CN107988299B - 一种利用松花粉粕制备抗氧化松花粉肽的方法 - Google Patents

一种利用松花粉粕制备抗氧化松花粉肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用松花粉粕制备抗氧化松花粉肽的方法。本发明将松花粉水提物制备过程中产生的大量松花粉粕残渣废物再利用，充分利用了残渣中的大量优质蛋白质资源，同时缓解了环境压力。制备的具有抗氧化活性的松花粉肽具有安全性高、氨基酸配比合理等特点，在食品领域有着广阔的市场前景。所提供的制备方法工艺简单、反应温度低，能提高松花粉蛋白的抗氧化性，在最佳工艺条件下所得到的松花粉肽超氧阴离子抑制率为18.7％，DPPH清除率达到76.8％，羟自由基抑制率达到94.6％，可为食品、医药等行业提供优质的天然抗氧化剂。

Description

一种利用松花粉粕制备抗氧化松花粉肽的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用松花粉粕制备抗氧化松花粉肽的方法。
背景技术
人类的机体衰老机制和疾病产生机理长久以来都是国内外学者们致力解决的重大科学问题。近年来，随着Harman自由基理论的提出，人们对人体内氧化产生的自由基的认识逐渐深入，发现人的衰老和多种疾病的发生都与自由基的过量产生相关。探索安全高效的消除自由基方法逐渐成为了当前学者们研究的热点。抗氧化剂是近年来发展较快的一类能够消除自由基的物质，既包括化学合成的抗氧化剂如BHA、BHT等，也包括大豆多肽等抗氧化活性多肽。与化学合成的抗氧化剂相比，抗氧化多肽具有安全、高效等特点，能够更广泛的作为基料或功能因子应用于保健食品及化妆品等的开发。
松花粉是指经人工采集得到的马尾松(Pinus Massoniana)等松树的干燥花粉。松花粉作为生命的遗传物质,含有丰富的蛋白质、微量元素、黄酮及必需脂肪酸等营养成分及生物活性物质,具有抗衰老、抗氧化、抗疲劳、促进生长发育、调整机体代谢等多种功效。目前松花粉水提物的制备技术已相对成熟，并形成了国珍松花粉等一系列在售产品。但在松花粉水提物的制备过程中，却产生了大量的松花粉粕残渣，这些残渣中还存在着大量优质的蛋白质资源尚未得到充分利用。简单的丢弃松花粉粕不仅会带来环境的压力，也造成了大量营养物质的浪费。
因此，开发一种安全高效的从松花粉粕中制备活性松花粉肽的方法，成为亟待解决的问题。目前国内关于利用蛋白酶水解松花粉粕制备抗氧化肽的研究未见报道。利用松花粉粕开发具有清除自由基作用的抗氧化肽具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种松花粉粕中制备具有抗氧化活性的松花粉肽的方法，制得具有安全性高、氨基酸配比合理、良好抗氧化性的松花粉肽。
本发明提供一种利用松花粉粕制备抗氧化松花粉肽的方法，步骤如下：
(1)将松花粉粕用粉碎机粉碎，按照1:(10-15)(w:v)的比例加入乙醇，在60℃水浴中搅拌提取1-3h，离心10-20min，收集沉淀在自然通风条件下静置18-24h，加水配制成4-8wt％的松花粉粕溶液；
(2)取步骤(1)的松花粉粕溶液用碱性溶液调节pH为10.0-12.0，在60℃水浴中搅拌提取1-3h，离心10-20min，收集上清液；上清液用酸性溶液调节pH为4.5-5.5，离心10-20min，收集沉淀，加水配制成2-4wt％的松花粉蛋白分散液，并调节pH为7.0-8.0，得到松花粉分离蛋白溶液；
(3)取步骤(2)的松花粉分离蛋白溶液通过碱性溶液调节pH为8.0-10.0，然后加入蛋白酶1000-5000U/g，在50-60℃水浴中水解1-6h，保持温度和pH恒定，当水解度达到7.8-24.5％时停止酶解，得到松花粉蛋白酶解液；
(4)取步骤(3)的松花粉蛋白酶解液于85-100℃水浴灭活蛋白酶5-15min，冷却至20-25℃后，离心10-20min，收集上清液，经超滤膜进行超滤，得到松花粉肽超滤液；
(5)将步骤(4)的松花粉肽超滤液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥，得到抗氧化松花粉肽产品。
其中，步骤(1)中所述的乙醇浓度为80wt％。
步骤(1)(2)(4)中所述的离心转速为2000-4000r/min。
步骤(3)中所述的水解在震荡状态下进行。
步骤(4)中所述的超滤膜截留分子量小于10000Da。
