CN103710414A

CN103710414A - 贻贝寡肽的制备方法及其应用

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Publication number: CN103710414A
Application number: CN201310343042.0A
Authority: CN
Inventors: 董英; 周越
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2013-08-07
Filing date: 2013-08-07
Publication date: 2014-04-09

Abstract

本发明公开了贻贝寡肽的制备方法及其应用，属于海洋生物技术应用领域。以紫贻贝为原料，采用碱性冷提法从贻贝冻干粉中获得贻贝蛋白；通过复合酶解蛋白得到混合多肽，超滤获得寡肽，采用衰老小鼠模型进行一系列抗衰老动物实验及行为学实验，并通过果蝇生存实验，证明该贻贝寡肽具有延缓衰老的活性，为实现贻贝的科学化、高值化利用开创了新途径。与现有技术相比，本发明的优点在于：提取制备了贻贝蛋白，采用最佳的蛋白酶和优选的工艺对贻贝蛋白进行酶解纯化，避免了高温对贻贝蛋白分子结构的分解，并使贻贝多肽在分子量水平上得到分级，从而使所得的贻贝寡肽延缓衰老的效果更纯更好。

Description

贻贝寡肽的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及制备一种具有延缓衰老活性的贻贝寡肽，可作为抗衰老食品、功能性食品或药品，属于海洋生物技术应用领域。

背景技术

贻贝，俗称“海红”，其干制品名为“淡菜”，是我国大量人工养殖的贝类。贻贝富含蛋白质，素有“海中鸡蛋”的美称，粗蛋白含量高于其他海产双壳类软体动物，且氨基酸种类较齐全。已有技术利用碱提贻贝蛋白（专利号：201010513556.2），超声波-微波辅助加酶单一酶解制备贻贝酶解液，然后用二氧化氯溶液稀释，超微膜过滤纯化截留分子量为50000道尔顿多肽（专利号：201110127662.1），减法提取蛋白酶解并通过超滤富集活性肽具有抗氧化（专利号：201010234963.X）、抗癌（专利号：201010610946.1及201010296130.6）、降血压(专利号：201010284271.6及201010612353.9)及增强免疫（专利号：201110246647.9）功能，但至今尚未见有关贻贝多肽抗衰老活性的报道。

发明内容

本发明以紫贻贝为原料，采用碱性冷提法从贻贝冻干粉中获得贻贝蛋白；通过复合酶解蛋白得到混合多肽，超滤获得寡肽，采用衰老小鼠模型进行一系列抗衰老动物实验及行为学实验，并通过果蝇生存实验，证明该贻贝寡肽具有延缓衰老的活性，为实现贻贝的科学化、高值化利用开创了新途径。与现有技术相比,本发明的优点在于：提取制备了贻贝蛋白，采用最佳的蛋白酶和优选的工艺对贻贝蛋白进行酶解纯化，避免了高温对贻贝蛋白分子结构的分解，并使贻贝多肽在分子量水平上得到分级，从而使所得的贻贝寡肽延缓衰老的效果更纯更好。

本发明通过以下技术手段实现。贻贝寡肽的制备方法，按照下述步骤进行：

（1）制备贻贝冻干粉：

取紫贻贝的新鲜贻贝肉，连同汁液迅速冷冻干燥粉碎后得到贻贝粉；

（2）制备贻贝蛋白：

将适量的贻贝粉，用0.2mol/L的NaOH溶液配成质量分数为1%的悬浮液，并用2mol/L的NaOH溶液调节pH值梯度为10-12，搅拌浸提60min（4℃）；将浸提液于8000r/min条件下低温离心20min（4℃），收集上清液；将上述上清液，用2mol/L HCl调pH值为5-6，沉淀5-10分钟，8000r/min，，4℃离心20min；分别收集上清夜和沉淀，沉淀冷冻干燥为贻贝蛋白粉；

