KR20110132498A - 패류 유래 기능성 펩티드의 분리 정제 방법 및 기능성 펩티드의 용도 - Google Patents
패류 유래 기능성 펩티드의 분리 정제 방법 및 기능성 펩티드의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 패류 유래 기능성 펩티드의 분리 정제 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 펩티드의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍합, 굴 또는 바지락 유래 단백질 가수분해물의 제조방법과 상기 제조방법에 의해 추출한 단백질 가수분해물, 상기 단백질 가수분해물로부터 항산화, 항암, 항염증 활성을 갖는 기능성 펩티드를 분리 정제하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 패류로부터 보다 뛰어난 수율로 독성이 없는 단백질 가수분해물을 추출할 수 있으며, 본 발명의 단백질 가수분해물은 항산화, 항암 및 항염증 활성을 가지므로 의약품, 건강기능식품의 조성물로 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 막분리공정을 이용하여 상기 단백질 가수분해물로부터 항산화, 항암 또는 항염증 활성을 가지는 기능성 펩티드를 분리 정제하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 펩티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 단백질 가수분해물 또는 기능성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 패류로부터 보다 뛰어난 수율로 독성이 없는 단백질 가수분해물을 추출할 수 있으며, 본 발명의 단백질 가수분해물은 항산화, 항암 및 항염증 활성을 가지므로 의약품, 건강기능식품의 조성물로 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 막분리공정을 이용하여 상기 단백질 가수분해물로부터 항산화, 항암 또는 항염증 활성을 가지는 기능성 펩티드를 분리 정제하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 펩티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 단백질 가수분해물 또는 기능성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 패류 유래 기능성 펩티드의 분리 정제 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 펩티드의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍합, 굴 또는 바지락 유래 단백질 가수분해물의 제조방법과 상기 단백질 가수분해물로부터 막분리공정을 이용하여 항산화, 항암 또는 항염증 활성을 가지는 기능성 펩티드를 분리 정제하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리 정제된 기능성 펩티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 단백질 가수분해물 또는 기능성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품에 관한 것이다.
해양생물은 종의 다양성과 더불어 서식환경의 특이성이라는 요인에 의하여 기존의 육상생물이 보유·생산할 수 없는 화학물질 및 생체 분자들을 함유하고 있으며, 이들의 생합성·분해에 관여하는 특이한 신종 효소와 보조인자들도 존재하고 있어서 신약물질과 새로운 생리 기능성 물질의 소재로서 관심이 집중되고 있다. 더욱이 육상생물을 대상으로 활발히 진행되어 왔던 선도물질의 탐색 및 개발이 한계에 이르기 시작함에 따라 자연히 해양생물로 관심대상이 전환되었다. 미국, 일본, 유럽 등과 같은 해양 선진국들에 의해서 현재까지 밝혀진 해양생물 유래의 항암, 항산화성, 항곰팡이성, 항균성, 항바이러스성, 항염증성을 나타내는 약리활성 물질들이 이미 다수 보고되어 있다. 또한 해양자원으로부터 식량자원의 생산에 관한 연구의 중요성도 점점 증가하고 있다.
일반적으로, 패류(貝類)는 삼면이 바다로 둘러싸인 우리나라의 지역특성에 의해 연안지대에 다양한 종류가 서식하여 예로부터 중요한 식품자원으로 이용되어 온 것으로서, 1990년대 이후부터 패류의 인공양식이 보편화되면서 양식산의 비중이 90%를 상회하게 되고 그 생산량도 매년 신장됨에 따라 어가의 소득증대 및 어촌지역의 고용창출효과 측면 외에도 보다 위생적이고 풍미가 좋은 원료를 안정적으로 공급함과 동시에 패류 특유의 풍미와 영양특성을 살린 고부가가치 가공기술이 수산업 발전을 위한 주요 관심대상이 되고 있다.
특히 최근에는 동식물 단백질을 각종 효소를 이용하여 가수분해 시킨 추출물을 분리 정제하여 이들의 생리활성 검토에 관한 연구가 진행되고 있다. 이 추출물들은 항산화 활성 및 혈압강하 작용이 있다는 것으로 밝혀지면서 피부노화방지 및 고혈압 등의 성인병 예방치료제로서도 이용 가능하다는 결과가 보고되고 있다. 또한, 단백질 가수분해물은 각종 가공식품이나 조미료, 샴푸, 화장품 등 기타 여러 분야에서 필수적으로 이용되고 있다.
그러나 국내에서는 거의 단백질의 산(acid) 가수분해물을 이용하고 있는 실정이며, 단백질을 산이나 알칼리로 가수분해 할 경우 트립토판(tryptophan), 시스테인(cysteine)과 같은 필수 아미노산이 손실될 뿐만 아니라 리지노알라닌(lysinoalanine)과 같은 독성이 있는 부산물이 생성되어 일본을 비롯한 구미 선진국에서는 단백질의 산가수분해물의 안전성 문제가 대두되고 있다.
인간을 포함한 모든 호기성 생물체는 산소를 이용한 에너지 대사 과정에서 항상 발생하는 활성산소의 상해에 대하여 근본적으로는 자기방어 기구를 구비하고 있지만, 조직의 방어능을 초월한 활성산소의 생성은 최근 성인병이라 불리는 관절염, 순환기장애 뿐만 아니라 치매 등과 같은 여러 질환의 원인이 되고 있다.
흔히 유해산소라 불리는 활성산소는 가장 안정한 형태의 산소인 삼중항산소(3O2)가 산화, 환원과정에서 환원되어 생성되는 일중항산소인 슈퍼옥사이드 음이온(Superoxide anion; 1O2 -)과 과산화수소(H2O2), 하이드록실 라디칼(·OH)과 같은 짝짓지 않은 상태의 자유 라디칼로서, 이들은 단백질, DNA, 효소 및 T세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 질환을 일으킨다.
이러한 이유로 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되어 효소계열인 예방적 항산화제인 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase), 카탈라아제(Catalase), 글루타티온퍼옥시다제(Glutathioneperoxidase) 등과 같은 항산화효소와 천연항산화제인 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드(Carotenoid), 글루타티온(Glutathione) 및 합성 항산화제인 부틸히드록시아니졸(t-Butyl-4-hydroxyanisole; BHA) 디부틸히드록시톨루엔(3,5-(t-Butyl)-4-hydroxytoluene; BHT)등 많은 항산화제가 알려져 있으나, 항산화효소는 나이가 들어서 늙어감에 따라 활성산소에 대한 방어능력이 감소되며, 합성 항산화제 경우 그의 변이원성 및 독성이 지적되면서 뛰어난 항산화 효과에도 불구하고 부작용으로 인해 문제시되고 있는 반면, 천연 항산화제는 부작용이 거의 없어 식품첨가물 또는 약품으로 현재 널리 이용되고 있다. 그러나 천연 항산화제 중 가장 널리 이용되는 α-토코페롤의 경우 비싼 가격과 지용성이라는 이용상의 제약으로 대체 천연 항산화제의 개발이 요망되고 있다.
또한 동식물의 단백질을 산이나 각종 효소를 이용하여 가수분해시켜 생산한 올리고펩티드도 항산화활성을 나타낸다고 보고되고 있다. 또한 이들 각종 단백질 가수분해물들은 저항원성, 칼슘흡수 촉진작용 및 항콜레스테롤작용 등의 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 대표적인 단백질 가수분해물로부터 얻어지는 펩티드로는 우유 카제인 펩티드, 난(卵)단백질 펩티드, 어육단백질 펩티드, 대두단백질 펩티드 및 소맥단백질 펩티드 등이 알려져 있다 (未綱, 1989 ; 本井, 1989). 이와 같이 단백질 가수분해물이 갖는 생리활성 작용에 관한 연구는 최근에 큰 관심의 대상이 되고 있고, 영양원으로서 수산물 단백질에 의한 의존도가 높음에도 불구하고 이들의 생리활성 특히, 항산화 효과와 관련이 있는 연구는 미흡한 실정이다.
암은 환경적 요인인 발암원들(carcinogens)에 의한 정상세포들의 변형으로 발생되고, 몸 안의 어느 부위에서도 발생할 수 있다. 암 세포는 일반적으로 성장인자의 신호에 대한 의존도가 낮아 세포증식이 조절되지 않고, 주변세포에 대한 접촉저해가 없으며, 분화의 특징이 결여되어 있다. 그리고 안지오제닉 인자(angiogenic factor)를 분비하여 주위의 조직에 침투, 전이하는 특징을 갖는다.
대부분의 화학적 항암제들은 세포증식에 작용하여 효능을 발휘한다. 하지만 정상세포와 암세포의 증식제어의 차이에 기인한 것은 전무한 상태이므로, 암세포에 대한 선택성이 없어 정상세포에 오히려 독성을 나타내기 때문에 암세포에 대한 선택성이 우수하고 독성이 적으며 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제의 개발이 절실하다. 최근에는 인간에 효능이 뛰어나면서도 독성이 낮은 천연물로부터 항암성분의 탐색과 개발에 관심이 집중되고 있다.
