CN104928339A - 一种具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，含以下步骤：在燕麦粉中加水配制乳液，将乳液调节酸碱度后分离出上层蛋白粗液；经过糖酶酶解除去淀粉杂质后、调节酸碱度，离心分离得到蛋白质沉淀；将蛋白质沉淀复溶配制成蛋白质溶液后，再经过复配蛋白酶酶解后得到酶解液，酶解液经浓缩、干燥即得到目标产品燕麦蛋白肽粉。所提取的燕麦蛋白肽具抑制肠道炎症活性的功效，可作为功能性食品配料添加于各类食品中。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法。
背景技术
燕麦Oats(Avena sativa)，就是中国的莜麦，俗称油麦、玉麦，是一种低糖、高营养、高能食品。其招牌营养素不但含量高，而且质量优，是较受现代人欢迎的食物之一。
燕麦一般分为带稃型和裸粒型两大类。世界各国栽培的燕麦以带稃型的为主，常称为皮燕麦。中国栽培的燕麦以裸粒型的为主，常称裸燕麦。据中国医学科学院卫生研究所综合分析，中国裸燕麦含粗蛋白质达15.6％，脂肪8.5％，还有淀粉释放热量以及磷、铁、钙等元素，与其它8种粮食相比，均名列前茅。燕麦中水溶性膳食纤维分别是小麦和玉米的4.7倍和7.7倍。燕麦中蛋白质的氨基酸组成比较全面，人体必需的8种氨基酸的含量均居首位，尤其是含赖氨酸高达0.68克。
目前针对燕麦有效成分的提取多集中在对各个组分的分离。如Collins etalU.S.Pat.No.5169660采用一定浓度的乙醇水溶液从燕麦中提取活性成分，并对提取残渣采用离子交换色谱处理回收残渣中的活性成分。该方法由于没有进行pH调节导致总体提取率低下。
Redmod etal U.S.Pat.No.7887823B2采用有机溶剂提取后，经过离心沉降后，对上层提取液进行调节pH，加入乙醇溶液后采用超滤膜过滤的方法分步提取燕麦中的有效成分，经过该处理后的提取物稳定性强，大大拓广了提取物的使用范围。
Targan U.S.Pat.No.5468491采用酶法对燕麦进行水解，再通过过滤、浓缩等处理得到含糖80％的产物，该产物可作为甜味剂和结构改良剂、调味剂。
如CN101649003A中采用有机溶剂萃取提取油脂之后，再根据等电点沉淀法对蛋白质和多糖类物质进行分离。该方法由于使用有机溶剂，容易导致蛋白质变性，降低蛋白质的回收率。
如CN1974602A则采用稀碱再辅以酶法对蛋白质和淀粉成分进行分离和纯化，该方法虽然能够避免蛋白质变性，但是该法直接提取出的为蛋白质。
关于燕麦功能性产品，据国外文献报告，燕麦产品广泛使用在日化和药物、食品等领域。Paton(1995)Cosmetics and Toiletries 110：63阐述了采用有机溶剂提取后活性炭澄清等工艺制备可以使用于化妆品中的产品。但该产品稳定性不足，限制其使用范围。
Roger etal U.S.Pat.No.5026548公开了一种可广泛作为食品添加剂用途的产品的制备方法，该产品可以作为泡沫稳定剂、乳化剂、表面活性剂添加到食品中。主要步骤涉及采用乙醇或者丙醇从燕麦中提取后，再用甲醇从上述提取物中进一步萃取、蒸干有机溶剂后可得到目标产品。
关于蛋白肽的制备，CN101709321A采用酶法提取后用树脂分离的方法制备具ACE活性的燕麦蛋白肽。CN101805774A采用超滤膜-酶法耦合的方法同时制备燕麦葡聚糖和燕麦多肽。采用该法虽然能够有效分离出燕麦葡聚糖，但是纯度较低，另外所使用膜的膜效也会影响分离效果。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，该方法不使用有机溶剂，稳定性好，燕麦蛋白肽的回收率和纯度高，工艺简便易于大规模生产。
本发明的第二个目的在于提供一种利用上述方法制成的燕麦蛋白肽，该燕麦蛋白肽具有抑制肠道炎症和提高细胞免疫活性的功效。
本发明的最后一个目的在于提供上述燕麦蛋白肽在制备具有抑制肠道炎症反应的食品添加剂中应用。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案来是实现的：一种具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，含有以下步骤：
(1)蛋白质提取：取燕麦粉，加水配成乳液，调整好乳液的pH值和温度进行提取后离心，所得上清液即为燕麦粗蛋白溶液；
(2)蛋白质纯化：在燕麦粗蛋白溶液中加入糖酶进行酶解，酶解完成后调整pH值并静置，离心沉降，所得沉淀即为燕麦蛋白；
(3)复溶：在燕麦蛋白中加入水，并调节pH值，得燕麦蛋白溶液；