（3）制备贻贝寡肽：

以贻贝蛋白粉于水中配成质量分数为2%的悬浮液，置于反应器中52.5℃水浴浸泡30分钟后，加入中性蛋白酶与复合风味酶组合同时水解；加入蛋白酶量各为4000U/g底物蛋白，为pH6.0-7.0条件下，52.5℃水解2小时，煮沸10min灭酶。酶解液离心，取上清液分别采用10kDa、5kDa、3kDa、1kDa的超滤膜超滤；取小于1kDa滤液冷冻干燥，获得贻贝寡肽。

中性蛋白酶与复合风味酶的质量比为1:2.5。

贻贝寡肽的应用，可以用于制备抗氧化活性和延缓衰老作用的食品。

本发明的有益效果：相比较已有的酶解产物或其他活性多肽，本发明提供的贻贝寡肽具有更强的抗氧化活性和更显著的延缓衰老作用，可用于制备抗衰老、提高认知能力的食品、功能性食品或药品。

本发明原料来源丰富、制备简便、功效显著，为贻贝多肽的应用开辟一个新的领域，有利于促进海洋生物的开发利用。

附图说明

图1：本发明的工艺流程图,

图2：贻贝寡肽组、对照组和加速衰老组小鼠一般状态图,

图3：水迷宫空间探索实验中各组小鼠在平台象限停留的时间,

图4：水迷宫空间探索实验中各组小鼠穿过平台的次数,

图5：旋转棒实验中各组小鼠在棒上的平衡时间。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步阐述：

本发明中延缓衰老评价方法如下：

以果蝇的生存试验评价贻贝寡肽可以延长平均寿命、最高寿命及提高性活力；并采用中年早衰小鼠模型，测定贻贝寡肽对小鼠脑、肝、肾组织抗氧化能力；通过测定小鼠行为、学习记忆能力以及脑衰老病变，测定贻贝寡肽对衰老小鼠认知能力的改善作用，从而全面评价贻贝寡肽具有延缓衰老的作用。图1为本发明的工艺流程图。

实施例1：制备贻贝寡肽

手工剥取紫贻贝的新鲜贻贝肉，连同汁液迅速冷冻干燥。将适量的贻贝冻干粉100g，用0.2mol/L的NaOH溶液配成质量分数为1%的悬浮液，并用2mol/L的NaOH溶液调节pH值梯度为12，低温搅拌浸提60min（4℃，一直保持在低温下操作）。将浸提液于8000r/min条件下离心20min(4℃)。收集上清。将上述制备的上清液，用2N HCl调pH值为5.3，沉淀10分钟，离心（8000r/min，20min，4℃）。离心后分别收集沉淀。得到的沉淀冷冻干燥为贻贝蛋白粉。准确称取贻贝冻干蛋白粉25克，加水配成蛋白质量分数为2%的悬浮液，放入反应器中，55℃水浴浸泡30分钟，按照酶与蛋白质量比为8000U/g的量加入中性蛋白酶1.2克，用磷酸缓冲液调节溶液pH至7.0；置于恒温水浴锅中55℃条件下酶解2小时，酶解物加热煮沸10分钟灭酶，6000r/min离心15分钟，上清液用截留分子量10kDa、5kDa、3kDa、1kDa的超滤膜超滤；取小于1kDa滤液冷冻干燥，获得贻贝寡肽。

本发明中使用的蛋白酶，中性蛋白酶（酶活力为16.0万U/g）、复合风味酶（酶活力为6.9万U/g）由无锡杰能科酶制剂有限公司提供。

实施例2：制备贻贝寡肽

手工剥取紫贻贝的新鲜贻贝肉，连同汁液迅速冷冻干燥。将适量的贻贝冻干粉100g，用0.2mol/L的NaOH溶液配成质量分数为1%的悬浮液，并用2mol/L的NaOH调节pH值梯度为12，低温搅拌浸提60min（4℃，一直保持在低温下操作）。将浸提液于8000r/min条件下离心20min(4℃)。收集上清。将上述制备的上清液，用2N HCl调pH值为5.3，沉淀10分钟，离心（8000r/min，20min，4℃）。离心后分别收集沉淀。得到的沉淀冷冻干燥为贻贝蛋白粉。准确称取干燥的贻贝蛋白粉25g，加水配成蛋白质量分数为2%的悬浮液，放入反应器中，50℃水浴浸泡30分钟，按照酶与蛋白质量比为8000U/g的量加入复合风味酶3g，用磷酸缓冲液调节溶液pH至6.0；置于恒温水浴锅中50℃下酶解2小时，酶解物加热煮沸10分钟灭酶，6000r/min离心15分钟，上清液用截留分子量10kDa、5kDa、3kDa、1kDa的超滤膜超滤；取小于1kDa滤液冷冻干燥，获得贻贝寡肽。