염증반응(inflammation)은 생체 또는 조직에 물리적 작용, 화학적 물질, 세균감염 등의 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이다. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민(histamine), 세로토닌(serotonine), 브라디키닌(bradykinin), 프로스타글란딘(prostaglandins), 히드록실-에이코사테라에노이 산(hydroxyl-eicosatetraenoic acid, HETE) 및 류코트리엔(leukotriene)과 같은 혈관 활성물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 단핵포식세포(mononuclear phagocytes), 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 자연살해세포(NK cell)가 손상부위로 침윤되어 염증을 유발하게 된다.
감염이나 조직손상에 의해 발생하는 적당한 염증은 손상부위가 빠르게 회복되기 위한 정상적인 반응이다. 그러나 장기간에 걸친 지속적인 염증반응은 손상부위에 대한 회복을 지연시키고 주위 세포에 대한 상해를 동반하므로, 주변조직에 대한 방어력을 떨어뜨려 증세를 더욱 악화시킬 수 있어, 정상적인 염증반응을 유지하기 위한 항염증 제제가 필요한 것이다. 현재 일반적으로 사용되는 대부분의 항염증제는 스테로이드계의 약물이나, 스테로이드계의 약물은 인체의 저항성을 약화시키거나 염증 부위의 조직재생을 지연시키는 부작용을 가지고 있어 대체약물의 개발이 필요하다.
따라서 본 발명의 목적은 패류자원으로부터 추출한 단백질 가수분해물의 효과적인 추출방법과 그 방법으로 추출한 항산화, 항암, 항염증 효과를 갖는 단백질 가수분해물을 제공하는 데 있다.
또한 본 발명은 상기 단백질 가수분해물로부터 가장 강력한 항산화, 항암 또는 항염증 효과를 갖는 기능성 펩티드를 분리 정제하는 방법을 제공하며, 상기 기능성 펩티드를 유효성분으로 하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품을 제공하는 데 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 패류로부터 단백질 가수분해물을 제조하는 방법과 상기 단백질 가수분해물로부터 고농도의 기능성 펩티드를 분리 정제하는 방법 및 상기 펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명은 잘게 분쇄한 동결건조 된 패류를 완충액에 용해시킨 후, 상기 용액에 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 가수분해하여 제조하는 단백질 가수분해물의 제조방법을 제공한다.
상기 완충액은 인산염 완충액(phosphate buffer) 또는 글리신-염산 완충액(glycine-HCl beffer)이며, 상기 단백질 가수분해 효소는 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 프로타멕스(Protamex), 알카라제(Alcalase), 파파인(Papain), 알파키모트립신(α-chymotrypsin), 트립신(Trypsin), 펩신(pepsin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 가수분해 단계는 pH 2.0 ~ 9.0의 완충액 중에서 반응온도 30 ~ 80℃, 반응시간 1 ~ 24시간 동안 가수분해 하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 상기 완충액의 pH가 6.0 ~ 9.0, 반응온도는 30 ~ 50℃, 반응시간은 10 ~ 12시간인 것이 좋다.
또한, 상기 단백질 가수분해 효소는 기질 대 효소 비가 5 ~ 500 (w/w)이고, 기질농도는 0.2 ~ 5.0% (w/v)로 첨가하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 기질 대 효소비가 5 ~ 200 (w/w), 기질농도는 0.2 ~ 3.0% (w/v)인 것이 좋다.
본 발명은 상기 제조방법에 의해 패류로부터 추출한 단백질 가수분해물을 제공하며, 본 발명에서 상기 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 상기 단백질 가수분해물로부터 고농도의 기능성 펩티드를 분리 정제하는 방법을 제공하되, (1) 패류 유래 단백질 가수분해물을 TFF(Tangetial Flow Filtration) 시스템에 의해 분자량별로 분리한 후 각 획분의 생리활성을 측정하는 단계; (2) 상기 분리된 획분 중 생리활성이 가장 뛰어난 획분을 크로마토그래피법으로 분리하는 단계; (3) 상기 분리된 각 획분의 생리활성을 측정하는 단계; 및 (4) 상기 분리된 획분 중 생리활성이 가장 뛰어난 획분을 정제하는 단계를 포함하며, 상기 (2) 내지 (4) 단계를 반복 실시하여 단일물질을 정제하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로 본 발명에서 단백질 가수분해물로부터 기능성 펩티드를 분리 정제할 때, 상기 (2) 단계는 1차로 이온교환 크로마토그래피를 실시하고, 2차로 겔 투과 크로마토그래피를 실시하며, 3차로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 실시함으로써 순도 높은 생리 활성 물질을 정제할 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 바람직하게는 상기 이온교환 크로마토그래피는 트리스-염산 완충액(Tris-HCl buffer, pH 8.0)으로 평형을 맞추고 0 ~ 1.0 M의 NaCl을 농도별로 용리시켰으며, 유속은 2.5 ㎖/시간인 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에서 생리활성을 측정하는 단계는 항산화 활성을 측정하는 단계, 항암 활성을 측정하는 단계 및 항염증 활성을 측정하는 단계 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 분리 정제 방법에 의해 분리 정제된 기능성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제, 항암제, 항염증제 및 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 패류 유래 단백질 가수분해물 및 기능성 펩티드는 자유라디칼 소거 활성이 우수하므로 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화, 고혈압, 만성 알코올 중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 간염, 백내장, 당뇨병, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작, 심근경색, 염증, 퇴행성관절염, 류마티스 관절염, 궤양성 대장염, 크론병 등에서 선택되는 1종 이상의 질환을 억제 또는 치료하기 위한 의약품, 건강보조제, 화장료, 식품, 식품 첨가제 등에 유용하게 이용될 수 있으며, 이에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 단백질 가수분해물 및 기능성 펩티드가 의약품으로 이용될 경우에는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형으로 제조될 수 있는데, 이렇게 이루어진 약학조성물을 권리범위로 포함한다. 또한, 상기 약학조성물을 항산화제, 항암제 및/또는 항염증제로 사용하는 의약적 용도 역시 본 발명의 권리범위에 포함된다.
상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드, 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다. 또한 항산화 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질 가수분해물 및 기능성 펩티드가 화장료로 이용될 경우에는 주름개선 및 미백 기능성 화장품, 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 에센스 등의 제형으로 제조될 수 있으며, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 단백질 가수분해물 및 기능성 펩티드을 포함하여 주름개선 및 미백 원료 또는 통상의 화장료 원료로서 이외의 성분들을 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 기존의 방법에 비해 독성이 없는 단백질 가수분해물을 얻을 수 있으며, 높은 수율로 가수분해물을 추출할 수 있다. 또한 본 발명의 패류 유래 단백질 가수분해물은 DPPH 라디칼 소거 효과, 하이드록실 라디칼 소거 효과, 알킬 라디칼 소거 효과, 슈퍼옥사이드 라디칼 소거 효과, 산화적 스트레스로부터 DNA 보호 효과, 산화적 스트레스로부터 세포 사멸 억제 효과가 뛰어나다. 뿐만 아니라 상기 단백질 가수분해물은 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서 암세포 사멸 및 암세포증식 억제 효과를 나타내며, 항염증 효과도 뛰어나다.
또한, 본 발명의 분리 정제 방법에 의해 분리 정제된 기능성 펩티드 역시 뛰어난 항산화, 항암 및 항염증 효과를 나타낸다.
본 발명의 단백질 가수분해물 및 기능성 펩티드는 항산화, 항암 및 상염증 활성을 가지므로 기능성 의약품 및 건강기능식품의 조성물로 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 추출방법에 따르면, 막유화장치와 막반응기를 조합한 막분리공정기술을 이용하여 패류로부터 추출한 지질을 효소로 변형하면 자동화 장치를 구축할 수 있어 이를 이용한 대량 생산 공정이 이루어져 산업적 응용이 가능할 것으로 판단된다. 또한 생체촉매인 효소를 이용하여 패류 추출물의 기능성을 개선함으로써 기능성 물질의 화학적 합성에서 나타나는 문제점으로 거론되는 소재의 안전성 문제를 해결할 수 있다.
도 1은 홍합 단백질 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다. (도 46 내지 도 57에서 1, 플라보자임(Flavourzyme); 2, 뉴트라제(Neutrase); 3, 프로타멕스(Protamex); 4, 알칼라제(Alcalase); 5, 파파인(Papain); 6, 알파키모트립신(α-chymotrypsin); 7, 트립신(Trypsin); 8, 펩신(Pepsin)을 의미한다.)
