CN104546980A

CN104546980A - 一种蜂花粉提取物及其制备和应用

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Publication number: CN104546980A
Application number: CN201310495399.0A
Authority: CN
Inventors: 邹汉法; 靳艳
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2013-10-21
Filing date: 2013-10-21
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2033-10-21
Also published as: CN104546980B

Abstract

本发明公开了一种蜂花粉提取物的制备方法，具体地说先提取蜂花粉的黄酮类化合物、再用提取残渣制备蜂花粉中的生物活性肽，再将黄酮类化合和活性肽混合制备成为蜂花粉提取物。所制备的蜂花粉提取物同时兼备活性肽和黄酮类化合物的活性。

Description

一种蜂花粉提取物及其制备和应用

技术领域

本发明涉及蜂花粉提取物的制备方法，，具体地说先提取蜂花粉的黄酮类化合物、再用提取残渣制备蜂花粉中的生物活性肽，再将黄酮类化合和活性肽混合制备成为蜂花粉提取物，所制备的蜂花粉提取物同时兼备活性肽和黄酮类化合物的活性。本发明属于生物化工、制药、食品等技术领域。

背景技术

蜂花粉是蜂蜜采集有花植物的花粉粒，在采集过程中加上蜂蜜自身的腺上分泌物、唾液和花蜜而形成。蜂花粉是蜂群生长和繁衍的主要营养来源之一，具有很高的营养价值。蜂花粉包含蛋白质、碳水化合物、黄酮类化合物、微量元素、酶等多种营养成分，因此蜂花粉素来就有“天然微型营养库”等美誉。关于蜂花粉的生物活性研究表明，蜂花粉具有改善心血管疾病、增强免疫力、降血糖、抗氧化、抗衰老、抑制前列腺疾病等功效。

文献1（中国专利CN200810007853.2）公开用不同有机溶剂提取油菜蜂花粉的有效部位，有效部位在预防酒精性肝损伤的新用途。文献2(中国专利200610052876.6)公开了用酒精提取破壁蜂花粉活性组分，该活性组分具有降血脂的功能。文献3（中国专利200810134816.8）公开了提取蜂花粉蛋白质并用酶解法制备肽，蜂花粉肽具有血管紧张素转移酶抑制。文献4（中国专利201010295791.7）公开了从油菜蜂花粉中得到了一种具有抗炎、镇痛、抑菌活性的提取物的方法。文献5（中国专利201010169477.4）公开了一种从蜂花粉中提取油脂类化合物的方法。文献6（中国专利201110364321.6）公开了一种从蜂花粉中提取辅酶Q10的方法。文献7（中国专利200410073514.6）公开了从油菜花粉中制备具有治疗前列腺肿瘤的有效部位的方法。尽管目前关于蜂花粉活性组分提取的方法已有很多，但是现有方法都是以蜂花粉中某种单一物质为目标产物。虽然提取得到的组分具有较好的活性，但是却在提取过程中损失了蜂花粉中其他的活性成分，使蜂花粉仅仅成为某种成分的原料，而无法体现蜂花粉“全能营养库”的特点。未经加工的蜂花粉作为功能性食品或者药物时使用时要达到理想的功效所需剂量较大。

发明内容

目前蜂花粉存在原药直接使用所需剂量大、提取物活性成分单一无法体现蜂花粉全效的问题，至今为止还未见有关蜂花粉保留全效的制备方法。本发明人经过研究发现蜂花粉中的主要生物活性成分为黄酮类化合物以及肽类化合物，提出一种全新的蜂花粉提取物制备方法，该技术浓缩黄酮类化合物、精制蜂花粉肽化合物，利用该技术制备的蜂花粉提取物最大程度地保留了蜂花粉的生物活性，同时又大大降低了蜂花粉的有效剂量。

本发明的目的是提供一种蜂花粉提取物的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

选用干燥的蜂花粉，首先用溶剂提取花粉中的黄酮类化合物，再将提取剩余的残渣用蛋白水解酶酶解制备蜂花粉活性肽，然后将黄酮类化合物和活性肽合并，成为蜂花粉提取物。

蜂花粉提取物按照以下方法制备：干燥的蜂花粉按照原料:溶剂=1kg:5～50L的比例加入溶剂，20-70℃提取1～10小时，提取结束后过滤或离心将提取液与固形物分离分别进行处理：

（1）提取液的处理方法：提取液经真空浓缩，浓缩样品用体积浓度40-70%乙醇溶解后上大孔树脂柱，先用2～10倍柱体积的去离子水淋洗，然后再用体积浓度40～90%乙醇洗柱子并收集流分，将含乙醇洗脱剂洗脱的流分真空浓缩得到组分1。

（2）固形物处理方法：按照原料：溶液=1kg：2～10L的比例加入水或者缓冲液混合，pH调整混合液在范围2～10，再加入原料质量的0.001～3%的蛋白水解酶，于20～60℃酶解1～48小时；酶解结束后将反应体系温度升至80-100℃保持10-60分钟，使酶失活，然后离心或过滤，收集滤液浓缩干燥得到组分2。

将组分1与组分2再次混合，得到蜂花粉提取物。

本发明干燥花粉提取所用的溶剂为：水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、环己烷、正己烷、石油醚中的一种或二种以上的溶剂混合物

本发明固形物酶解中所用的蛋白水解酶为：蛋白水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶中的一种或二种以上。

本发明所述缓冲液为：磷酸缓冲液、Tris-HCI缓冲液、醋酸缓冲液、去离子水中的一种。

含有本发明的提取物的药物、功能食品、食品可制备成任何形式，例如口服剂型：粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、水性药物、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、小包、颗粒剂；局部制剂：乳膏、软膏、乳液。凝胶。半固体膏、贴剂糊膏。喷雾剂。气雾剂等；注射剂：溶液、悬剂、乳剂。

本发明的特点如下：

1.本发明的技术工艺设计巧妙：首先提取蜂花粉中的黄酮类化合物，既浓缩了黄酮类化合物又不影响后续工艺中生物活性肽的制备；生物肽制备的过程又是其浓缩的过程，工艺最后又将这种活性组分按原药的比例组合，不仅最大程度地保留了蜂花粉的生物活性，而且减少了使用的有效剂量。

2.工艺简单，效率高。本发明的提取过程中蜂花粉不需要破壁等特殊处理，生物活性肽制备过程中不需要单独提取蛋白质，因此制备工艺简、效率高，易于实现产业化；提取过程所使用溶剂易回收，有机溶剂残留可控，具有绿色环保的特点。

3.具有良好的应用前景。蜂花粉的疗效有悠久的历史，但是由于通常所需剂量较大、疗效不显著，因此在市场推广中受到限制。现有的蜂花粉活性成分提取技术都仅仅是单一组分的提取，无法体现蜂花粉原有多功效的特点。本发明的技术工艺克服了不仅现有技术存在的缺陷而且，因此通过浓缩活性组分从而达到提高活性的目的，因此将在食品、保健品、药品、化妆品等领域有良好的应用前景。

具体实施方式

实施例1

一、蜂花粉提取物制备方法

以油菜花粉为原料，按照以下工艺制备蜂花粉提取物：

取干燥的蜂花粉1000克，加入体积浓度70%乙醇5L，20℃提取10小时，提取结束后过滤将提取液与固形物分离分别进行处理：

（1）提取液的处理方法：提取液经真空浓缩干燥，浓缩样品用体积浓度70%乙醇溶解后上大孔树脂柱，先用5倍柱体积的去离子水淋洗，然后再用体积浓度70%乙醇洗柱子并收集流分，将70%乙醇所洗的组分真空浓缩干燥得到组分1。

（2）固形物处理方法：固形物按照原料：溶液=1kg:10L的比例加入水，pH调整混合液在范围2，再加入原料质量的0.2%的胃蛋白酶，于40℃酶解48小时；酶解结束后将反应体系温度升至90℃保持20分钟，使酶失活，然后离心或过滤，收集滤液浓缩干燥得到组分2。

将组分1与组分2再次混合，得到油菜蜂花粉提取物。

二、蜂花粉提取物成分及活性测定方法

1，油菜蜂花粉提取物的主要成分测定方法：

（1）蛋白质含量测定：凯氏定氮法；

（2）多糖含量测定：硫酸-苯酚法；

（3）黄酮类化合物含量测定：硝酸铝比色法；

（4）酚酸测定：Foiln-ciocalteu法。

2，油菜蜂花粉提取物的生物活性测定方法：

（1）ACE抑制活性测定方法：

ACE在37℃、PH8.3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟底物Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸，该物质在228nm处有特征紫外吸收峰。当加入ACE抑制物时，ACE对HHL的催化作用受到抑制，马尿酸的生成量会减少。通过测定加入抑制剂前后的马尿酸紫外吸收值可以计算出抑制活性的大小。

反应体系

缓冲液为0.05M，PH8.3硼酸盐缓冲液；底物为Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)，MW429.47，用上述缓冲液配成5mM；ACE（angiotensin-converting enzyme）用上述缓冲液配成0.1U/ml。

ODA（对照组，为不存在抑制剂但存在酶时的吸光值）：50μl缓冲液+50ulHHL+50μl缓冲液于37℃水浴5min，然后加入50μl ACE，37℃水浴30min，加入200μl、1M的HCl终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0.8ml上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为ODA。

ODB（样品组，为存在抑制剂和酶时的吸光值）:50μl蜂花粉提取液+50μlHHL+50μl缓冲液于37℃水浴5min，然后加入50μlACE，37℃水浴30min，加入200μl、1M的HCl终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0.8ml上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为ODB。

ODC（空白组，为不存在抑制剂和酶时的吸光值）：50μl缓冲液+50μlHHL+50μl缓冲液于37℃水浴5min，然后加入50μl缓冲液，37℃水浴30min，加入200μl、1M的HCl终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0.8ml上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为ODC。

ACE抑制率（%）=(ODA-ODB)/(ODA-ODC)×100%

（2）a-葡萄糖苷酶抑制活性测定方法：

2.1原理：此法以PNPG(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,4-硝基苯基--α-D-吡喃葡萄糖苷)为底物,利用α-葡萄糖苷酶将其分解成PNP及葡萄糖,而PNP在碱性条件下显色的原理利用紫外分光光度计在405nm测定。当加入α-葡萄糖苷酶抑制物时，α-葡萄糖苷酶对PNPG的催化作用受到抑制，PNP的生成量会减少。通过测定加入抑制剂前后的PNP紫外吸收值可以计算出抑制活性的大小。

2.2活性测定

反应体系

A：200μL缓冲液（20mM KH₂PO₄-KOH,其中含有6.4mM MgCI₂·6H₂O）加200μLα-葡萄糖苷酶，37℃维持5min，加入200μL PNPG，37℃维持30min，加入0.1M Na₂CO₃400μL终止反应，405nm检测吸光度

A₀:将A中的200uLα-葡萄糖苷酶换成200uL缓冲液，其他同A操作

B:200μL样品加200μLα-葡萄糖苷酶，37℃维持5min，加入200μL PNPG，37℃维持30min，加入0.1M Na₂CO₃400μL终止反应，405nm检测吸光度

B₀:将B中的200uLα-葡萄糖苷酶换成200uL缓冲液，其他同B操作

抑制率：[1-(OD_B-OD_B0)/(OD_A-OD_A0)]X100%

OD_A为不存在抑制剂时control组的吸光值

OD_A0为control组的空白对照值

OD_B为存在抑制剂时样品组的吸光值

OD_B0为样品组的空白对照值

（3）酪氨酸酶抑制活性

3.1原理：酪氨酸酶又称多酚氧化酶，是一种含铜的金属酶，它广泛存在于动植物体内，是生物体合成黑色素的关键酶。酪氨酸酶催化反应分为两步，第一步能够催化单酚羟化成二酚，表现出单酚氧化活性，即以酪氨酸为底物生成多巴；第二步把二酚氧化成醌，表现出二酚氧化活性，即以多巴为底物生成多巴醌。醌又在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。

3.2酪氨酸酶单酚氧化活性抑制率的测定

A_t值的测定：100μL蜂花粉提取液加入600μL pH=6.8PBS，再加入250μL0.015％L-酪氨酸溶液，37℃水浴10min，最后加入50μL250U/mL的酪氨酸酶溶液37℃反应（反应时间为

3.3确定的30min），测定475nm处的吸光度。

A₁值的测定：以同体积PBS缓冲液代替酪氨酸酶溶液，其他同A_t测定方法。

A_b值的测定：以同体积PBS替代样品溶液，其他同A_t测定方法。

A₀值的测定：以同体积PBS替代样品溶液，同时以同体积PBS缓冲液磷代替酪氨酸酶溶液，其他同A_t测定方法。

抑制率（%）=[1-（A_t-A₁）/（A_b-A₀）]×100

A_t:样品组吸光度值

A₁:样品组空白对照

A_b:control组吸光度值

A₀:control组的空白对照

（4）抗氧化能力测定方法

4.1DPPH自由基清除能力

2ml蜂花粉提取液样品+2ml，0.1mM DPPH（2,2-Diphenyl-1-Picryhydrazyl,2,2-二苯基-1-苦肼基自由基）振荡混匀，室温放置30min，于517nm检测吸光度变化

清除率%=（A_control-A_sample）/A_control X100

乙醇做control

4.2羟基自由基清除能力

0.5ml，7.5mM FeSO₄+0.5ml，7.5mM1,10-phenanthroline+2.5ml，0.2M、pH7.8磷酸缓冲液+0.5ml，30mM H₂O₂+0.5ml样品，于室温放置5min，536nm检测吸光度

清除率：（A_s-A₁）/(A₀-A₁)×100

A₁相当于blank，无样品

A₀相当于control，无H₂O₂

A_s样品组

4.3铁还原能力测定

2ml蜂花粉提取液样品+2ml,0.2M，pH6.6磷酸缓冲液+2ml，1%铁氰化钾，50℃，20min，再加入10%TCA，于3000rpm离心10min，取2ml上清+2ml蒸馏水+4ml,0.1%FeCl₃,室温放置10min，700nm检测吸光度变化。

GSH做对照

三、蜂花粉主要成分及活性测定结果

油菜蜂花粉分别进行主要成分和生物活性分析，结果见表1和表2。

表1油菜蜂花粉提取物的主要成分分析结果（质量含量）

成分	黄酮类化合物%	总多酚含量%	肽含量%	多糖含量%
					含量	7	5	57	10

表2油菜蜂花粉提取物的生物活性

ACE抑制活性是常用的降血压药物筛选模型，油菜蜂花粉提取物的ACE抑制活性IC₅₀为0.094mg/ml，表明油菜蜂花粉提取物具有很强的抑制ACE的活性，因此是具有潜在的降血压活性。

a-葡萄糖苷酶抑制活性是常用的降血糖药物筛选模型，油菜蜂花粉提取物的IC₅₀为2.1575mg/ml，表明油菜蜂花粉提取具有较强的抑制a-葡萄糖苷酶活性，具有潜在的降血糖活性。

酪氨酸酶抑制活性是常用的美容美白化妆品有效成分的筛选模型，油菜蜂花粉提取物的IC₅₀为0.8338mg/ml，表明油菜蜂花粉提取具有较强的抑制酪氨酸酶活性，具有潜在的美白功效。

根据现代生物研究成果，氧应激反应是目前很多疾病的根源，抗氧化是从根本上预防疾病和抗衰老，因此具有抗氧化活性的物质可能成为膳食补充剂、药物等。油菜蜂花粉的表现出较强的DPPH自由基清除能力、枪击自由基清除能力和铁还原能力，以上表明油菜蜂花粉具有很强的抗氧化能力。

综上所述，利用本发明所制备的油菜蜂花粉提取物不仅保留而且增强了了油菜蜂花粉的的生物活性。

实施例2

以茶蜂花粉为原料，按照以下工艺制备蜂花粉提取物：

取干燥的茶蜂花粉1000克，加入乙酸乙酯50L，50℃提取2小时，提取结束后过滤将提取液与固形物分离分别进行处理：

（1）提取液的处理方法：提取液经真空浓缩干燥，浓缩样品用70%乙醇溶解后上大孔树脂柱，先用5倍柱体积的去离子水淋洗，然后再用70%乙醇洗柱子并收集流分，将70%乙醇所洗的组分真空浓缩干燥得到组分1。

（2）固形物处理方法：固形物按照原料：溶液=1kg:2L的比例加入0.01M的Tris-HCI缓冲液，pH调整混合液在范围7，再加入原料质量的3%的菠萝蛋白酶，于50℃酶解1小时；酶解结束后将反应体系温度升至90℃保持20分钟，使酶失活，然后离心或过滤，收集滤液浓缩干燥得到组分2。