实施例3：制备贻贝寡肽

手工剥取紫贻贝的新鲜贻贝肉，连同汁液迅速冷冻干燥。将适量的贻贝冻干粉100g，用0.2mol/L的NaOH溶液配成质量分数为1%的悬浮液，并用2mol/L的NaOH调节pH值梯度为12，低温搅拌浸提60min（4℃，一直保持在低温下操作）。将浸提液于8000r/min条件下离心20min(4℃)。收集上清。将上述制备的上清液，用2N HCl调pH值为5.3，沉淀10分钟，离心（8000r/min，20min，4℃）。离心后分别收集沉淀。得到的沉淀冷冻干燥为贻贝蛋白粉。准确称取干燥的贻贝蛋白粉25g，加水配成蛋白质量分数为2%的悬浮液，放入反应器中，52.5℃水浴浸泡30分钟，按照酶与底物蛋白质量比为4000U/g的量加入中性蛋白酶0.6g和复合风味酶1.5g，用磷酸缓冲液调节溶液pH至6.0；置于恒温水浴锅中52.5℃下酶解2小时，酶解物加热煮沸10分钟灭酶，6000r/min离心15分钟，上清液用截留分子量10kDa、5kDa、3kDa、1kDa的超滤膜超滤；取小于1kDa滤液冷冻干燥，获得贻贝寡肽。

动物抗衰老活性试验举例（以测定实施例3中制备的材料为例）。

试验1贻贝寡肽对果蝇寿命的影响

(1)选取10h内孵出的未交配的雌、雄野生黑腹果蝇，用乙醚麻醉，然后按性别随机分为对照组、添加贻贝寡肽高剂量组（3mg/mL）及添加贻贝寡肽低剂量组（0.3mg/mL），每组雌雄各100只，置于温度（25±1）℃，湿度55-65%的12小时光照交替的培养箱中进行培养。每管放2ml培养基，用双层纱布封口。

(2)前两周均使用基础培养基，除对照组外，14天后各组开始使用添加贻贝寡肽的培养基。

(3)每天上午10:00（或定时）观察并统计果蝇死亡数，4天更换一次培养基，观察至果蝇全部死亡为止。实验过程中剔除非正常原因死亡和操作过程中不慎飞走的果蝇数。

(4)最后统计各组果蝇平均寿命和最大寿命。平均寿命以每组全部果蝇的存活时间计算，每组最后死亡的20只果蝇存活天数的平均数为该组最大寿命的实验结果。

结果见表1，高剂量的贻贝寡肽显著提高（P<0.05）雌雄果蝇的平均寿命和最高寿命10-21天。

表1贻贝寡肽对雌雄果蝇寿命的影响(x±s)

*示与对照组比较有差异显著性（P<0.05）。

试验2贻贝寡肽对D-半乳糖致衰老小鼠的影响

建立D-半乳糖（200mg/kg.d）致ICR小鼠衰老模型，另有两组小鼠在注射D-半乳糖的同时每天分别灌胃不同剂量的贻贝寡肽（高剂量组600mg/kg，低剂量组100mg/kg），连续饲养8周，每天观察小鼠活动、反应及毛色情况，8周后制备10%肝、脑、肾匀浆，进行组织内MDA含量、SOD、GSH活性测定。