도 2는 바지락 단백질 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 굴 단백질 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 홍합 단백질 가수분해물의 하이드록실 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 바지락 단백질 가수분해물의 하이드록실 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 굴 단백질 가수분해물의 하이드록실 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 홍합 단백질 가수분해물의 알킬 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 바지락 단백질 가수분해물의 알킬 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9는 굴 단백질 가수분해물의 알킬 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 홍합 단백질 가수분해물의 슈퍼옥사이드 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 바지락 단백질 가수분해물의 슈퍼옥사이드 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 굴 단백질 가수분해물의 슈퍼옥사이드 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 펜톤(Fenton) 반응에서 생성된 하이드록실 라디칼에 의한 플라스미드 DNA의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다(1, 대조군; 2, DNA 손상; 3~5, DNA에 홍합 트립신 가수분해물을 각각 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/㎖ 처리한 것).
도 14는 펜톤(Fenton) 반응에서 생성된 하이드록실 라디칼에 의한 플라스미드 DNA의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다(1, 대조군; 2, DNA 손상; 3~5, DNA에 바지락 α-chymotrypsin 가수분해물을 각각 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/㎖ 처리한 것).
도 15는 펜톤(Fenton) 반응에서 생성된 하이드록실 라디칼에 의한 플라스미드 DNA의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다(1, 대조군; 2, DNA 손상; 3~5, DNA에 굴 파파인 가수분해물을 각각 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/㎖ 처리한 것).
도 16은 홍합 트립신 가수분해물 처리 후 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 보여주는 그래프이다.
도 17은 바지락 알파키모트립신 가수분해물 처리 후 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 보여주는 그래프이다.
도 18은 굴 파파인 가수분해물 처리 후 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 보여주는 그래프이다.
도 19는 홍합 단백질 가수분해물의 유방암 세포 (MDA-MB-231 cells)에서의 항암 효과를 보여주는 그래프이다(도 64 내지 도 72에서 1, 플라보자임(Flavourzyme); 2, 뉴트라제(Neutrase); 3, 프로타멕스(Protamex); 4, 알칼라제(Alcalase); 5, 파파인(Papain); 6, 알파키모트립신(α-chymotrypsin); 7, 트립신(Trypsin); 8, 펩신(Pepsin)을 의미함).
도 20은 바지락 단백질 가수분해물의 유방암 세포 (MDA-MB-231 cells)에서의 항암 효과를 보여주는 그래프이다.
도 21은 굴 단백질 가수분해물의 유방암 세포 (MDA-MB-231 cells)에서의 항암 효과를 보여주는 그래프이다.
도 22는 홍합 단백질 가수분해물의 항염증 효과를 보여주는 그래프이다.
도 23은 바지락 단백질 가수분해물의 항염증 효과를 보여주는 그래프이다.
도 24는 굴 단백질 가수분해물의 항염증 효과를 보여주는 그래프이다.
도 25는 홍합 단백질 가수분해물의 항고혈압 효과를 보여주는 그래프이다.
도 26은 바지락 단백질 가수분해물의 항고혈압 효과를 보여주는 그래프이다.
도 27은 굴 단백질 가수분해물의 항고혈압 효과를 보여주는 그래프이다.
도 28은 홍합 파파인 가수분해 추출물을 TFF 시스템을 이용하여 분자량 별로 구분한 후 각각의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 29는 굴 파파인 가수분해 추출물을 TFF 시스템을 이용하여 분자량 별로 구분한 후 각각의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 30은 바지락 알파키모트립신 가수분해 추출물을 TFF 시스템을 이용하여 분자량 별로 구분한 후 각각의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 31은 홍합 추출물 H-III를 이온 교환 FPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 32는 홍합 추출물 H-III를 이온 교환 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 33은 바지락 추출물 B-III를 이온 교환 FPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 34는 바지락 추출물 B-III를 이온 교환 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 35는 홍합 추출물 H-III-2를 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 36은 홍합 추출물 H-III-2를 겔 투과 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 37은 굴 추출물 G-III를 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 38은 굴 추출물 G-III를 겔 투과 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 39는 바지락 추출물 B-III-2를 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 40은 바지락 추출물 B-III-2를 겔 투과 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 41은 홍합 추출물 H-III-2-A를 1차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 42는 홍합 추출물 H-III-2-A를 1차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 43은 홍합 추출물 H-III-2-A-a를 2차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 44은 홍합 추출물 H-III-2-A-a를 2차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 45는 홍합 추출물 H-III-2-A-a-I을 3차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 46은 홍합 추출물 H-III-2-A-a-I을 3차 HPLC 실시하여 얻은 최종 항산화 펩티드의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 47은 굴 추출물 G-III-1을 1차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 48은 굴 추출물 G-III-1을 1차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 49는 굴 추출물 G-III-1-B를 2차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 50은 굴 추출물 G-III-1-B를 2차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 51은 굴 추출물 G-III-1-B-b를 3차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 52는 굴 추출물 G-III-1-B-b를 3차 HPLC 실시하여 얻은 최종 항산화 펩티드의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 53은 바지락 추출물 B-III-2-B를 1차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 54는 바지락 추출물 B-III-2-B를 1차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 55는 바지락 추출물 B-III-2-B-b를 2차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 56은 바지락 추출물 B-III-2-B-b를 2차 HPLC 실시하여 얻은 최종 항산화 펩티드의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 57은 바지락 알파키모트립신 가수분해 추출물로 TFF 시스템을 실시하여 얻은 분획의 항암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 58은 바지락 추출물 B-III를 이온 교환 FPLC 실시하여 얻은 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 59는 바지락 추출물 B-III를 이온 교환 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 60은 바지락 추출물 B-III-4를 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 61은 바지락 추출물 B-III-4를 겔 투과 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 62는 바지락 추출물 B-III-4-A를 1차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 63은 바지락 추출물 B-III-4-A를 1차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항암 효과를 나타낸 그래프이다.
도 64는 바지락 추출물 B-III-4-A-c를 2차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 65는 바지락 추출물 B-III-4-A-c를 2차 HPLC 실시하여 언은 각각의 분획의 항암 효과를 나타낸 그래프이다.
도 66은 굴 프로타멕스 가수분해 추출물로 TFF 시스템을 실시하여 얻은 각 분획의 산화질소 생성 억제율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 67은 굴 추출물 G-III를 이온 교환 FPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 68은 굴 추출물 G-III를 이온 교환 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항염증 활성을 나타내는 그래프이다.
도 69는 굴 추출물 G-III-1을 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 70은 굴 추출물 G-III-1을 겔 투과 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
도 71은 굴 추출물 G-III-1-A를 1차 HPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 72는 굴 추출물 G-III-1-A를 1차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
도 73은 굴 추출물 G-III-1-A-d를 2차 HPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 74는 굴 추출물 G-III-1-A-d를 2차 HPLC 실시하여 얻은 최종 항염증 펩티드의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 바지락 단백질 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 굴 단백질 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 홍합 단백질 가수분해물의 하이드록실 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 바지락 단백질 가수분해물의 하이드록실 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 굴 단백질 가수분해물의 하이드록실 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 홍합 단백질 가수분해물의 알킬 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 바지락 단백질 가수분해물의 알킬 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9는 굴 단백질 가수분해물의 알킬 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 홍합 단백질 가수분해물의 슈퍼옥사이드 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 바지락 단백질 가수분해물의 슈퍼옥사이드 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 굴 단백질 가수분해물의 슈퍼옥사이드 라디칼 소거 활성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 펜톤(Fenton) 반응에서 생성된 하이드록실 라디칼에 의한 플라스미드 DNA의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다(1, 대조군; 2, DNA 손상; 3~5, DNA에 홍합 트립신 가수분해물을 각각 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/㎖ 처리한 것).
도 14는 펜톤(Fenton) 반응에서 생성된 하이드록실 라디칼에 의한 플라스미드 DNA의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다(1, 대조군; 2, DNA 손상; 3~5, DNA에 바지락 α-chymotrypsin 가수분해물을 각각 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/㎖ 처리한 것).
도 15는 펜톤(Fenton) 반응에서 생성된 하이드록실 라디칼에 의한 플라스미드 DNA의 아가로스 겔 전기영동 패턴을 나타낸다(1, 대조군; 2, DNA 손상; 3~5, DNA에 굴 파파인 가수분해물을 각각 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/㎖ 처리한 것).
도 16은 홍합 트립신 가수분해물 처리 후 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 보여주는 그래프이다.
도 17은 바지락 알파키모트립신 가수분해물 처리 후 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 보여주는 그래프이다.
도 18은 굴 파파인 가수분해물 처리 후 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 보여주는 그래프이다.
도 19는 홍합 단백질 가수분해물의 유방암 세포 (MDA-MB-231 cells)에서의 항암 효과를 보여주는 그래프이다(도 64 내지 도 72에서 1, 플라보자임(Flavourzyme); 2, 뉴트라제(Neutrase); 3, 프로타멕스(Protamex); 4, 알칼라제(Alcalase); 5, 파파인(Papain); 6, 알파키모트립신(α-chymotrypsin); 7, 트립신(Trypsin); 8, 펩신(Pepsin)을 의미함).