(4)酶解：在燕麦蛋白溶液中加入细菌源蛋白酶和动物源蛋白酶的复合酶进行酶解，得到酶解液；
(5)干燥：将酶解液灭酶、浓缩和干燥后，所得产物即为燕麦蛋白肽。
本发明燕麦蛋白肽的制备方法中，首先将燕麦粉配制成乳液后、经离心分离出上层蛋白粗液；经过糖酶酶解除去淀粉杂质后、重新离心分离得到蛋白质沉淀；将蛋白质沉淀再经过复溶配制成蛋白质溶液后；再经过复配蛋白酶酶解后得到酶解液，将酶解液经含浓缩、干燥即得到目标产品燕麦蛋白肽。
在上述具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法中：
步骤(1)中水的用量优选为燕麦粉总质量的1～15倍；乳液的pH值优选为8～11，温度优选为30～60℃，提取时间优选为120～150min；离心时离心机转速优选为3000～10000rpm，离心机温度优选为1.5～5℃，离心时间优选为10～30min。
步骤(1)中pH值和温度的选择视糖酶的作用条件而定。
步骤(1)中采用水提取，不容易造成蛋白质变形凝集沉淀，降低后续成品得率；另外采用水提取可以减少有机溶剂的使用，减少溶剂排放。
进一步的，步骤(1)所述的乳液pH调节可以采用质量百分含量大约为1％的氢氧化钠、碳酸氢钠或者氢氧化钾进行调节。
步骤(2)中所述的糖酶优选为中温淀粉酶、耐热淀粉酶和糖化酶中的一种或几种，糖酶与燕麦粗蛋白溶液的用量关系优选为0.5～5μL/L，酶解温度优选为55～95℃，酶解时间优选为0.5～5h。
步骤(2)中采用糖酶酶解可以对淀粉进行降解，以达到去除杂质，提高蛋白肽纯度的效果。
步骤(2)中pH值优选为2～5，离心时离心机转速优选为3000～10000rpm，离心机温度优选为1.5～5℃，离心时间优选为10～30min。
步骤(2)中调整pH为2～5是蛋白肽的等电点，可以保证蛋白肽尽可能多的沉淀。
步骤(3)中水的用量优选为燕麦蛋白总质量的1～5倍，pH值优选为5.5～7.5。
步骤(3)中对蛋白质进行复溶是为了保证得到水化面积最大的燕麦蛋白底物，调整pH可以增加复合蛋白酶的酶解效果。
步骤(4)中所述的细菌源蛋白酶优选为alcalase或枯草杆菌蛋白酶；所述的动物源蛋白酶优选为胰蛋白酶、胃蛋白酶或胰酶，所述细菌源蛋白酶和动物源蛋白酶的复合酶的用量优选占燕麦眼白溶液总质量的0.5～1.5‰，酶解温度优选为40～65℃，pH值优选为3.5～8，酶解时间优选为3～15h。
选择不同来源的蛋白酶可以增加酶切位点，提高酶的酶解效率。
步骤(5)中浓缩采用真空浓缩，真空浓缩至固形物含量优选为20～60％，干燥优选采用喷雾干燥，喷雾干燥进料口温度优选为170～200℃，出料口温度优选为70～100℃。
根据GB/T 22492-2008中肽含量测试方法进行测试，结果表明步骤(5)中所得产物中燕麦蛋白肽的质量百分含量在50％以上。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：采用上述具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法制成的燕麦蛋白肽。
本发明的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述燕麦蛋白肽在制备具有抑制肠道炎症反应的食品添加剂中应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明方法中将蛋白质直接降解为蛋白肽，提高了蛋白质的溶解性；
(2)本发明燕麦蛋白的提取率高，本发明针对燕麦蛋白特性，根据不同蛋白酶酶切位点不同，在对燕麦蛋白酶解过程中使用了两种不同来源的蛋白酶进行复配，提高了燕麦蛋白的利用率和蛋白酶的酶解效率；
(3)本发明制备方法设备要求简单，方便实现大规模生产，整个过程没有使用有机溶剂，可以减少环境负荷；
(4)本发明以燕麦蛋白为原料，以制备抑制肠道炎症功能的蛋白肽为目的，有效拓展了燕麦蛋白新的使用范围。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的燕麦蛋白肽的分子量分布图谱。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
第一部分具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法
实施例1