步骤(3)中所述的蛋白酶为胰酶。
所述的碱性溶液为2-5wt％氢氧化钠溶液；所述的酸性溶液为2-5wt％盐酸溶液。
本发明的有益效果是：
本发明将松花粉水提物制备过程中产生的大量松花粉粕残渣废物再利用，充分利用了残渣中的大量优质蛋白质资源，同时缓解了环境压力。制备的具有抗氧化活性的松花粉肽具有安全性高、氨基酸配比合理等特点，在食品领域有着广阔的市场前景。所提供的制备方法工艺简单、反应温度低，能提高松花粉蛋白的抗氧化性，在最佳工艺条件下所得到的松花粉肽超氧阴离子抑制率为18.7％，DPPH清除率达到76.8％，羟自由基抑制率达到94.6％，可为食品、医药等行业提供优质的天然抗氧化剂。
附图说明
图1为双因素交互作用对松花粉蛋白酶解反应的响应面图；
图2为抗氧化松花粉肽的HPLC分子量分析图谱；
图3为不同条件下松花粉肽的抗氧化活性图；
图4为松花粉蛋白及抗氧化松花粉肽的氨基酸组成分析图；
图3中，(A)表示DPPH清除率；(B)表示羟自由基抑制率；(C)表示超氧阴离子抑制率；
图4中，(A)表示松花粉蛋白的氨基酸组成；(B)表示抗氧化松花粉肽的氨基酸组成。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种利用松花粉粕制备抗氧化松花粉肽的方法，步骤如下：
(1)将松花粉粕用粉碎机粉碎，取50g松花粉粕溶于750mL、80wt％乙醇，在60℃水浴中搅拌提取2h，在4000r/min转速下离心15min，将离心收集的沉淀在自然通风条件下静置20h后，加水配制成质量百分比为6.5％的松花粉粕溶液；
(2)将松花粉粕溶液的pH用氢氧化钠溶液调节到11.5，在60℃水浴中搅拌提取1h后，在4000r/min转速下离心15min，收集上清液，上清液用盐酸溶液调节pH至4.8，在4000r/min转速下离心15min，收集沉淀，加水配制成2.7wt％的松花粉蛋白分散液，并调节pH至7.5，得到松花粉分离蛋白溶液；
(3)将松花粉分离蛋白溶液的pH通过氢氧化钠溶液调节到8.36，然后加入3000U/g胰酶，在52℃水浴中震荡水解4h，并保持温度和pH恒定，当水解度达到22.8％时停止酶解，得到松花粉蛋白酶解液；
(4)将松花粉蛋白酶解液于100℃水浴灭活蛋白酶10min，冷却至22℃，在4000r/min转速下离心20min，收集上清液，再用截留分子量小于10000Da的超滤膜进行超滤，得到松花粉肽超滤液；
(5)将松花粉肽超滤液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥，得到抗氧化松花粉肽产品。
通过响应面优化得到酶解制备抗氧化肽的最佳条件，响应面实验设计及结果如表1所示。
表1松花粉分离蛋白酶解中心组合实验设计及结果
Figure BDA0001491120280000051
采用Design-Expert 8.0.5统计分析软件进行回归优化得到水解度模型为：
DH＝+21.97+0.34*A-6.983E-003*B-0.31*C+0.28*A*B-0.87*A*C-1.06*B*C-0.90*A2-1.32*B2-1.30*C2
松花粉蛋白的水解度与底物浓度、温度和反应pH之间的方差分析如表2所示，该数学模型F值为21.08(P＝0.0003＜0.01)，达到了极显著水平，说明该方程的试验点与结果相吻合，而失拟性检验F值为0.55(P＝0.6725>0.05)，差异不显著，表明方程没有失拟因素，回归方程的拟合较好，模型能够反映真实的情况。图1中分别表示的是pH-温度、pH-S/L、温度-S/L对松花粉蛋白水解度的影响。
表2松花粉分离蛋白酶解模型的ANOVA分析结果
Figure BDA0001491120280000061
该实施例是在最佳条件下进行的，在该酶解条件下制备得到的松花粉肽，水解度为22.81％。图2显示了抗氧化松花粉肽的高效液相色谱(HPLC)图，通过GPC软件分析了其相对分子质量分布，其分子量分布在112Da-3000Da之间，平均分子量为661Da。
如图3所示，与松花粉分离蛋白相比松花粉肽的抗氧化活性显著提高。当在该实施例条件下得到的松花粉肽浓度为5mg/ml时，松花粉肽的超氧阴离子抑制率为18.7％，DPPH清除率达到76.8％，羟自由基抑制率达到94.6％。