도 20은 바지락 단백질 가수분해물의 유방암 세포 (MDA-MB-231 cells)에서의 항암 효과를 보여주는 그래프이다.
도 21은 굴 단백질 가수분해물의 유방암 세포 (MDA-MB-231 cells)에서의 항암 효과를 보여주는 그래프이다.
도 22는 홍합 단백질 가수분해물의 항염증 효과를 보여주는 그래프이다.
도 23은 바지락 단백질 가수분해물의 항염증 효과를 보여주는 그래프이다.
도 24는 굴 단백질 가수분해물의 항염증 효과를 보여주는 그래프이다.
도 25는 홍합 단백질 가수분해물의 항고혈압 효과를 보여주는 그래프이다.
도 26은 바지락 단백질 가수분해물의 항고혈압 효과를 보여주는 그래프이다.
도 27은 굴 단백질 가수분해물의 항고혈압 효과를 보여주는 그래프이다.
도 28은 홍합 파파인 가수분해 추출물을 TFF 시스템을 이용하여 분자량 별로 구분한 후 각각의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 29는 굴 파파인 가수분해 추출물을 TFF 시스템을 이용하여 분자량 별로 구분한 후 각각의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 30은 바지락 알파키모트립신 가수분해 추출물을 TFF 시스템을 이용하여 분자량 별로 구분한 후 각각의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 31은 홍합 추출물 H-III를 이온 교환 FPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 32는 홍합 추출물 H-III를 이온 교환 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 33은 바지락 추출물 B-III를 이온 교환 FPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 34는 바지락 추출물 B-III를 이온 교환 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 35는 홍합 추출물 H-III-2를 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 36은 홍합 추출물 H-III-2를 겔 투과 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 37은 굴 추출물 G-III를 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 38은 굴 추출물 G-III를 겔 투과 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 39는 바지락 추출물 B-III-2를 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 40은 바지락 추출물 B-III-2를 겔 투과 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 41은 홍합 추출물 H-III-2-A를 1차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 42는 홍합 추출물 H-III-2-A를 1차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 43은 홍합 추출물 H-III-2-A-a를 2차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 44은 홍합 추출물 H-III-2-A-a를 2차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 45는 홍합 추출물 H-III-2-A-a-I을 3차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 46은 홍합 추출물 H-III-2-A-a-I을 3차 HPLC 실시하여 얻은 최종 항산화 펩티드의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 47은 굴 추출물 G-III-1을 1차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 48은 굴 추출물 G-III-1을 1차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 49는 굴 추출물 G-III-1-B를 2차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 50은 굴 추출물 G-III-1-B를 2차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 51은 굴 추출물 G-III-1-B-b를 3차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 52는 굴 추출물 G-III-1-B-b를 3차 HPLC 실시하여 얻은 최종 항산화 펩티드의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 53은 바지락 추출물 B-III-2-B를 1차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 54는 바지락 추출물 B-III-2-B를 1차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 55는 바지락 추출물 B-III-2-B-b를 2차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 56은 바지락 추출물 B-III-2-B-b를 2차 HPLC 실시하여 얻은 최종 항산화 펩티드의 하이드록실 라디칼 소거활성을 측정한 그래프이다.
도 57은 바지락 알파키모트립신 가수분해 추출물로 TFF 시스템을 실시하여 얻은 분획의 항암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 58은 바지락 추출물 B-III를 이온 교환 FPLC 실시하여 얻은 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 59는 바지락 추출물 B-III를 이온 교환 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 60은 바지락 추출물 B-III-4를 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 61은 바지락 추출물 B-III-4를 겔 투과 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 62는 바지락 추출물 B-III-4-A를 1차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 63은 바지락 추출물 B-III-4-A를 1차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항암 효과를 나타낸 그래프이다.
도 64는 바지락 추출물 B-III-4-A-c를 2차 HPLC 실시한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 65는 바지락 추출물 B-III-4-A-c를 2차 HPLC 실시하여 언은 각각의 분획의 항암 효과를 나타낸 그래프이다.
도 66은 굴 프로타멕스 가수분해 추출물로 TFF 시스템을 실시하여 얻은 각 분획의 산화질소 생성 억제율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 67은 굴 추출물 G-III를 이온 교환 FPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 68은 굴 추출물 G-III를 이온 교환 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항염증 활성을 나타내는 그래프이다.
도 69는 굴 추출물 G-III-1을 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 70은 굴 추출물 G-III-1을 겔 투과 FPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
도 71은 굴 추출물 G-III-1-A를 1차 HPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 72는 굴 추출물 G-III-1-A를 1차 HPLC 실시하여 얻은 각각의 분획의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
도 73은 굴 추출물 G-III-1-A-d를 2차 HPLC 실시한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 74는 굴 추출물 G-III-1-A-d를 2차 HPLC 실시하여 얻은 최종 항염증 펩티드의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 구체적인 내용을 구체적인 실험예와 실시예를 들어 상세히 설명하고자 한다. 이들 실험예와 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 권리범위는 이들 실험예와 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 홍합, 바지락 및 굴의 단백질 가수분해물의 제조
본 실험에 사용된 홍합, 바지락 및 굴 시료는 여수 수산시장에서 구입하였고, 가수분해 추출물을 제조하기 위해 -20℃에 저장하여 사용하였다. 잘게 분쇄한 동결건조 된 홍합, 바지락 및 굴 각각을 0.1 M 완충액 (buffer, pH 2.0 ~ 8.0)을 동결건조 시료 : 완충액 = 1 : 50 (w/w)의 비율로 첨가한 후, 30분간 150 rpm에서 교반하면서 30 ~ 60℃로 예열한 다음, 단백질 가수분해 효소 : 동결건조 시료 = 1 : 50 (w/w)의 비율로 단백질 가수분해 효소, 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 프로타멕스(Protamex), 알카라제(Alcalase), 파파인(papain), 알파키모트립신(α-chymotrypsin), 트립신(trypsin), 펩신(pepsin) 등을 첨가하여 8시간 동안 180 rpm에서 교반하여 가수분해한 후, 100℃에서 10분간 가열하여 가수분해 반응을 종료시켰다.
반응액은 감압여과로 농축시킨 후, -80℃로 동결건조하여 단백질 가수분해 추출물을 제조하였다. 이때 사용된 효소의 조성 및 반응 조건은 표 1에 나타내었다.
표 1.
단, 상기에서 1)은 인산염 완충액(Phosphate Buffer), 2)는 글리신-염산 완충액(Glycine-HCl Buffer)을 의미한다.
실험예
1 : 홍합, 바지락 및 굴 단백질
가수분해물의
항산화 효과 측정
1. DPPH 라디칼 소거 활성 측정
DPPH(1,1-다이페닐-2-피크릴하이드라질)는 짙은 자주색을 나타내며 그 자체가 질소 중심의 라디칼로서, 라디칼 전자의 비편재화에 의해 안정화된 상태로 존재한다. ESR을 이용한 DPPH 라디칼 소거능 측정법은 다음과 같다. 즉, 메탄올에 용해시킨 60 μM DPPH 60 ㎕ 농도별로 준비한 패류 유래 지질 추출물 60 ㎕를 혼합한 다음, 10초간 격렬하게 vortex하여 2분간 실온에 방치한 후, 모세관(capillary tube)에 옮겨 ESR 스펙트로미터(ESR spectrometer, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)를 이용해 측정하였다. 이때의 ESR 분광계 조건은 다음과 같다. central field, 3475 G; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 2 G; microwave power, 5 mW; gain, 6.3 × 105 및 temperature, 298 K 이었다.
그 결과는 도 1 내지 도 3에 나타내었다. 홍합, 바지락 및 굴 단백질 가수분해물은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼을 소거하였으며, 특히 홍합은 파파인(papain) 가수분해물의 활성이 가장 높았고(IC50 = 0.30 mg/㎖), 바지락도 파파인(papain) 가수분해물의 활성이 가장 높았으며(IC50 = 0.65 mg/㎖), 굴은 알파키모트립신 가수분해물의 활성이 가장 높았다(IC50 = 0.10 mg/㎖).
2. 하이드록실(Hydroxyl) 라디칼 소거 활성 측정
하이드록실 라디칼 소거 활성은 철(Fe) 이온과 과산화수소가 반응하는 펜톤(Fenton) 반응에 의거해 하이드록실 라디칼을 생성시켜 DMPO (5,5-dimethyl-1-pyrolin N-oxide)-OH의 양을 측정하여 하이드록실 라디칼 소거율을 측정하였다. 즉, 홍합, 바지락 및 굴 단백질 가수분해물 0.2 ㎖에 0.3 M의 DMPO 0.2 ㎖, 10 mM의 FeSO4 0.2 ㎖ 및 10 mM의 H2O2 0.2 ㎖를 차례로 첨가한 후, 10초간 강하게 vortex한 다음, 2분간 실온에 방치한 후 모세관에 옮겨 ESR 스펙트로미터를 이용해 측정하였다. 이때의 ESR 스펙트로미터 조건은 다음과 같다. 즉, central field, 3475 G; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 2 G; microwave power, 1 mW; gain, 6.3 × 105 그리고 temperature, 298 K 이다.