取500克(粗蛋白含量28％)燕麦粉，按照1：10的质量比加入去离子水，调整pH至10，温度60℃，提取120min后，将提取液转移至冷冻离心机中，调整转速至7500rpm，温度为5℃，离心20min后，收集上清液，得到4.75L清液；调整温度至95℃，加入耐热α-淀粉酶4.75μL，保持搅拌恒温酶解120min，调整pH至4.3静置30min后转移至离心机中，调整转速至调整转速至7500rpm，温度为5℃，离心20min后，收集得到沉淀约397克；加入1.2L去离子水，调整pH至7.0充分搅拌30min后，调整温度至60℃，加入0.25‰的胰酶+0.25‰Alcalase酶，酶解5h后，将温度升高至105℃灭酶后，转移至旋转蒸发仪浓缩至固形物含量至30％，喷干得到118克肽粉，喷雾干燥进料口温度为170℃，出料口温度为70℃；干燥后所得产物中燕麦蛋白肽的质量百分含量为55％(根据GB/T22492-2008中肽含量测试方法进行测试)。
实施例2
取1000克(粗蛋白含量28％)燕麦粉，按照1：15加入去离子水，调整pH至9.5，温度45℃，提取130min后，将提取液转移至冷冻离心机中，调整转速至3500rpm，温度为4℃，离心30min后，收集上清液，得到13.5L清液；调整温度至75℃，加入中温淀粉酶6.75μL，保持搅拌恒温酶解180min，调整pH至2.5静至30min后转移至离心机中，调整转速至调整转速至3500rpm，温度为4℃，离心30min后，收集得到沉淀约810克；加入2.5L去离子水，调整pH至5.5充分搅拌30min后，调整温度至45℃，加入0.5‰的枯草杆菌蛋白酶+0.5‰胃蛋白酶，酶解15h后，将温度升高至105℃灭酶后，转移至旋转蒸发仪浓缩至固形物含量至40％，喷干得到240克肽，喷雾干燥进料口温度为180℃，出料口温度为80℃；干燥后所得产物中燕麦蛋白肽的质量百分含量为62.5％(根据GB/T22492-2008中肽含量测试方法进行测试)。
实施例3
取500克(粗蛋白含量28％)燕麦粉，按照1：5加入去离子水，调整pH至8.5，温度30℃，提取150min后，将提取液转移至冷冻离心机中，调整转速至10000rpm，温度为1.5℃，离心10min后，收集上清液，得到2.45L清液；调整温度至65℃，加入中温淀粉酶+糖化酶(1:1)共12.25μL，保持搅拌恒温水解5h，调整pH至5后静至30min后转移至离心机中，调整转速至调整转速至10000rpm，温度为1.5℃，离心10min后，收集得到沉淀约370克；加入1.1L去离子水，调整pH至5.5后充分搅拌30min后，调整温度至55℃，加入0.75‰的枯草杆菌蛋白酶+0.75‰胰蛋白酶，酶解10h后，将温度升高至105℃灭酶后，转移至旋转蒸发仪浓缩至固形物含量至25％，喷干得到103克肽粉，喷雾干燥进料口温度为200℃，出料口温度为100℃；干燥后所得产物中燕麦蛋白肽的质量百分含量为71.5％。(根据GB/T 22492-2008中肽含量测试方法进行测试)
第二部分燕麦蛋白肽指标的测试及动物实验测试
2.1燕麦蛋白肽参数的测定：
将实施例1中制备的燕麦蛋白肽进行检测，检测结果见图1和表1。
表1实施例1-3中燕麦蛋白肽的分析检测结果
从表1中看出燕麦蛋白肽大部分为小分子肽。其中，分子量为3000Da以下的小分子组分占70％以上。另外抗氧化活性ORAC活性较高，是一种优良的抗氧化制剂。
2.2燕麦蛋白肽对炎症抑制的动物试验部分
2.2.1试验动物：选取C57BL/6小鼠，雄性，5周龄，10只，
2.2.2试验试剂型号：IL-2(m)ELISA kit产品型号：EK0398博士德
IL-6(m)ELISA kit产品型号：EK0411博士德
TNF-α(m)ELISA kit产品型号：EK0527博士德
2.2.3试验方案：10只小鼠平均分为两组：分别设定为实验组和空白对照组。
实验组：每隔一天用配制好的燕麦肽溶液(实施例1制备)灌胃，每周天测量体重。
空白组：每隔一天灌胃生理盐水，每周测量体重。
2.2.4测试方法：喂养30天后，处死小鼠，心脏取血测量血清炎症因子(IL-2、IL-6、TNF-a)，采用ELISA酶联免疫法进行测试。
2.2.5结果评价：见下表2中所示。
表2小鼠实验炎症因子指标结果
| 空白组 | 实验组 | 空白组 | 实验组 | 空白组 | 实验组 | |
| IL-2(ng/L) | IL-2(ng/L) | IL-6(ng/L) | IL-6(ng/L) | TNF-a(ng/L) | TNF-a(ng/L) | |
| 1 | 45.4 | 40.8 | 41.77 | 21.7 | 40.3 | 31.2 |
| 2 | 40.7 | 44.5 | 40.7 | 28.6 | 45.6 | 23.6 |