动物一般情况观察结果见图2：衰老模型组小鼠在腹腔注射D-半乳糖2个月后，即表现为行动缓慢，反应迟钝，毛发干枯发黄、缺乏光泽，嗜睡，尤其是腹部毛发逐渐变得无光泽、稀疏并渐有脱毛现象，皮肤松驰，弹性下降。嘴角胡须明显脱落，眼睛异常，此异常症状并逐日加重。而添加贻贝寡肽组小鼠行动变得灵活、饮食增进、毛发润泽，且高剂量贻贝多肽饲喂组小鼠状态明显好对照组小鼠。

贻贝寡肽对衰老小鼠抗氧化系统的影响结果见表2：与正常对照小鼠相比，衰老模型组小鼠肝、脑、肾组织中SOD活力显著降低，MDA的含量明显升高，GSH含量明显降低（P<0.05）；而添加贻贝寡肽高剂量组物能显著提高小鼠肝、脑、肾组织SOD活性及GSH含量，降低MDA含量（P<0.05）。

表2各组小鼠SOD、MDA、GSH测定值

试验3贻贝寡肽对衰老小鼠认知能力的改善作用

建立D-半乳糖（200mg/kg.d）致ICR小鼠衰老模型，另有两组小鼠在注射D-半乳糖的同时，每天分别灌胃不同剂量的贻贝寡肽（高剂量组100g/L，低剂量组20g/L），连续饲养7周，7周后进行水迷宫、避暗穿梭以及旋转平衡棒等行为学实验。

结果表明，衰老模型小鼠空间定位记忆能力严重损害，对水迷宫平台位置不能产生记忆，故盲目寻找逃生途径，在目标象限停留时间较短；而贻贝寡肽能明显增加小鼠过台次数和目标象限停留时间((P<0.05)，说明贻贝寡肽组能明显改善衰老模型小鼠空间记忆能力的损伤（见图3、图4）。

避暗试验进一步表明，老年模型组小鼠的记忆能力已经受损，而添加贻贝高剂量的寡肽组小鼠能明显地缩短巩固记忆的时间，减少错误的穿梭次数（p<0.01），改善和提高记忆能力（见图5）。

旋转棒实验结果表明：模型组小鼠的停留时间明显低于对照组（p<0.05），说明模型组的小鼠协调运动能力明显受损；而贻贝寡肽高剂量组小鼠停留时间远远高于老年模型组（p<0.01）；说明贻贝寡肽能够明显改善D-半乳糖引致小鼠的协调失衡能力（见图5）。

经过上述试验证明，根据本发明提供的方法得到的贻贝寡肽，能延长寿命，增加抗氧化活性，改善学习记忆及平衡能力，具有显著的延缓衰老功效，可以用于制备相应的产品，应用于食品、功能性食品或药品。

Claims

1.贻贝寡肽的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）制备贻贝冻干粉：

（2）制备贻贝蛋白：

将适量的贻贝粉，用0.2mol/L的NaOH溶液配成质量分数为1%的悬浮液，并用2mol/L的NaOH溶液调节pH值梯度为10-12，4℃搅拌浸提60min；将浸提液于8000 r/min条件下4℃离心20min，收集上清液；将上述上清液，用2mol/L HCl调pH值为5-6，沉淀5-10分钟，8000 r/min，，4℃离心20min；分别收集上清夜和沉淀，沉淀冷冻干燥为贻贝蛋白粉；

（3）制备贻贝寡肽：

以贻贝蛋白粉于水中配成质量分数为2%的悬浮液，置于反应器中52.5 ℃水浴浸泡30分钟后，加入中性蛋白酶与复合风味酶组合同时水解；加入蛋白酶量各为4000U/g底物蛋白，为pH 6.0-7.0条件下， 52.5℃水解2小时，煮沸10min灭酶；酶解液离心，取上清液分别采用10kDa、5kDa、3kDa、1kDa的超滤膜超滤；取小于1kDa滤液冷冻干燥，获得贻贝寡肽。

2.根据权利要求1所述的贻贝寡肽的制备方法，其特征在于中性蛋白酶与复合风味酶的质量比为1:2.5。

3.贻贝寡肽的应用，用于制备抗氧化活性和延缓衰老作用的食品。