그 결과는 도 4 내지 도 6에 나타내었으며, 모든 단백질 가수분해물에서 농도 의존적으로 하이드록실 라디칼을 소거하였다. 특히 홍합은 펩신 가수분해물(IC50 = 0.53 mg/㎖)에서, 바지락은 트립신 가수분해물(IC50 = 0.80 mg/㎖)에서, 굴은 파파인 가수분해물(IC50 = 0.89 mg/㎖)에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
3. 알킬(Alkyl) 라디칼 소거 활성 측정
알킬 라디칼(alkyl radical)은 AAPH(2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 다이하이드로라이드)에 의해 생성되어 POBN(α-(4-프로피닐 1-옥사이드)-N-3가-부틸니트론)과 반응한 양을 측정하였다. 즉, 10 ㎕의 PBS (phosphate buffered saline, 인산염 완충액), 10 ㎕의 농도별 지질 추출물, 10 ㎕의 40 mM AAPH, 10 ㎕의 40 mM POBN을 차례로 첨가한 후, 10초간 격렬하게 vortex 하였다. 이 혼합물을 37℃ 수욕조(water bath)에서 30분간 반응시킨 후, 모세관으로 옮겨 ESR 스펙트로미터로 알킬 라디칼 발생량을 측정하였다. 이때의 ESR 스펙트로미터 조건은 다음과 같다. 즉, central field, 3475 G; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 2 G; microwave power, 10 mW; gain, 6.3 × 105 그리고 temperature, 298 K 이었다.
그 결과는 도 7 내지 도 9에 나타내었으며, 모든 단백질 가수분해물에서 농도 의존적으로 알킬 라디칼을 소거하였다. 특히 홍합은 플라보자임 가수분해물(IC50 = 0.52 mg/㎖)에서, 바지락은 파파인과 펩신 가수분해물(IC50값은 각각 0.50 mg/㎖, 0.49 mg/㎖이었다)에서, 굴은 알파키모트립신 가수분해물(IC50 = 0.89 mg/㎖)에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
4. 슈퍼옥사이드(Superoxide) 라디칼 소거 활성 측정
슈퍼옥사이드 라디칼은 리보플라빈/EDTA 용액상에서 자외선을 쬐었을 때 생성된다. ESR을 이용한 슈퍼옥사이드 라디칼 소거능 측정법은 다음과 같다. 즉, 10 ㎕의 0.8 mM 리보플라민, 10 ㎕의 1.6 mM 에틸렌 다이아민 테트라마스트산(Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)와 농도별로 준비한 단백질 가수분해물 (초순수증류수에 용해) 10 ㎕를 섞은 후 10초간 강하게 vortex한 후 1분간 365 nm의 자외선에 노출시킨 후 모세관에 옮겨 ESR 스펙트로미터에서 측정하였다. 이때의 ESR 스펙트로미터 조건은 다음과 같다. 즉, central field, 3475 G; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude, 2 G; microwave power, 10 mW; gain, 6.3 × 105 그리고 temperature, 298 K 이다.
그 결과는 도 10 내지 도 12에 나타내었으며, 대부분의 단백질 가수분해물에서 농도 의존적으로 슈퍼옥사이드 라디칼을 소거하였다. 특히 홍합은 알파키모트립신 가수분해물(IC50 = 1.43 mg/㎖)에서, 바지락은 펩신 가수분해물(IC50 = 0.63 mg/㎖이었다)에서, 굴은 알파키모트립신(IC50 = 1.0 mg/㎖)에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
실험예 2 : 홍합, 바지락 및 굴 단백질 가수분해물의 최적 추출 조건 측정
홍합, 바지락 및 굴 단백질 가수분해물은 각 시료별로 하이드록실 라디칼 소거 활성이 가장 높았던, 파파인, 알파키모트립신 및 트립신을 사용하여 최고 수율 조건을 확립하였다.
단백질 가수분해 효소에 의한 단백질의 가수분해도는 반응종료 후 반응 혼합물 2 ㎖을 취하고 여기에 20% Trichloro acetic acid (TCA)를 동량 첨가하여 2370×g에서 5분간 원심분리 한 다음, 상층액을 일정량 취하여 Lowry법으로 10% TCA 가용성 질소량을 측정한 후 다음 식으로부터 가수분해도를 계산하였다.
가수분해도 (%) = (10% TCA 가용성 질소량 / 총질소량 ) × 100
1. 단백질 가수분해물의 최적 pH 조건 확립
최적 pH를 결정하기 위해서 pH 3부터 pH 8까지 pH를 변화시키면서 홍합, 바지락 및 굴 동결건조물 2 g을 0.1 M 인산염 완충액 100 ㎖에 분산시켜 2% (w/v) 기질용액으로 만든 다음, 37℃에서 8시간 반응시켰으며, 첨가된 효소량은 기질대 효소비가 50 : 1 (w/w)이 되도록 하여 가수분해도를 측정하였다. 그 결과 홍합은 pH 8.0에서, 바지락은 pH 7.0에서, 굴은 pH 8.0에서 가장 높은 가수분해도를 보였다.
2. 단백질 가수분해물의 최적 온도 조건 확립
최적 온도를 결정하기 위해서 30℃ ~ 80℃로 온도를 변화시키면서 홍합 동결건조물 2 g을, 전 실험에서 결정된 최적 pH에서, 0.1 M 인산염 완충액 100 ㎖에 분산시켜 2% (w/v) 기질용액으로 만든 다음 8시간 반응시켰으며, 첨가된 효소량은 기질대 효소비가 50 : 1 (w/w)이 되도록 하여 최적 온도를 검토한 결과, 홍합, 바지락 및 굴 모두 40℃까지는 가수분해도가 증가하다가 40℃ 이상에서는 가수분해율이 감소하는 경향을 보여 최적 온도를 40℃로 결정하였다.
3. 단백질 가수분해물의 최적 기질 농도 조건 확립
기질에 대한 최적 농도를 결정하기 위해서 0.2% (w/v)부터 5.0% (w/v)까지 기질농도를 변화시키면서 홍합 동결건조물 2 g을, 전 실험에서 결정된 최적 pH, 최적 온도 40℃에서, 0.1 M 인산염 완충액 100 ㎖에 분산시켜 8시간 반응시켰으며, 첨가된 효소량은 기질대 효소비가 50 : 1 (w/w)이 되도록 하여 가수분해도를 측정하였다. 그 결과, 홍합 농도는 1% (w/v)와 2% (w/v)에서 가장 높은 가수분해도를 보여 기질의 효율성을 위해 최적 기질 농도를 1% (w/v)로 결정하였고, 바지락은 농도 2% (w/v)에서 가장 높은 가수분해도를 보였으며, 굴은 농도 1% (w/v)에서 가장 높은 가수분해도를 보였다.
4. 단백질 가수분해물의 최적 기질 대 효소비 조건 확립
기질에 대한 최적 효소비를 결정하기 위해서, 전 실험에서 결정된 최적 pH, 최적 온도 40℃에서, 0.1 M 인산염 완충액 100 ㎖에 홍합 동결건조물 1 g, 바지락 동결건조물 2 g 또는 굴 동결건조물 1 g을 분산시켜 1% (w/v) 또는 2% (w/v) 기질용액으로 만든 다음, 기질 대 효소비를 5에서 500까지 변화시켜 8시간 반응시켰다. 그 결과, 홍합의 경우 기질에 대한 효소 비율 5 ~ 50 (w/w)사이에서 통계적 차이를 보이지 않았으므로 경제성을 고려하여 기질에 대한 최적 효소비율은 50 (w/w)으로 결정되었고, 바지락과 굴의 경우 기질에 대한 효소 비율 5 ~ 100 (w/w)사이에서 통계적 차이를 보이지 않았으므로 경제성을 고려하여 기질에 대한 최적 효소비율은 100 (w/w)으로 결정되었다.
5. 단백질 가수분해물의 최적 반응시간 조건 확립
기질에 대한 효소의 반응시간을 달리 하면서 최적의 가수분해도를 나타내는 시간을 결정하기 위해서, 전 실험에서 결정된 최적 pH, 최적 온도 40℃에서, 홍합 동결건조물 1 g, 바지락 동결건조물 2 g 또는 굴 동결건조물 1 g을 0.1 M 인산염 완충액 100 ㎖에 분산시켜 1, 2, 4, 8, 12, 18 및 24시간 반응시켰으며, 첨가된 효소량은 기질대 효소비가 홍합은 50 : 1 (w/w), 바지락과 굴은 각각 100 : 1 (w/w)이 되도록 하였다. 그 결과, 홍합, 바지락 및 굴의 가수분해도는 8시간에서 최고를 나타내고 있으며 그 이상의 시간으로 가수분해시에는 오히려 그 효율성이 감소하는 것을 볼 수 있다. 따라서 가수분해 시간은 8시간으로 결정되었다.
실험예 3 : 홍합, 바지락 및 굴 단백질 가수분해물의 산화적 스트레스로부터 DNA 보호 효과
홍합, 바지락, 굴 단백질 가수분해 효소 추출물의 프리 라디칼로부터의 DNA 보호능력을 알아보기 위해 플라스미드 DNA를 이용한 전기영동(electrophoresis)을 실시하여 프리 라디칼에 의해 유도된 충격으로부터의 DNA 보호 능력을 측정하였다. 정상 플라스미드 DNA를 전기영동하면 초나선 DNA(supercoiled DNA), 선형 DNA(linear DNA), 고리열림 DNA(open circular DNA)로 나뉘어지며, 초나선 DNA가 가장 많은 양을 차지한다. 여기에 펜톤(Fenton) 반응을 가하여 DNA에 충격을 가하면 DNA는 손실을 입고 초나선 DNA가 고리열림 DNA로 변화하므로, 초나선 DNA양의 감소로 DNA 손실여부를 알 수 있다. 그 실험 방법은 다음과 같다. 즉, 0.5 μg의 pBR 322 DNA, 3 ㎕의 초순수 증류수, 3 ㎕의 2 mM FeSO4, 2 ㎕의 농도별 단백질 가수분해물 및 4 ㎕의 30% H2O2를 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액을 EDTA로 염색된 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 밴드를 관찰하였다.
도 58 내지 60에서 보는 바와 같이, 정산 플라스미드 DNA(레인 1)에 비해서 산화적 스트레스를 받은 DNA 군의 초나선 DNA가 매우 감소한 것을 관찰할 수 있었다(레인 2). 하지만 홍합 트립신 가수분해물(도 13), 바지락 알파키모트립신 가수분해물(도 14) 및 굴 파파인 가수분해물(도 15)을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 초나선 DNA의 함량이 대조군 수준으로 회복되는 것을 관찰할 수 있었다.
실험예 4 : 홍합, 바지락 및 굴 단백질 가수분해물의 산화적 스트레스로 인한 신경세포 사멸 억제 활성
홍합, 바지락, 굴 단백질 가수분해물이 산화스트레스로 인한 신경세포 손상을 억제할 수 있는지 측정하였다. 요오드 프로피디움(propidium iodide, PI)은 자동세포사멸인 아폽토시스를 측정하기 위해 자주 사용되는 형광색소로, DNA와 결합하므로 PI로 염색된 DNA양으로부터 세포사멸과 세포주기를 유추할 수 있다.
구체적으로, 6-well plate에 2.1 × 105개의 신경세포를 접종하고 24시간 뒤에 1 mM H2O2 또는 1 mM H2O2 + 단백질 가수분해물 (각 시료의 하이드록실 라디칼 소거능이 가장 높은 단백질 가수분해물 1종) 을 처리한 후 37℃, CO2 인큐베이터에 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 수확하여 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리후 상층액을 버리고, 인산염 완충액 300 ㎕를 첨가하여 잘 섞어 tween 20 0.5%가 함유된 차가운 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 4℃에서 고정하였다. 24시간 후, 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 후 상층액을 버리고, 여기에 인산염 완충액 1 ㎖을 첨가한 후 잘 섞어서 다시 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하고, 상층액을 버린 다음, 여기에 RNase 10 μg/㎖이 포함된 요오드 프로피디움 용액 (최종농도 50 μg/㎖) 300 ㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 37℃에서 30분 염색하여 유세포 분석기(FACScan, BD Science, USA)에서 세포사멸과 세포주기를 측정하였다.
그 결과를 도 16 내지 도 18에 나타내었다. 즉, H2O2 단독 처리군이 30% 정도의 세포 사멸을 보인데 반해, 홍합 트립신 가수분해물(도 16), 바지락 알파키모트립신 가수분해물(도 17), 굴 파파인 가수분해물(도 18)을 처리한 군에서는 농도의존적으로 세포 사멸이 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 5 : 홍합, 바지락 및 굴 단백질 가수분해물의 항암 효과 측정
패류 유래 지질 추출물이 암을 억제 할 수 있는지를 유방암 세포 MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26), 폐암 세포 A549 (ATCC, CCL-185), 전립선암 세포 PC3 (ATCC, CRL-1435), 간암 세포 HepG2 (ATCC, CCL-13) 등을 요오드 프로피디움(propidium iodide, PI)으로 염색해 측정하였다. 요오드 프로피디움은 자동세포사멸인 아폽토시스를 측정하기 위해 자주 사용되는 형광색소로, DNA와 결합하므로 PI로 염색된 DNA양으로부터 세포사멸과 세포주기를 유추할 수 있었다. 즉, 12-well plate에 적당량의 암 세포를 접종하고 24시간 뒤에 패류 3종의 지질 추출물 0.5 mg/㎖을 처리한 후 37℃, CO2 인큐베이터에 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 수확하여 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리후 상층액을 버리고, 인산염 완충액 300 ㎕를 첨가하여 잘 섞어 tween 20 0.5%가 함유된 차가운 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 4℃에서 고정하였다. 24시간 후, 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 후 상층액을 버리고, 여기에 인산염 완충액 1 ㎖을 첨가한 후 잘 섞어서 다시 4℃, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하고, 상층액을 버린 다음, 여기에 RNase 10 μg/㎖이 포함된 요오드 프로피디움 용액 (최종농도 50 μg/㎖) 300 ㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 37℃에서 30분 염색하여 유세포 분석기(FACScan, BD Science, USA)에서 세포사멸과 세포주기를 측정하였다.
도 19 내지 도 21에서는 홍합, 바지락 및 굴의 유방암세포에서의 사멸효과를 나타내고 있다. 실험결과 유방암 세포뿐만 아니라 폐암 및 전립선암에서도 암세포 사멸효과와 세포 증식 억제 효과를 나타내었다.
실험예 6 : 홍합, 바지락 및 굴 단백질 가수분해물의 항염증 효과 측정
산화질소 (Nitric oxide)는 체내에서 L-아르기닌이 시트룰린을 생성할 때 생성되는 것으로, 과잉 생성시 우리 몸의 산화를 촉진시키는 자유 라디칼(ree radical)로 알려져 있다. 홍합, 바지락 및 굴 유래 지질 추출물의 항염증 효과는 마크로파지 세포 Raw 264.7 에 LPS와 패류 3종의 지질 추출물을 처리하여, 패류 3종의 지질 추출물이 신경세포 내 산화질소 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 즉, 6-well plate에 5 × 105개의 마크로파지 세포를 접종하고 24시간 뒤에 패류 3종 지질 추출물 0.5 mg/㎖과 LPS (Lipopolysaccharide) 1 μg/㎖을 처리한 후 37℃, CO2 인큐베이터에 24시간 동안 반응시켰다. 24시간 후, 각 배지 50 ㎕를 새로운 96-well plate에 옮긴 후 sulfanilamide 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 10분 방치한 다음 여기에 N-(1-나프틸) 에틸렌다이아민 다이하이드로클로라이드 (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride) 50 ㎕를 첨가하고 실온에서 15분 방치하여 550 nm에서 O.D. 값을 측정하였다.
도 22 내지 도 24에서는 홍합, 바지락 및 굴 단백질 가수분해물의 항염증 효과를 나타내고 있는데, 대부분의 단백질 가수분해물에서 산화적 스트레스 물질인 LPS 단독 처리군에 비해 산화질소(NO) 생성량이 감소하였음을 알 수 있다.
