CN113444162A - 具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用 - Google Patents

具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用,属于生物技术领域。该小肽的氨基酸序列为APEPEPAF。该小肽的制备方法包括:将麦胚蛋白通过模拟胃肠道消化得到蛋白消化产物;取所述蛋白消化产物进行超滤膜分离得到组分Ⅰ(>3KDa)、Ⅱ(1~3KDa)和Ⅲ(<1KDa),筛选得到抗炎活性组分Ⅲ,最终进行LC‑MS/MS多肽鉴定得到所述小肽。本发明小肽具有较强抗炎活性,来源于麦胚蛋白,具有安全、高效、制备方法简单重复性好的特点,在食品、医药等领域有广阔前景,可以应用于制备预防及治疗肠炎的药物或功能性食品。

Description

具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用。
背景技术
炎症属于适应性免疫反应,它是宿主针对损伤组织或传染性病原体的防御。炎症与多种疾病密切相关,尤其是慢性炎症,这些疾病包括哮喘、炎症性肠病、癌症、II型糖尿病、脂质代谢紊乱疾病、心血管疾病(如高血压、高血脂)和中枢神经系统相关病症(如帕金森病和认知障碍)。这些慢性炎症性疾病的发病率逐年增加,已经成为全世界普遍关注的健康危害。炎症是宿主对损伤因子刺激而产生的一种正常防御反应,它是由多种细胞(比如巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞等)、多因素(信号转导和转录激活因子、血管活性胺、细胞因子、趋化因子、炎症相关酶类)参与的复杂调控过程。
小麦胚芽是小麦加工副产物,富含多种营养物质,是天然的植物蛋白,产量丰富,来源广泛。现有技术中缺乏来源于天然物质,安全性高、抗炎活性强的小肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较强抗炎活性的小肽,来源于麦胚蛋白,具有安全性高、来源广泛的特点。
本发明的另一目的是提供上述小肽的制备方法,该方法简单,安全,高效,重复性好。
本发明的又一目的是提供该小肽在制备具有抗炎活性的药物、化妆品或功能性食品中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现:
一种具有抗炎活性的小肽,其氨基酸序列如SEQ IN NO:1所示。
本发明还提供所述小肽的制备方法,包括如下步骤:(1)将麦胚蛋白通过模拟胃肠道消化,得到蛋白消化产物;(2)取所述蛋白消化产物进行超滤膜分离,取分子量小于1KDa的组分,得到所述小肽。
在本发明中,步骤(1)中所述麦胚蛋白是采用碱提酸沉法从脱脂后的麦胚粉中提取所得。
在本发明中,步骤(1)中所述采用模拟胃肠道消化手段来水解麦胚蛋白,包括如下步骤:将麦胚蛋白先用胃蛋白酶消化,再用胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶进行消化。
在本发明中,胃蛋白酶消化时间为3-5h,胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶化时间为5-7h。
在本发明中,步骤(2)中所述超滤膜孔径为1KDa。
本发明还提供所述小肽在制备具有抗炎活性的药物、化妆品或功能性食品中的应用以及含有所述小肽的药物、化妆品或功能性食品。
该小肽能够降低炎症因子的分泌量,可用于预防及治疗肠炎的药物或功能性食品。本发明小肽从麦胚蛋白中分离,通过体外LPS诱导的巨噬细胞NO的含量以及炎症因子的分泌量测定得出,氨基酸序列如SEQ IN NO:1所示的小肽不仅对巨噬细胞增殖活性无影响,而且能够降低LPS诱导的巨噬细胞促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌,提高IL-10抗炎因子分泌,因此具有强抗炎活性,可以应用于制备具有抗炎活性的药物、化妆品或功能性产品中,在食品、医药及化妆品领域具有广阔的前景。本发明小肽,来源于麦胚蛋白,因此安全性较高,其制备方法简单,容易操作,来源广泛。
附图说明
图1为麦胚蛋白在不同消化时间的水解度的变化,横坐标为消化时间,纵坐标为水解度。
