/min增加至160℃，以40℃/min增加至250℃，在250℃下保持1min；運載氣體He，流動速率1.90mL/min；MS偵測器溫度260℃。藉由與質譜資料庫(Wiley 7.0文庫，Wiley,New York,NY,USA)比較來鑑別峰。結果顯示於下表13及表14中。
Figure 105109130-A0202-12-0031-17
Figure 105109130-A0202-12-0032-18
Figure 105109130-A0202-12-0032-19
產業可利用性
本發明之貽貝水溶性萃取物及包含其之組合物可添加至食品或膳食增補劑中以增加其健康益處。其水溶解度及令人愉悅之味道允許其直接併入各種可食用產品中。產品可能呈以下形式：錠劑、膠囊、飲料保健『飲品(shot)』、預混補湯(premix soup tonic)及作為功能性食品之組分，例如可口的保健食品棒。
其亦可用作醫藥製劑來幫助預防、治療或管理與發炎相關的病況。

Claims (26)

  1. 一種貽貝水溶性萃取物，其包含肽，其中該肽包含2至5KDa之肽、1至2KDa之肽及小於1KDa之肽，且其中超過90重量%之肽小於5KDa。
  2. 如請求項1之貽貝水溶性萃取物，其包含以固體計至少約45重量%之肽，其中術語「約」係指比由該術語修飾之值高或低不超過10%的值。
  3. 如請求項1之貽貝水溶性萃取物，其包含以固體計約45重量%至約65重量%之肽，其中術語「約」係指比由該術語修飾之值高或低不超過10%的值。
  4. 如請求項1至3中任一項之貽貝水溶性萃取物，其中超過95重量%之肽小於5KDa。
  5. 如請求項1至3中任一項之貽貝水溶性萃取物，其包含以固體計不超過約5重量%之脂質，其中術語「約」係指比由該術語修飾之值高或低不超過10%的值。
  6. 如請求項1至3中任一項之貽貝水溶性萃取物，其中該貽貝係選自包含以下之群：青殼貽貝(greenshell mussel；GSM)、藍貽貝(blue mussel)及羅紋貽貝(ribbed mussel)。
  7. 如請求項1至3中任一項之貽貝水溶性萃取物，其進一步包含碳水化合物及脂質。
  8. 如請求項1至3中任一項之貽貝水溶性萃取物，其中該肽之一部分大於5KDa。
  9. 一種產生如請求項1至8中任一項之貽貝水溶性萃取物之方法，該方法包含以下步驟：(a)使用一或多種蛋白水解酶使貽貝材料之水性懸浮液水解； (b)使該水解混合物中之該等酶變性，及(c)自該水解混合物中移除不可溶材料，得到貽貝水溶性萃取物。
  10. 如請求項9之方法，其中該等蛋白水解酶之最適pH為弱酸性至約中性。
  11. 如請求項9之方法，其中該等蛋白水解酶係選自包含以下之群：木瓜酶(papain)、鹼性蛋白酶(Alcalase)、伊茲德酶FP(Enzidase FP)及中性伊茲德酶(Enzidase Neutral)。
  12. 如請求項9至11中任一項之方法，其中該貽貝材料係選自包含以下之群：整個新鮮貽貝、貽貝粉末及貽貝超臨界殘渣。
  13. 如請求項9至11中任一項之方法，其中該貽貝係選自包含以下之群：青殼貽貝、藍貽貝及羅紋貽貝。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之貽貝水溶性萃取物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
  15. 一種類藥劑營養品組合物，其包含如請求項1至8中任一項之貽貝水溶性萃取物及一或多種可食用賦形劑。
  16. 如請求項15之類藥劑營養品組合物，其為食品組合物、食品添加劑組合物、膳食增補劑或醫療食品。
  17. 一種如請求項1至8中任一項之貽貝水溶性萃取物之用途，其係用於製備用於減輕發炎的藥物。
  18. 一種如請求項1至8中任一項之貽貝水溶性萃取物之用途，其係用於製備用於預防、治療或處理與發炎相關之病況的藥物。
  19. 如請求項18之用途，其中該與發炎相關之病況係選自包含以下之群：哮喘；腦炎；發炎性腸道疾病；慢性阻塞性肺病(COPD)；過敏性病症；纖維化；關節炎；牛皮癬；多肌痛；肌腱炎；滑囊炎；喉炎；齒齦炎；胃炎；耳炎；乳糜瀉；動脈粥 樣硬化；心臟病；肥胖症；糖尿病；癌症及阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。
  20. 如請求項19之用途，其中該發炎性腸道疾病係選自由克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎所組成之群，或其中該關節炎係選自由幼年型關節炎、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎及骨關節炎所組成之群。
  21. 如請求項18之用途，其中該與發炎相關之病況係憩室炎。
  22. 如請求項1至3中任一項之貽貝水溶性萃取物，其係用於減輕發炎。
  23. 如請求項1至3中任一項之貽貝水溶性萃取物，其係用於預防、治療或處理與發炎相關之病況。
  24. 如請求項23之貽貝水溶性萃取物，其中該與發炎相關之病況係選自包含以下之群：哮喘；腦炎；發炎性腸道疾病；慢性阻塞性肺病(COPD)；過敏性病症；纖維化；關節炎；牛皮癬；多肌痛；肌腱炎；滑囊炎；喉炎；齒齦炎；胃炎；耳炎；乳糜瀉；動脈粥樣硬化；心臟病；肥胖症；糖尿病；癌症及阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。
  25. 如請求項24之貽貝水溶性萃取物，其中該發炎性腸道疾病係選自由克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎所組成之群，或其中該關節炎係選自由幼年型關節炎、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎及骨關節炎所組成之群。
  26. 如請求項23之貽貝水溶性萃取物，其中該與發炎相關之病況係憩室炎。
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