| 3 | 51.5 | 38.4 | 51.5 | 31.4 | 41.2 | 34.1 |
| 4 | 50.4 | 55.1 | 50.4 | 23.3 | 51.6 | 25.8 |
| 5 | 48.2 | 49.2 | 48.2 | 24.5 | 48.2 | 29.4 |
| 均值 | 47.24±4.34 | 45.6±6.69 | 46.48±5.02 | 25.9±4.0 | 45.38±4.74 | 28.82±4.19 |
| t | 0.46 | 7.173 | 5.851 | |||
| P | 0.658 | ＜0.001 | ＜0.001 |
从上表2结果可见经小鼠实验可知，经过该发明所制备的燕麦蛋白肽对肠道炎症因子IL-6、TNF-a具有显著的抑制效果。因此，本发明制备的燕麦蛋白肽可以作为食品添加剂用于抑制肠道炎症反应方面的疾病，即燕麦蛋白肽可以在制备具有抑制肠道炎症反应的食品添加剂中应用。
显然，上述内容只是为了说明本发明的特点，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员根据本发明在相应的技术领域做出的变化应属于本发明的保护范畴。
Claims (10)
1.一种具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征是含有以下步骤：
(1)蛋白质提取：取燕麦粉，加水配成乳液，调整好乳液的pH值和温度进行提取后离心，所得上清液即为燕麦粗蛋白溶液；
(2)蛋白质纯化：在燕麦粗蛋白溶液中加入糖酶进行酶解，酶解完成后调整pH值并静置，离心沉降，所得沉淀即为燕麦蛋白；
(3)复溶：在燕麦蛋白中加入水，并调节pH值，得燕麦蛋白溶液；
(4)酶解：在燕麦蛋白溶液中加入细菌源蛋白酶和动物源蛋白酶的复合酶进行酶解，得到酶解液；
(5)干燥：将酶解液灭酶、浓缩和干燥后，所得产物即为燕麦蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征是：步骤(1)中水的用量为燕麦粉总质量的1～15倍；乳液的pH值为8～11，温度为30～60℃，提取时间为120～150min；离心时离心机转速为3000～10000rpm，离心机温度为1.5～5℃，离心时间为10～30min。
3.根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征是：步骤(2)中所述的糖酶为中温淀粉酶、耐热淀粉酶和糖化酶中的一种或几种，糖酶与燕麦粗蛋白溶液的用量关系为0.5～5μL/L，酶解温度为55～95℃，酶解时间为0.5～5h。
4.根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征是：步骤(2)中pH值为2～5，离心时离心机转速为3000～10000rpm，离心机温度为1.5～5℃，离心时间为10～30min。
5.根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征是：步骤(3)中水的用量为燕麦蛋白总质量的1～5倍，pH值为5.5～7.5。
6.根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征是：步骤(4)中所述的细菌源蛋白酶为alcalase或枯草杆菌蛋白酶；所述的动物源蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶或胰酶，所述细菌源蛋白酶和动物源蛋白酶的复合酶的用量占燕麦眼白溶液总质量的0.5～1.5‰，酶解温度为40～65℃，pH值为3.5～8，酶解时间为3～15h。
7.根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征是：步骤(5)中浓缩采用真空浓缩，真空浓缩至固形物含量为20～60％，干燥采用喷雾干燥，喷雾干燥进料口温度为170～200℃，出料口温度为70～100℃。
8.根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征是：步骤(5)中所得产物中燕麦蛋白肽的质量百分含量在50％以上。
9.采用权利要求1-8任一项具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法制成的燕麦蛋白肽。
10.权利要求9中的燕麦蛋白肽在制备具有抑制肠道炎症反应功效的食品添加剂中应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |