CN102743322B - 竹荪提取物在化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了竹荪提取物在化妆品中的应用以及含有竹荪提取物的化妆品组合物。

Description

竹荪提取物在化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体涉及竹荪提取物在化妆品中的应用以及含有竹荪提取物的化妆品组合物。

背景技术

皮肤生理上的表面状态、血流、水分、色素等各种各样的成分经过错综复杂的结合，决定了人体的肤色，在这一系列因素中最主要的是黑色素。黑色素的形成过程是：首先由氨基酸之一的酪氨酸作为底物在酪氨酸酶的作用下形成多巴，再转化为多巴醌，这一最初的反应被称为黑色素合成的速率控制阶段，其后多巴醌经过一系列的氧化异构及聚合反应最终形成黑色素。黑色素的合成处是黑色素小体，成熟的黑色素小体会沿着黑色素细胞伸出的树状突起的末梢向周围的角质细胞移行，被角质细胞摄取，黑色素从皮肤的基底层被转移到角质层，进而使肤色变黑。皮肤表层的角质细胞遵循一定的更新周期，一般为28天左右，此时黑色素随着皮肤的角质化，被推挤到皮肤表面，并伴随角质层的剥离从皮肤中排出，进而黑色素完成了从产生到代谢的整个过程。

在美白类化妆品的开发中，为增白肤色或改善皮肤色素异常沉着，常添加各种美白活性原料。常用的有：酪氨酸酶抑制剂：①包括单酚与多酚类(氢醌、熊果苷、壬二酸)；②铜离子螯合剂(曲酸及其酯化物)；③阻止酪氨酸酶向前黑素体转移的物质(葡萄糖胺类)；④改变前黑素体超微结构的物质(五癸酸)；⑤促进酪氨酸酶蛋白降解的物质(不饱和脂肪酸)；⑥竞争性酪氨酸酶抑制剂(氨甲环酸等)；⑦其他类(甘草黄酮等)。非酪氨酸酶抑制剂，包括：①抗坏血酸及其衍生物；②角质溶解剂(α-羟酸类、维A酸类、水杨酸等)；③抑制黑素细胞增殖的物质(内皮素受体阻断剂如母菊提取物)；④其他类(过氧化氢、山梨酸钾等)。

近年来随着消费者对自身健康和安全的日益关注，相对于许多生化合成的化妆品功效原料，来源于天然且功效卓著的原料则更受青睐。

竹荪又名竹笙、竹参、面纱菌、网纱菌、竹姑娘、僧竺蕈、竹菌等，是鬼笔科竹荪属中珍贵的食用菌。素有“菌菇之花”、“雪裙仙子”、“山珍之花”、“菌中皇后”的美誉。竹荪是优质的植物蛋白和营养源，菌体含有丰富的营养成分，据报道菌体约含蛋白20.2％，粗脂肪2.6％，碳水化合物38.1％，粗纤维9.4％，还含有21种氨基酸，8种为人体所必需，其中谷氨酸的含量高达1.76％，占氨基酸总量的17.0％以上，为蔬菜和水果所不及，且竹荪所含的氨基酸大多以菌体蛋白的形态存在，因此不易丧失。竹荪富含多种维生素，如B族维生素中的VB₁、VB₂、VB₆，以及维生素A、D、E、K等。其中VB₂(核黄素)含量较高。竹荪所含多糖以半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖为主。竹荪还含有多种微量元素，其中重要的有锌、铁、铜、硒。

竹荪性温味甘，有活血、健脾益胃、助消化之功效，适用于咳嗽、高血压、高血脂等症的治疗和预防。在云南，苗族同胞将竹荪和糯米一起泡水喝，可以治疗虚弱症、损伤症和咳嗽，有直通补气之功效，竹荪还具有解腻助消化的作用。中医认为竹荪有大补之功，但其药用价值在历代本草著作中鲜有论述。常食竹荪能保护肝脏，减少腹壁脂肪的积存，有俗称“刮油”的作用。竹荪还有延长汤羹食品的存放时间、保持菜肴的鲜味而不霉馊的奇特功能。

发明内容

目前竹荪大多应用于食品领域。经本发明人研究发现，竹荪提取物具有卓越的美肤功效，尤其是在肌肤增白方面，它能够有效地抑制体外酪氨酸酶的活性、抑制多巴的自身氧化和加深，并且能减少/淡化B16黑素细胞中所含的黑色素。同时，它可以阻击自由基对皮肤细胞的侵害；促进人成纤维细胞的增殖，延缓肌肤衰老；可以有效抑制透明质酸酶的活性，以达到抗炎症和协同保湿的双重功效。

因此，本发明的一个目的是提供竹荪提取物在化妆品中的应用。

根据本发明，术语“竹荪提取物”是指通过任何适当方式从竹荪中提取出的含有有效成分的提取物。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述化妆品可以选自美白化妆品、抗衰老化妆品、抗炎症化妆品、保湿化妆品或其组合。

根据本发明的另一个目的，本发明提供一种化妆品组合物，其特征在于，所述组合物含有竹荪提取物和化妆品领域可接受的辅料。

所述化妆品领域可接受的辅料可以选自：溶剂、增溶剂、防腐剂、抗氧剂、pH调节剂、促渗剂、脂质体、保湿剂、增稠剂、螯合剂、肤感调节剂、表面活性剂、乳化剂、推进/抛射剂、香精、色素，以及其他功效添加剂。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述组合物为霜剂、乳液、溶液剂、膜剂、气雾或喷雾形式。更具体地说，所述组合物可以为洗面奶、沐浴露、化妆水、护肤啫喱、护肤乳液、护肤霜、精华液、眼霜、面膜、气雾或喷雾形式。这些形式可通过本领域技术人员熟知的方法制备。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述竹荪提取物占所述组合物总重量的0.001％-100％，优选0.01％-50％，更优选0.5％-20％。

本发明所述竹荪提取物可以通过本领域技术人员熟知的方法提取得到，例如，取竹荪适量，以适宜溶媒浸泡，以适宜的提取方法提取，过滤得到澄清液体，任选经过纯化步骤，制成优选含生药量1-2000mg/ml，更优选20-1000mg/ml的溶液，也可挥干溶媒制成干粉形式。

生药浓度按照如下方法计算：提取前粉碎的干竹荪重量为Wg，加入适宜溶剂提取，得到的最终提取液经体积定量为Kml，提取物的生药浓度为：W/K(g/ml)＝1000W/K(mg/ml)。

根据本发明的一个优选的实施方式，适宜溶媒主要为水(包括蒸馏水、去离子水等)或有机溶剂(优选醇类和酯类溶剂，醇类溶剂包括乙醇和多元醇等，酯类溶剂包括乙酸乙酯等)；适宜的提取方法选自以下一种或几种：浸提、煎煮、回流和超临界；适宜的纯化方法选自以下一种或几种：醇沉、萃取、膜分离和柱层析。

具体实施方式

以下实施例1-5中所述竹荪产自福建。

实施例1

取粉碎的竹荪适量，倾入提取罐内，加入30倍量(W/V)水，充分搅拌混匀，在60℃条件下保温浸提2小时，过滤，弃去滤渣，滤液即为所得，生药浓度为53.2mg/ml。

实施例2

取粉碎的竹荪适量，倾入提取罐内，加入20倍量(W/V)水，充分搅拌混匀，在80℃条件下保温浸提2小时，间断性进行搅拌，提取2次；过滤，弃去滤渣，合并滤液，滤液加热浓缩至适量，放置冷却。边搅拌边缓慢加入95％乙醇，使乙醇终浓度为60～75％，静置过夜。过滤，取上清液，加入乙酸乙酯萃取3次，萃取物挥去溶剂，加入适量乙醇溶解，使生药浓度为2000mg/ml。

实施例3

取粉碎的竹荪适量，倾入提取罐内，加入20倍量(W/V)水，充分搅拌混匀，在80℃条件下保温浸提2小时，间断性进行搅拌，提取2次；过滤，弃去滤渣，合并滤液，滤液加热浓缩至适量，放置冷却。边搅拌边缓慢加入95％乙醇，使乙醇终浓度为60～75％，静置过夜。过滤，取滤渣在减压条件下回收乙醇至无醇味，残渣加入适量水溶解，使生药浓度为1000mg/ml。

实施例4

取粉碎的竹荪适量，倾入提取罐内，加入20倍量(W/V)水，充分搅拌混匀，冷浸1小时后加热至沸腾，保持微沸2小时，提取2次；过滤，弃去滤渣，合并2次滤液，滤液加热浓缩至适量，冷却后离心弃去沉渣。上清液加入去离子水适量混匀，加入到已经预处理的D101大孔树脂柱中(购自天津农药厂，预处理过程：用95％乙醇数次浸泡至乙醇溶液呈澄清透明，再用水冲柱至无乙醇味)，先用蒸馏水洗脱至近无色，再用4倍量50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，洗脱液减压浓缩回收乙醇至无醇味，残液加入适量水溶解(也可加入丙二醇适量助溶)，使生药浓度为500mg/ml。