실험예 7 : 홍합, 바지락 및 굴 단백질 가수분해물의 항고혈압 효과 측정
항고혈압 활성 지표인 ACE (angiotensin-I converting enzyme)의 저해 활성은 Cushman과 Cheung (1971)의 방법으로 측정하였다. 즉, ACE와 기질인 HHL (Hip-Hip-Leu)이 반응하여 안지오텐신 I(angiotensin I)의 C 말단 다이펩티드(dipeptide, His-Leu)를 가수분해하여 생성된 히푸르산(hippuric acid)을 측정하여 ACE 저해율을 계산하였다. 단백질 가수분해물 50 ㎕에 히푸릴-L-히스티딜-L-류신 (hippuryl-L-histidyl-L-leucine, HHL 25 mg/2.5 ㎖ 0.1 M sodium borate buffer, pH 8.3) 용액 50 ㎕와 0.4 M NaCl이 함유된 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3) 100 ㎕를 가한 후 37℃에서 10분간 pre-incubation 하였다. 여기에 ACE 조효소액 (ACE rabbit lung aceton powder에 10배 가량의 0.1 M sodium borate buffer를 가하여 24시간 교반 후 15,000×g에서 1 시간 원심분리한 상층액) 50 ㎕를 가하고 37℃에서 30분간 반응 후, 1 N HCl 250 ㎕를 넣어 반응을 정지시켰다. 대조군은 단백질 가수분해물 용액 대신 증류수를 사용하였으며, 공시료는 1 N HCl을 먼저 가한 후 ACE 조효소액을 가하였다. 여기에 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 1.5 ㎖을 가하여 15초간 교반한 후 원심분리 (3,290×g, 10 분)하여 상층액 1 ㎖을 취하였다. 상층액은 100℃에서 40분 동안 완전히 건조시킨 후 증류수 1 ㎖을 가하여 용해시켜 228 nm에서 흡광도를 측정하여 아래 계산식에 따라 ACE 저해율 (%)을 나타내었다.
ACE inhibitory activity (%) = 1-{(S1 )-SB2 ))/(C3 )-B4))}×100
단, 상기에서 1)은 Sample (단백질 가수분해물)의 흡광도, 2)는 Sample blank (HCl에 의한 반응정지 후 효소를 넣은 군)의 흡광도, 3)은 Control (Sample 대신 증류수를 넣은 군)의 흡광도, 4)는 Blank의 흡광도를 의미한다.
도 25 내지 도 27에서 홍합, 바지락 및 굴의 항고혈압 활성 결과를 나타내었는데, 홍합에서는 알파키모트립신 가수분해물이 50%에 가까운 ACE 저해 활성, 바지락에서는 펩신 가수분해물이 60% 이상의 ACE 저해 활성, 굴에서는 알파키모트립신 가수분해물이 60% 정도의 ACE 저해 활성을 나타내어 강력한 항고혈압 활성을 나타낸 것으로 보아, 단일물질로 분리 정제 시 더 높은 활성을 나타낼 것으로 사료된다.
실시예 2 : 홍합, 굴, 바지락 유래 효소 가수분해 추출물로부터 항산화 펩티드 소재 분리 및 정제
1. TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용한 분자량별 획분
가수분해추출물을 분획분자량(Molecular Weight Cut Off, MWCO) 기법을 이용하여 분자량 30,000 Da, 10,000 Da, 5,000 Da 별로 구분하는 투과막(membrane)에 통과시킨 후 4가지 분획물을 얻었다.
즉, 30,000 Da 막을 통과하지 못한 것(Ⅰ), 30,000 Da 막은 통과했으나 10,000 Da 막은 통과하지 못한 것(Ⅱ), 10,000 Da 막은 통과했으나 5,000 Da 막은 통과하지 못한 것(Ⅲ) 및 5,000 Da 막을 통과한 것(Ⅳ)으로 구분하여 각각의 하이드록실 라디칼 소거능을 측정하였다.
홍합 파파인 가수분해 추출물, 굴 파파인 가수분해 추출물, 바지락 알파키모트립신 가수분해 추출물로부터 항산화물질을 분리 정제하기 위하여 TFF 시스템을 이용하여 분자량별로 4개의 획분으로 구분하여 하이드록실 라디칼 소거 활성을 측정한 결과를 도 28 내지 도 30에 나타내었다. 그 결과 홍합은 H-III, 굴은 G-III, 바지락은 B-III 획분이 가장 높은 활성을 보였으며, 그 IC50값은 각각 0.532 mg/㎖, 0.697 mg/㎖, 0.778 mg/㎖ 이었다.
2. FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography)를 이용한 분리
TFF 시스템으로 획분한 시료 중 가장 높은 하이드록실 라디칼 소거능을 나타내는 샘플을 선정하여 이온교환 칼럼(ion-exchange column) 및 겔 투과 칼럼(gel permeation column)을 이용하여 이온별, 분자량별 분리를 실시하였다. 트리스-염산 완충액(Tris-HCl buffer, pH. 8.0)를 이용하여 평형화 시킨후 NaCl (0 ~ 1.0 M)을 농도별로 용리시켰으며 이때 유속은 2.5 ㎖/시간이었다. 한편 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography) 후 수집된 각 획분은 투석막을 이용하여 탈염을 실시한 후 동결건조하여 하이드록실 라디칼 소거 활성을 측정한 후 그 중 가장 높은 활성을 보이는 획분을 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography)를 실시하여 획분 별로 동결건조하여 하이드록실 라디칼 소거 활성을 측정한 후 가장 높은 활성을 보이는 획분을 선별하였다.
홍합과 바지락 추출물의 이온 교환 크로마토그래피 결과를 도 31 내지 도 34에 나타내었다. 홍합 추출물 H-III과 바지락 추출물 B-III 모두 4개의 획분으로 나뉘어 졌으며, 그 중 가장 높은 활성을 보인 것은 각각 H-III-2 (IC50 = 0.511 mg/㎖), B-III-2 (IC50 = 0.737 mg/㎖)이다.
앞에서 가장 높은 활성을 보인 각각의 획분을 겔 투과 FPLC 실시한 결과를 도 35 내지 도 40에 나타내었다. 홍합 추출물 H-III-2는 3개, 굴 추출물 G-III은 5개, 바지락 추출물 B-III-2는 3개의 획분으로 나뉘어 졌으며, 그 중 가장 높은 활성을 보인 것은 각각 H-III-2-A (IC50 = 0.485 mg/㎖), G-III-1 (IC50 = 0.685 mg/㎖), B-III-2-B (IC50 = 0.677 mg/㎖)이다.
3. HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용한 분리
FPLC 실시 후 가장 높은 활성을 보이는 획분을 C18 칼럼 (20 × 250 mm)를 장착하여 역상 HPLC(reversed-phase HPLC, RP-HPLC)를 실시하였다. 이때 아세토나이트릴(acetonitrile)을 0 내지 40%로 흘려주었으며 유속은 2.5 ㎖/분이었다. 각 획분을 수집하여 동결건조 후 하이드록실 라디칼 소거 활성을 측정한 후 가장 높은 활성을 보이는 획분은 다시 C18 칼럼 (4.0 × 250 mm)을 장착하여 아세토나이트릴을 0 내지 40%로 흘려주며 RP-HPLC를 실시하였다. 각 획분을 수집하여 동결건조 후 하이드록실 라디칼 활성을 측정한 후 가장 높은 활성을 보이는 획분을 선택하는 과정을 반복하여 단일 물질을 정제하였다.
홍합 추출물의 경우 1차 HPLC에서 3개의 획분을 얻었으며 (도 41), 그 중 H-III-2-A-a가 가장 높은 활성을 보였고, IC50값은 0.438 mg/㎖이었다 (도 42). 2차 HPLC에서는 2개의 획분 (도 43) 중 H-III-2-A-a-I 획분에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, 그 IC50값은 0.324 mg/㎖이었다 (도 44). 3차 HPLC를 실시한 결과 최종 항산화 펩티드를 얻었으며, 그 히스토그램은 도 45에 나타내었다. 최종 항산화 펩티드인 H-III-2-A-a-I-F 획분의 하이드록실 라디칼 소거 활성 능력 측정 결과는 도 46에 나타내였으며, 그 IC50값은 0.267 mg/㎖이었다.
홍합 파파인 가수분해 추출물의 항산화 펩티드 분리 정제 단계별 라디칼 소거 활성 및 수율은 표 2에 나타내었다. 분리 및 정제가 진행될수록 항산화 활성이 높아지는 것을 알 수 있었으며, 최종 정제배수는 3.02였고, 최종 수율은 0.08이었다.
표 2.
굴 추출물의 경우 1차 HPLC에서 4개의 획분을 얻었으며 (도 47), 그 중 G-III-1-B가 가장 높은 활성을 보였고, IC50값은 0.621 mg/㎖이었다 (도 48). 2차 HPLC에서는 4개의 획분 (도 49) 중 G-III-1-B-b 획분에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, 그 IC50값은 0.543 mg/㎖이었다 (도 50). 3차 HPLC를 실시한 결과 최종 항산화 펩티드를 얻었으며, 그 히스토그램은 도 51에 나타내었다. 최종 항산화 펩티드인 G-III-1-B-b-F 획분의 하이드록실 라디칼 소거 활성 능력 측정 결과는 도 52에 나타내였으며, 그 IC50값은 0.412 mg/㎖이었다.
굴 파파인 추출물의 항산화 물질 분리 및 정제 단계별 라디칼 소거 활성 및 수율은 표 3에 나타내었다. 분리 및 정제가 진행될수록 항산화 활성이 높아지는 것을 알 수 있었으며, 최종 정제배수는 1.86배, 최종 수율은 0.02%였다.