图2为WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ和WGPH-Ⅲ对RAW 264.7巨噬细胞增殖活力的影响。其中对照组是指对照孔,WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ、WGPH-Ⅲ分别指加入WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ或WGPH-Ⅲ的样品孔。
图3为WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ、WGPH-Ⅲ对LPS诱导的RAW264.7 NO产生的影响。其中空白组为空白孔,LPS模型组为模型孔,WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ、WGPH-Ⅲ分别为加入WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ或WGPH-Ⅲ的加样组。其中##表示与空白孔相比有极显著差异(p<0.01),**表示与模型孔相比具有极显著差异(p<0.01)下同。
图4为APEPEPAF的二级质谱图,其中横坐标表示离子的质荷比值(m/z),纵坐标表示离子流的强度。
图5为小肽APEPEPAF对RAW264.7分泌炎症因子的影响,其中control表示空白孔,LPS表示LPS模型孔,LPS+各浓度P1表示LPS诱导细胞并用各浓度小肽APEPEPAF干预的样品孔(P1是小肽APEPEPAF的缩写),LPS+DEX表示阳性孔。其中#表示LPS模型孔与空白孔相比具有显著差异(p<0.05),##表示LPS模型孔与空白孔相比有极显著差异(p<0.01),*表示样品孔或阳性孔与LPS模型孔相比具有显著差异(p<0.05),**表示样品孔或阳性孔与LPS模型孔相比具有极显著差异(p<0.01)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
1.材料:实验所用的麦胚蛋白小肽由金斯瑞生物科技有限公司根据LC-MS/MS鉴定结果利用FlexPeptideTM多肽合成技术合成,序列为:APEPEPAF。胰蛋白酶(2500U/mg)生工生物有限公司;胃蛋白酶(3000U/mg)索莱宝生物有限公司;RAW 264.7细胞株(北京市疾控中心);胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养液、Penicillin-Streptomycin(100×)、TrypsinEDTA(0.05%)、Hank平衡盐溶液(HBSS,美国Gibco公司);荧光探针DCFH-DA、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司);NO试剂盒、ELISA试剂盒(TNF-α,IL-1,IL-6,and IL-10)、微量蛋白含量测定(BCA法)试剂盒(南京建成生物工程研究所);其他试剂均为国产分析纯。
2.主要仪器与设备:生物安全柜(Thermo Fisher(中国)公司);MZE多功能酶标仪(Molecular Devices(美国)公司);SL16R台式离心机(Thermo Fisher(中国)公司);二氧化碳培养箱(Thermo Fisher(中国)公司);荧光显微镜(德国卡尔蔡司有限公司)。
实施例1制备具有抗炎活性的小肽
(1)麦胚蛋白的提取:将采用正己烷脱脂后的小麦胚芽,用粉碎机粉碎后过100目筛,取筛下部分,得到小麦胚芽粉。在50g小麦胚芽粉中,加入500mL蒸馏水,加入NaCl水溶液100mL(含有5g NaCl),用NaOH水溶液调pH值至9.0,用磁力搅拌器搅拌30min,再于4℃、5000r/min离心10min,取上清液并用盐酸调节pH值至4.0,待出现大片白色沉淀后,离心10min,取沉淀,并用蒸馏水溶解、用NaOH水溶液调pH值至7,透析脱盐后,真空冷冻干燥得麦胚蛋白粉,并储存在-20℃的进一步使用。
(2)麦胚蛋白模拟胃肠道消化:首先用去离子水溶解麦胚蛋白粉,搅拌均匀,得到质量百分浓度为8%的麦胚蛋白溶液。将麦胚蛋白溶液在95℃水浴中加热30min,调节pH至7.0,使蛋白质完全变性。将完全变性后的麦胚蛋白溶液用盐酸调节pH为2.0,加入麦胚蛋白质量0.4%的胃蛋白酶(3000U/mg;索莱宝生物有限公司,Cat.No.P8390),在37℃下消化4h。然后,用氢氧化钠水溶液将pH值调为7.6,加入麦胚蛋白质量0.3%的胰蛋白酶(购自生工生物有限公司,Cat.No.T0785,2500U/mg),然后加入麦胚蛋白质量0.1%的α-胰凝乳蛋白酶(购自索莱宝生物有限公司,Cat.No.C8660,1200U/mg),在37℃下消化6h。消化过程中,每隔1h采集一次样品,测定其水解度(DH)和肽得率。10h后,将消化水解后的溶液冷却至室温,以5000r/min离心20min,收集上清液,透析脱盐,真空冷冻干燥后,得到麦胚蛋白消化产物。