实施例5

取粉碎的竹荪适量，倾入提取罐内，加入30倍量(W/V)水，充分搅拌混匀，冷浸1小时后加热至沸腾，保持微沸2小时，提取1～2次；过滤，弃去滤渣，合并2次滤液，经棉球粗滤后上膜分离装置(厦门福美科技有限公司，型号：RNF-0460)，调节适当的压力和流量，分离出分子量在2000～200000之间的有效部位群，生药浓度为20.4mg/ml。

以下实施例6-16中所使用的竹荪提取物均为实施例1得到的竹荪提取物，其生药浓度为53.2mg/ml；实施例6-16中各组分的单位均为重量百分比。

实施例6：面霜的制备

实施例7：乳液的制备

实施例8：啫喱的制备

实施例9：化妆水的制备

实施例10：精华液的制备

实施例11：面膜的制备

实施例12：眼霜的制备

实施例13：气雾(清洁泡)的制备

实施例14：喷雾的制备

实施例15：沐浴露的制备

实施例16：洗面奶的制备

以上6-16实施例中所述的竹荪组合物均经过①稳定性测试，将料体分别在-20℃、4℃、室温、48℃、循环(连续变换四个温度条件)、光照条件下放置12周，各料体的颜色和形态都保持稳定；②皮肤安全性测试，证实对皮肤无刺激，不会引发红斑、脱屑、刺痛及灼热等不良反应，可安心使用；③使用感觉测试，请20位中国女性志愿者在面部连续使用实施例10所述的精华液8周，评估结果表明，使用含竹荪提取物的精华液后，明显发现肌肤变得白皙、通透度提升，感觉肌肤水嫩饱满度提高，显得更为年轻。

以下试验例1-6中所使用的竹荪提取物样品溶液为实施例1制备得到的竹荪提取物；以下试验例中涉及的“mg/ml”浓度单位，均是由核算干品竹荪的物料比获得，即：提取前粉碎的干竹荪重量为Wg，加入适宜溶剂提取，得到的最终提取液经体积定量为Kml，提取物的物料比核算为：W/K(g/ml)＝1000W/K(mg/ml)。

试验例1：酪氨酸酶活性抑制实验

一、实验原理

在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。

酪氨酸酶在pH6.8的磷酸缓冲液中，可催化多巴转化成多巴醌(呈肾上腺素红色)，在分光光度计475nm处可测定吸光值。具有抑制酪氨酸酶活性作用的物质可以减少多巴转化成多巴醌，从而降低吸光值，根据吸光值的变化，评估被测物质对酪氨酸酶的抑制作用。

二、实验方法

在样品管和样品对照管中各加入1.0ml对应浓度的竹荪提取物样品溶液(PBS配制，pH6.8)，阴性对照管和空白对照管则分别加入1.0mlPBS。在样品管和阴性对照管中各加入0.5ml(100U/ml)酪氨酸酶溶液(购自Sigma公司，批号：079K7000)，样品对照与空白对照管以0.5mlPBS代替。振摇混匀，30℃水槽孵育10分钟。在各管中加入2.0ml的5×10^-4g/ml的多巴L-DOPA(购自Sigma公司，批号：095K1270)，继续孵育5分钟，即刻测定在475nm处的吸光值(Abs)。

计算对酪氨酸酶活性的抑制率：

式中：T-样品管Abs；T₀-样品对照管Abs；C-阴性对照管Abs；C₀-空白对照管Abs。

三、实验结果

实验浓度(mg/ml)	3.04	0.76	0.19	IC50(mg/ml)
					抑制率(％)	98.13	44.11	0	0.818

结论：竹荪提取物具有抑制酪氨酸酶活性的作用，且这种抑制作用与浓度呈依赖关系；在3.04mg/ml的浓度下对酪氨酸酶的抑制率高达98.13％，证实本发明竹荪提取物具有显著美白功效。

试验例2：多巴自身氧化抑制实验

一、实验原理

Dopa(多巴)是皮肤黑素细胞黑素合成中的基础物质，可自身氧化成多巴醌，产生黑素。有些物质可以通过还原作用抑制多巴的氧化或使已生成的多巴醌还原为多巴，从而抑制黑色素形成或淡化黑色素。将被测物质加入到多巴自身氧化的反应体系中，通过检测多巴氧化后形成的黑色素多少，可了解被测物质是否具有还原作用及其作用的程度。