표 3.
바지락 추출물의 경우 1차 HPLC에서 4개의 획분을 얻었으며 (도 53), 그 중 B-III-2-B-b가 가장 높은 활성을 보였고, IC50값은 0.661 mg/㎖이었다 (도 54). 2차 HPLC를 실시한 결과 단일 획분을 얻었으며, 그 히스토그램은 도 55에 나타내었다. 최종 항산화 펩티드인 B-III-2-B-b-F 획분의 하이드록실 라디칼 소거 활성 능력 측정 결과는 도 56에 나타내었으며, 그 IC50값은 0.503 mg/㎖이었다.
바지락을 알파키모트립신으로 가수분해시킨 가수분해 추출물의 항산화 펩티드 소재의 분리 정제 단계별 라디칼 소거 활성 및 수율은 표 4에 나타내었다. 분리 및 정제가 진행될수록 항산화 활성이 높아지는 것을 알 수 있었으며, 최종 정제배수는 1.65배, 최종 수율은 0.06%였다.
표 4.
4. Edman 분해법을 이용한 아미노산 서열 분석
정제된 펩티드의 아미노산 서열은 Milligen 6600 protein sequencer (Milligen, Watford, UK)를 이용하여 분석하였다.
실시예 3 : 바지락 유래 효소 가수분해 추출물로부터 항암 펩티드 소재 분리 및 정제
바지락을 알파키모트립신으로 가수분해시킨 가수분해 추출물로부터 항산화 펩티드 소재의 분리 및 정제를 위하여 TFF 시스템을 이용하여 분자량별로 4개의 획분으로 구분하여 항암활성을 측정하였으며 (도 57), 그 4개의 획분 중 B-III이 가장 높은 활성을 보였다.
TFF 방법에 의해 가장 뛰어난 활성을 나타낸 획분인 B-III을 이온교환 FPLC 실시한 결과 총 4개의 획분을 얻었으며, 그 히스토그램은 도 58에 나타내었다. 각 획분을 동결건조하여 항암 활성을 측정한 결과, B-III-4에서 가장 높은 활성을 나타내었다 (도 59).
이온 교환 크로마토그래피법을 사용하여 가장 뛰어난 활성을 나타낸 획분인 B-III-4를 겔 투과 FPLC 실시한 결과 총 3개의 획분을 얻었으며, 그 히스토그램은 도 60에 나타내었다. 각 획분을 동결건조하여 항암 활성을 측정한 결과, B-III-4-A에서 가장 높은 활성을 나타내었다 (도 61).
겔 여과법에 의해 가장 뛰어난 항암 활성을 나타낸 획분인 B-III-4-A를 HPLC방법을 사용하여 정제한 결과 총 3개의 획분을 얻었으며, 그 히스토그램은 도 62에 나타내었고, 각 획분의 항암 활성 측정 결과는 도 63에 나타내었다.
첫 번째 HPLC 방법을 사용하여 가장 뛰어난 활성을 나타낸 획분인 B-III-4-A-c를 두 번째 HPLC를 실시한 결과 총 2개의 획분을 얻었으며, 그 히스토그램은 도 64에 나타내었다. 각 획분을 동결건조하여 항암 활성을 측정한 결과 (도 65), B-III-4-A-c-I에서 가장 높은 활성을 나타내어 최종 항산화 펩티드를 분리할 수 있었다.
본 발명에 있어서, 홍합 및 굴 가수분해 추출물로부터 상기와 같은 방법을 이용하여 항암 펩티드 소재를 분리할 수 있을 것이다.
실시예 4 : 굴 유래 효소 가수분해 추출물로부터 항염증 펩티드 소재 분리 및 정제
굴을 프로타멕스로 가수분해시킨 가수분해 추출물의 항염증 펩티드를 분리 및 정제하기 위하여 TFF 시스템을 이용하여 분자량별로 4개의 획분으로 구분하여 산화질소(NO) 생성 억제율을 측정하였다 (도 66). 4개의 획분 중 G-III이 가장 높은 활성을 보였다.
TFF 방법에서 가장 우수한 항염증 활성을 나타낸 획분인 G-III을 이온교환 FPLC 실시한 결과 총 5개의 획분을 얻었으며, 그 히스토그램은 도 67에 나타내었다. 각 획분을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과 (도 68), G-III-1 획분에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
이온 교환 크로마토 그래피법에 의해 가장 우수한 항염증 활성을 나타낸 획분인 G-III-1을 겔 투과 FPLC법을 실시한 결과 총 3개의 획분을 얻었으며, 그 히스토그램은 도 69에 나타내었다. 각 획분을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과 (도 70), G-III-1-A에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
겔 여과법에 의해 가장 우수한 활성을 나타낸 획분인 G-III-1-A를 HPLC법에 의해 실시한 결과 총 5개의 획분을 얻었으며, 그 히스토그램은 도 71에 나타내었다. 각 획분을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과 (도 72), G-III-1-A-d에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
첫 번째 HPLC방법에 의해 가장 우수한 활성을 나타낸 획분인 G-III-1-A-d를 두 번째 HPLC법에 의해 실시한 결과 최종 획분을 얻었으며, 그 히스토그램은 도 73에 나타내었다. 그 최종 획분을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과를 도 74에 나타내었다.
본 발명에 있어서, 홍합 및 바지락 가수분해 추출물로부터 상기와 같은 방법을 이용하여 항암 펩티드 소재를 분리할 수 있을 것이다.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (19)
- (1) 패류를 완충액 중에 용해시키는 단계; 및
(2) 상기 용액에 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 가수분해 하는 단계;
를 포함하는 패류 유래 단백질 가수분해물의 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 패류는 홍합, 바지락 및 굴로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 패류 유래 단백질 가수분해물의 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 완충액은 인산염 완충액(Phosphate buffer) 또는 글리신-염산 완충액(Glycine-HCl buffer) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 패류 유래 단백질 가수분해물의 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 단백질 가수분해 효소는 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 프로타멕스(Protamex), 알카라제(Alcalase), 파파인(Papain), 알파키모트립신(α-chymotrypsin), 트립신(Trypsin), 펩신(pepsin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 패류 유래 단백질 가수분해물의 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 가수분해 단계는 pH 2.0 ~ 9.0의 완충액 중에서 반응온도 30 ~ 80℃, 반응시간 1 ~ 24시간 동안 가수분해하는 것을 특징으로 하는 패류 유래 단백질 가수분해물의 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 단백질 가수분해 효소는 기질 대 효소비가 5 ~ 500 (w/w), 기질농도는 0.2 ~ 5.0% (w/v)로 첨가하는 것을 특징으로 하는 패류 유래 단백질 가수분해물의 제조방법. - 제 5항에 있어서,
상기 완충액의 pH가 6.0 ~ 9.0이고, 반응온도는 30 ~ 50℃, 반응시간은 10 ~ 12시간인 것을 특징으로 하는 패류 유래 단백질 가수분해물의 제조방법. - 제 6항에 있어서,
상기 기질 대 효소비는 5 ~ 200 (w/w), 기질농도는 0.2 ~ 3.0% (w/v)인 것을 특징으로 하는 패류 유래 단백질 가수분해물의 제조방법. - 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제조방법에 의해 추출된 패류 유래 단백질 가수분해물. - 제 9항의 패류 유래 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화제.
- 제 9항의 패류 유래 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항암제.
- 제 9항의 패류 유래 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항염증제.
- 제 9항의 패류 유래 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품.
- (1) 패류 유래 단백질 가수분해물을 TFF(Tangential Flow Filtration) 시스템으로 분자량별로 분리한 후 각 획분의 생리활성을 측정하는 단계;
(2) 상기 분리된 획분 중 생리활성이 가장 뛰어난 획분을 크로마토그래피법으로 분리하는 단계;
(3) 상기 분리된 각 획분의 생리활성을 측정하는 단계; 및
(4) 상기 분리된 획분 중 생리활성이 가장 뛰어난 획분을 정제하는 단계;
를 포함하며, 상기 (2) 내지 (4) 단계를 반복 실시하여 단일물질을 정제하는 것을 특징으로 하는 패류 유래 기능성 펩티드의 분리 정제 방법. - 제 14항에 있어서,
상기 (2) 단계는 1차로 이온교환 크로마토그래피를 실시하고, 2차로 겔 투과 크로마토그래피를 실시하며, 3차로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 실시하는 것을 특징으로 하는 패류 유래 기능성 펩티드의 분리 정제 방법. - 제 15항의 방법으로 분리 정제된 패류 유래 기능성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제.
- 제 15항의 방법으로 분리 정제된 패류 유래 기능성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항암제.
- 제 15항의 방법으로 분리 정제된 패류 유래 기능성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항염증제.
- 제 15항의 방법으로 분리 정제된 패류 유래 기능성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품.
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