结果显示如图1所示,麦胚蛋白模拟胃肠道消化过程中,随着消化时间的增加,麦胚蛋白水解度整体呈上升趋势;在模拟胃消化阶段(胃蛋白酶),麦胚蛋白开始水解,0~4h的水解度在1.96%~6.87%之间;在模拟肠消化阶段添加胰蛋白酶和α-糜蛋白酶后,水解度急剧增加,然后水解度增加缓慢,趋于稳定,DH最终达到13.08%。
(3)麦胚蛋白消化产物Ⅲ的分离纯化:选用截流分子量为3KDa和1KDa的超滤膜。用浓度为0.1M、pH7.6的磷酸盐缓冲液将麦胚蛋白消化产物配成质量百分浓度为0.1%的溶液,用0.45μm的纤维素膜过滤除去不溶物。将麦胚蛋白消化产物溶液,采用Labscale小型切向流超滤系统进行分离,首先选用截流分子量为3KDa的超滤膜进行分离,得到分子量大于3KDa的组分(记为组分WGPH-I)和分子量小于等于3KDa的组分,然后将分子量小于等于3KDa的组分继续用截流分子量为1KDa的超滤膜进行分离,得到分子量大于等于1KDa小于等于3KDa的组分(记为组分WGPH-II)和分子量小于1KDa的组分(记为组分WGPH-III)。超滤时,调节泵的压力为0.2MPa,超滤温度为4℃。
将超滤后获得的不同分子量的组分WGPH-Ⅰ(>3KDa)、WGPH-II(1~3KDa)和WGPH-III(<1KDa)脱盐、冷冻干燥,检测各组分对正常巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响;另外,通过检测各组分WGPH-Ⅰ(>3KDa)、WGPH-II(1~3KDa)和WGPH-III(<1KDa)对LPS诱导的RAW264.7中NO产生的影响,来评价小肽的抗炎活性。
(4)噻唑蓝(MTT)法检测各组分(WGPH-I、WGPH-II和WGPH-III)对正常巨噬细胞RAW264.7增殖活力的影响
取对数生长期的巨噬细胞RAW 264.7,用含10%FBS的RPIM 1640培养液配置成3×104个/mL的细胞悬浮液。在96孔板中设置样品孔,每个样品孔中加入100μL细胞悬浮液,在细胞培养箱中培养12h使细胞贴壁。除去样品孔中的培养液后,将不同组分WGPH-Ⅰ(>3KDa)、WGPH-II(1~3KDa)和WGPH-III(<1KDa)分别溶解于含10%FBS的RPIM 1640培养液中,制成不同浓度的小肽培养液(0、50、100、200、300μg/mL),再加入各样品孔中,每孔100μL体积;设空白孔,与样品孔相比,无细胞,以100μL的PBS替代小肽培养液;设置对照孔,与样品孔相比,有细胞,但是以100μL的PBS替代小肽培养液。将96孔板在37℃培养箱中培养2h后,每孔中加入1μg/mL的LPS水溶液10μL。继续培养24h后,然后每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL),然后培养4h后,除去96孔板中的溶液,每孔加入50μL的DMSO,37℃恒温振荡箱中振荡20min,在酶标仪中570nm波长下测吸光度。
细胞增殖活力=(OD样品孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100%。
结果如图2所示,在各小肽处理24h后,随着小肽浓度的增加,吸光度没有显著性差异,表明不同组分WGPH-Ⅰ(>3KDa),WGPH-II(1~3KDa),WGPH-III(<1KDa)对巨噬细胞的活性并无影响,说明组分WGPH-Ⅰ、WGPH-II和WGPH-III安全性较好。
(5)Griess方法检测LPS诱导的RAW264.7中NO含量