二、实验方法

在样品管和样品对照管中各加入2.0ml对应浓度的竹荪提取物样品溶液(PBS配制)，阴性对照管和空白对照管中以PBS代替。于样品管和阴性对照管内加入2ml的3×10^-3g/ml多巴L-DOPA，样品对照管和空白对照管用PBS代替。混匀，置37℃水浴4小时，在655nm处测定吸光值(Abs)。

计算对多巴自身氧化的抑制率：

式中：T-样品管Abs；T₀-样品对照管Abs；C-阴性对照管Abs；C₀-空白对照管Abs。

三、实验结果

实验浓度(mg/ml)	4.256	2.128	1.064	IC50(mg/ml)
					抑制率(％)	96.12	65.11	21.27	1.741

结论：竹荪提取物具有抑制多巴自身氧化的作用，且这种抑制作用与浓度呈依赖关系；在4.256mg/ml的浓度下对多巴自身氧化的抑制率高达96.12％，证实本发明竹荪提取物具有显著美白功效。

试验例3：B16细胞黑色素淡化实验

一、实验原理

皮肤内黑色素的多少是决定肤色深浅的重要因素，如果某一物质能够减少黑色素细胞内的黑色素合成或淡化已经生成的黑色素，可认为其具有皮肤美白(淡斑)的功效。

二、实验方法

将制备好的B 16细胞(上海医药工业研究院)悬液配制成浓度为5×10³个/ml接种于12孔板内，待细胞贴壁后，阴性对照组每孔加入50ulPBS，样品组每孔加入50ul相应浓度的竹荪提取物样品溶液(PBS配制)，每组设3个复孔，置CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中孵育。96小时后给细胞换上新鲜培养基，并进行第二次加样，方法同上。再次孵育96小时后，消化收集各组细胞，离心，弃去上清液，加入150ul的提取液(1mol/LNaOH+10％DMSO)，吹打均匀，80℃水浴1小时，在405nm处测定各组吸光值(Abs)。

计算对B16细胞黑色素的淡化率：

式中：T-样品组Abs；C-阴性对照组Abs；C₀-空白对照Abs。

三、实验结果

结论：竹荪提取物具有淡化B16细胞内黑色素的作用，在0.266mg/ml的浓度下与阴性对照相比，淡化率达到34.9％，证实本发明竹荪提取物具有显著美白功效。

试验例4：DPPH自由基中和实验

一、实验原理

自由基是一类性质活泼、具有极强氧化能力的化学物质。机体中产生的大量自由基，也对皮肤造成损伤，加速衰老。

DPPH(二苯代苦味酰基自由基)是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使DPPH光吸收减弱，DPPH乙醇溶液退色程度与其接受的电子数呈定量关系，借此可评价物质清除自由基的能力。

二、实验方法

在样品管和样品对照管中各加入2.0ml对应浓度的竹荪提取物样品溶液(蒸馏水配制)，阴性对照管和空白对照管中以蒸馏水代替。样品管和阴性对照管中加入DPPH(购自Sigma公司，批号：115K1319)乙醇溶液0.5ml(20mg/100ml)。补充蒸馏水至各管终体积均为4ml，混匀，静置30分钟后在517nm处测定吸光值(Abs)。

计算对DPPH自由基的清除率：

式中：T-样品管Abs；T₀-样品对照管Abs；C-阴性对照管Abs；C₀-空白对照管Abs。

三、实验结果

实验浓度(mg/ml)	13.3	6.65	3.33	1.66	IC50(mg/ml)
						抑制率(％)	56.46	29.24	21.67	11.72	11.69

结论：竹荪提取物具有清除DPPH自由基的作用，且这种清除作用呈浓度依赖关系，证实本发明竹荪提取物具有抗氧化功效。

试验例5：成纤维细胞增殖实验

一、实验原理

真皮结构的改变是皮肤衰老的主要原因，成纤维细胞是组成真皮层的主要细胞。随着衰老的发生真皮层中的成纤维细胞数量会逐渐减少，皮肤厚度逐渐变薄。因此促进成纤维细胞增殖是解决皮肤衰老问题的重要途径。