将组分1与组分2再次混合，得到茶蜂花粉提取物。

茶蜂花粉按照实施例1的方法测定其含量及生物活性，茶蜂花粉的生物活性与油菜蜂花粉具有一样的生物活性。

实施例3

以玉米蜂花粉为原料，按照以下工艺制备玉米蜂花粉提取物：

取干燥的玉米蜂花粉1000克，加入正己烷20L，30℃提取5小时，提取结束后过滤将提取液与固形物分离分别进行处理：

（1）提取液的处理方法：提取液经真空浓缩干燥，浓缩样品用70%乙醇溶解后上大孔树脂柱，先用10倍柱体积的去离子水淋洗，然后再用50%乙醇洗柱子并收集流分，将50%乙醇所洗的组分合并后真空浓缩干燥得到组分1。

（2）固形物处理方法：固形物按照原料：溶液=1kg:5L的比例加入0.05M磷酸缓冲液，pH调整混合液在范围7，再加入原料质量的0.1%的胰蛋白酶，于40℃酶解10小时；酶解结束后将反应体系温度升至80℃保持60分钟，使酶失活，然后离心或过滤，收集滤液浓缩干燥得到组分2。

将组分1与组分2再次混合，得到玉米蜂花粉提取物。

玉米蜂花粉按照实施例1的方法测定其含量及生物活性，玉米蜂花粉的生物活性与油菜蜂花粉具有一样的生物活性。

Claims

1.一种蜂花粉提取物，其特征在于：

是由蜂花粉溶剂提取出的黄酮类化合物与蜂花粉溶剂提取剩余残渣的蛋白水解酶酶解蜂花粉活性肽混合而成，成为蜂花粉提取物。

2.一种权利要求1所述蜂花粉提取物的制备方法，其特征在于：首先用溶剂提取花粉中的黄酮类化合物，再将提取剩余的残渣用蛋白水解酶酶解制备蜂花粉活性肽，然后将黄酮类化合物和活性肽合并，成为蜂花粉提取物。

3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：蜂花粉提取物按照以下方法制备：干燥的蜂花粉按照原料:溶剂=1kg:5～50L的比例加入溶剂，20-70℃提取1～10小时，提取结束后过滤或离心将提取液与固形物分离分别进行处理：

（1）提取液的处理方法：提取液经真空浓缩，浓缩样品用体积浓度40-70%乙醇溶解后上大孔树脂柱，先用2～10倍柱体积的去离子水淋洗，然后再用体积浓度40～90%乙醇洗柱子并收集流分，将含乙醇洗脱剂洗脱的流分真空浓缩得到组分1；

（2）固形物处理方法：按照原料：溶液=1kg：2～10L的比例加入水或者缓冲液混合，pH调整混合液在范围2～10，再加入原料质量的0.001～3%的蛋白水解酶，于20～60℃酶解1～48小时；酶解结束后将反应体系温度升至80-100℃保持10-60分钟，使酶失活，然后离心或过滤，收集滤液浓缩干燥得到组分2；

将组分1与组分2再次混合，得到蜂花粉提取物。

4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于：蜂花粉提取所用的溶剂为：水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、环己烷、正己烷、石油醚中的一种或二种以上的溶剂混合物。

5.按照权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：固形物酶解中所用的蛋白水解酶为：胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶中的一种或二种以上。

6.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为：磷酸缓冲液、Tris-HCI缓冲液、或醋酸缓冲液中的一种。

7.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述蜂花粉为油菜花粉、松花粉、玉米花粉、茶花粉、板栗花粉、荷花花粉、荞麦花粉、杏花份、桃花粉、向日葵花粉中的一种或二种以上不同花粉混合物。

8.一种权利要求1所述蜂花粉提取物的应用，其特征在于：权利要求1所述蜂花粉提取物作为活性成份，用于药物、功能食品或食品的制备中；

其可制备成任何形式，

例如口服剂型：粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、水性药物、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、小包、或颗粒剂；

外用局部制剂：乳膏、软膏、乳液、凝胶、半固体膏、贴剂糊膏、喷雾剂或气雾剂；

注射剂：溶液、悬剂、或乳剂。