抗氧化松花粉肽和松花粉分离蛋白的氨基酸组成分析如图4所示，该松花粉肽的氨基酸配比符合粮农组织/世卫组织建议的蛋白质推荐配比，且松花粉肽中所有必需氨基酸的含量均超过FAO/WHO推荐量。其总必需氨基酸含量远高于婴儿推荐值39％，更高于儿童的26％和成人的11％，因此其具有高水平的必需氨基酸品种和营养可接受的氨基酸谱。综上所述，该抗氧化松花粉肽可被认为是理想的蛋白食物来源及天然抗氧化剂。
实施例2
一种利用松花粉粕制备抗氧化松花粉肽的方法，步骤如下：
(1)将松花粉粕用粉碎机粉碎，取30g松花粉粕溶于300mL、80wt％乙醇，在60℃水浴中搅拌提取2h，在4000r/min转速下离心15min，将离心收集的沉淀在自然通风条件下静置24h后，加水配制成质量百分比为6.5％的松花粉粕溶液；
(2)将松花粉粕溶液的pH用氢氧化钠溶液调节到11.5，在60℃水浴中搅拌提取1h后，在4000r/min转速下离心15min，收集上清，用盐酸溶液调节pH至5.0，在4000r/min转速下离心15min，收集沉淀，加水配制成2.7wt％的松花粉蛋白分散液，并调节pH至7.5，得到松花粉分离蛋白溶液；
(3)将松花粉分离蛋白溶液的pH通过氢氧化钠调节到8.36，然后加入3000U/g胰酶，在51.5℃水浴中震荡水解1.5h，并保持温度和pH恒定，当水解度达到18.2％时停止酶解，得到松花粉蛋白酶解液；
(4)将松花粉蛋白酶解液于100℃水浴灭活蛋白酶10min，冷却至室温后，在4000r/min转速下离心20min，收集上清，再用截留分子量小于10000Da的超滤膜进行超滤，得到松花粉肽超滤液；
(5)将松花粉肽超滤液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥，得到抗氧化松花粉肽产品。
按照实施例1所记载的方法进行检测，本实施例所制得的松花粉肽平均分子量为1258Da，松花粉肽浓度为5mg/ml时，如图3所示，松花粉肽的超氧阴离子抑制率为35.1％，DPPH清除率达到68.8％，羟自由基抑制率达到85.2％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种利用松花粉粕制备抗氧化松花粉肽的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将松花粉粕用粉碎机粉碎，按照1:(10-15)(w:v)的比例加入乙醇，在60℃水浴中搅拌提取1-3h，离心10-20min，收集沉淀在自然通风条件下静置18-24h，加水配制成4-8wt％的松花粉粕溶液；
(2)取步骤(1)的松花粉粕溶液用碱性溶液调节pH为11.5，在60℃水浴中搅拌提取1-3h，离心10-20min，收集上清液；上清液用酸性溶液调节pH为4.5-5.5，离心10-20min，收集沉淀，加水配制成2-4wt％的松花粉蛋白分散液，并调节pH为7.0-8.0，得到松花粉分离蛋白溶液；
(3)取步骤(2)的松花粉分离蛋白溶液通过碱性溶液调节pH为8.0-10.0，然后加入蛋白酶1000-5000U/g，在50-60℃水浴中水解1-6h，保持温度和pH恒定，当水解度达到7.8-24.5％时停止酶解，得到松花粉蛋白酶解液；
(4)取步骤(3)的松花粉蛋白酶解液于85-100℃水浴灭活蛋白酶5-15min，冷却至20-25℃后，离心10-20min，收集上清液，经超滤膜进行超滤，得到松花粉肽超滤液；
(5)将步骤(4)的松花粉肽超滤液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥，得到抗氧化松花粉肽产品；
其中，步骤(4)中所述的超滤膜截留分子量小于10000Da；
其中，步骤(3)中所述的蛋白酶为胰酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的乙醇浓度为80wt％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)(2)(4)中所述的离心转速为2000-4000r/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的水解在震荡状态下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱性溶液为2-5wt％氢氧化钠溶液；所述的酸性溶液为2-5wt％盐酸溶液。
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