活细胞的线粒体脱氢酶能将染料MTT转变为不可溶性的紫色颗粒，后者被DMSO溶解后所呈现的色度反映出活细胞的代谢水平，颜色越深则表示活细胞越多。

二、实验方法

将制备好的人成纤维细胞(取自手术后剩余的正常皮肤，第4～10代)悬液配制成浓度为2.5×10⁴个/ml接种于96孔板内，空白对照组中不接种细胞加入相应体积培养基，待细胞贴壁后，阴性对照组每孔加入20ulPBS，样品组每孔加入20ul相应浓度的竹荪提取物样品溶液(PBS配制)，每组设6个复孔，置培养箱(37℃，5％CO₂)中孵育48小时，然后加人MTT(购自Sigma公司，批号：08797HJ)溶液(PBS配制)20ul，继续在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中孵育4h。取出96孔板，小心吸去每孔内的培养基，加入DMSO，混合均匀。用酶联免疫检测仪测定570nm处的吸光值，通过与阴性对照组的比较得到样品组的相对增殖率。

计算对成纤维细胞的增殖率：

式中：T-样品孔Abs；C-阴性对照孔Abs；C₀-空白对照孔Abs。

三、实验结果

实验浓度(mg/ml)	0.532	0.133
			增殖率(％)	14.78	5.83

结论：竹荪提取物具有促进人成纤维细胞增殖的效果，证实本发明竹荪提取物具有抗衰老功效。

试验例6：透明质酸酶活性抑制实验

一、实验原理

高分子量透明质酸在调节伤口愈合的无疤痕修复中起重要作用，可以明显减少炎症反应。但透明质酸的降解产物可以增加伤口愈合过程中的炎症反应，透明质酸的降解反应取决于透明质酸酶的活性，对透明质酸酶活性的抑制作用，可以作为物质抗炎症反应的指标。同时，由于透明质酸是保湿类护肤品中公认且广泛使用的功效添加原料，对透明质酸酶活性的直接抑制，也可起到协同保湿的功效。

透明质酸酶在酸性环境下，可以将底物透明质酸水解，转化成N-乙酰基葡糖胺。N-乙酰基葡糖胺与二甲基氨基苯甲醛产生呈色反应，根据颜色深浅，确定透明质酸酶的活性大小。

二、实验方法

在样品管和样品对照管中各加入400ul相应浓度的竹荪提取物样品溶液(用pH3.5乙酸缓冲液配制)，阴性对照管和空白对照管中以400ul乙酸缓冲液代替；样品管和阳性对照管内加入50ul(16000U/ml)透明质酸酶溶液(购自Sigma公司，批号：032K7052)混匀，样品对照管和阴性对照管加入等体积乙酸缓冲液混匀，37℃水浴20分钟。各反应管各加入12.5mM氯化钙100ul，37℃水浴20分钟。加入0.24％透明质酸钠(山东福瑞达生物化工有限公司，批号：070591)250ul，37℃水浴40分钟。加入0.4M盐酸100ul和0.4M四硼酸钠100ul，煮沸3分钟，冷却至室温。加入1％二甲基氨基苯甲醛溶液3ml，37℃水浴20分钟，在分光光度计585nm比色测定吸光值(Abs)。

计算对透明质酸酶活性的抑制率：

式中：T-样品管Abs；T₀-样品对照管Abs；C-阴性对照管Abs；C₀-空白对照管Abs。

三、实验结果

实验浓度(mg/ml)	2.66	1.33	0.665
				抑制率(％)	30.08	20.05	8.71

结论：竹荪提取物具有抑制透明质酸酶活性的作用，且这种抑制作用呈浓度依赖关系，证实本发明竹荪提取物具有抗炎症及协同保湿功效。

Claims (11)

1.竹荪提取物在制备美白化妆品、促进细胞增殖化妆品、协同保湿化妆品或抗炎症化妆品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化妆品为霜剂、乳液、溶液剂、膜剂、气雾或喷雾形式。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述竹荪提取物占所述化妆品总重量的0.001％-100％。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述竹荪提取物占所述化妆品总重量的0.01％-50％。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述竹荪提取物占所述化妆品总重量的0.5％-20％。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述竹荪提取物通过以下方法提取得到：以溶剂提取竹荪，过滤，滤液任选经过纯化步骤，制成溶液或挥干溶剂制成干粉。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述溶剂为水或有机溶剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述有机溶剂为醇类或酯类。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述提取步骤选自以下一种或几种：浸提、煎煮、回流和超临界；所述纯化步骤选自以下一种或几种：醇沉、萃取、膜分离和柱层析。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述溶液所含的生药量为1-2000mg/ml。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述溶液所含的生药量为20-1000mg/ml。