各组分WGPH-Ⅰ、WGPH-II和WGPH-III对LPS诱导的RAW264.7中NO分泌量的影响,采用一氧化氮检测试剂盒(南京碧云天公司)来进行检测,具体步骤如下:取对数生长期的巨噬细胞RAW 264.7,用含有10%(体积百分浓度)FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养液配置成3×104个细胞/mL的细胞悬浮液。在96孔板中设置样品孔,每个样品孔中加入100μL细胞悬浮液,在CO2培养箱中培养12h使细胞贴壁,除去样品孔中培养液后,各样品孔中分别加入100μL不同浓度(0,20,80,320μM)的小肽培养液。在96孔板中设置对照孔和模型孔,与样品孔相比,不同之处仅在于以相同体积的PBS替代小肽培养液。将96孔板在37℃培养箱中培养2h后,样品孔和模型孔的每孔中加入1μg/mL的LPS(脂多糖,美国Sigma公司)水溶液10μL,在37℃培养箱中恒温培养24h,空白孔中不加入LPS水溶液。从96孔板的每个孔中吸取上清液50μL,转移到另一个96孔板的各孔中,然后,每孔中依次加入一氧化氮检测试剂盒中的GriessI和Griess II两种溶液,混匀后。采用酶标仪在540nm下的检测吸光度值后换算成NO摩尔浓度。其中不同浓度(0,20,80,320μM)的小肽培养液是将小肽溶解于含有10%(体积百分浓度)FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养液后所得。
结果如图3所示,组分WGPH-II和WGPH-Ⅰ干预的细胞中NO浓度与模型孔相比无显著性差异;组分WGPH-III干预的细胞中NO浓度明显降低,且具有显著性差异,说明组分WGPH-III能够显著降低LPS诱导的巨噬细胞NO的分泌,具有一定的抗炎活性。
(6)结构鉴定:采用LC-MS/MS检测组分WGPH-III中的活性组分纯度及氨基酸序列。将组分WGPH-III冷冻干燥,得到组分WGPH-III的冻干粉。将组分WGPH-III的冻干粉溶于去离子水,配制成浓度为20μg/ml的蛋白溶液。流动相A是质量百分浓度为0.1%的甲酸水溶液,B是质量百分浓度为0.1%的甲酸的乙腈溶液,选用BEH C18色谱柱。洗脱程序为:0-5min,流动相A 100~85%线性降低,流动相B 0~15%线性升高;5~10min,流动相A 85~100%线性升高,流动相B15%~0线性降低。洗脱程序中的百分数为体积百分浓度。样品经过液相色谱分离系统后,再由质谱系统将肽段打成不同分子量的碎片,并由质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器检测得到质谱图,实验结果如图4。分析质谱图,发现组分WGPH-III中的活性组分为氨基酸序列为APEPEPAF的小肽,分子量856.92Da,质量百分数大于等于98%。
(7)测定小肽APEPEPAF的抗炎活性
由金斯瑞生物科技有限公司利用FlexPeptideTM多肽合成技术合成小肽APEPEPAF(序列如SEQ ID NO:1所示),用于以下实验。
检测小肽APEPEPAF干预对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7中炎症因子的影响,具体检测方法包括如下步骤:取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7,用含有10%(体积百分浓度)FBS的RPMI 1640培养液配置成3×104个细胞/mL的细胞悬浮液。在24孔板中设置样品孔,每个样品孔中加入400μL上述细胞悬浮液,在CO2培养箱中培养12h使细胞贴壁,分别加入不同浓度(0,20,80,320μM)的小肽培养液;在该24孔板中还设有空白孔、LPS模型孔和阳性孔,其中空白孔和LPS模型孔与样品孔相比,不同之处仅在于不添加小肽培养液;阳性孔与样品孔相比,不同之处仅在于以含有100μM的DEX(地塞米松)的培养液(溶剂为含有10%FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养液)替代小肽培养液。然后将该24孔板在培养箱中培养2h后,在样品孔、LPS模型孔和阳性孔的各孔中加入1μg/mL的LPS溶液10μL,空白孔中不加,然后在培养箱中恒温放置24h。采用ELISA试剂盒(TNF-α,IL-1,IL-6,and IL-10)(杭州联科生物技术股份有限公司)检测各炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量。其中不同浓度(0,20,80,320μM)的小肽培养液是将小肽溶解于含有10%(体积百分浓度)FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养液后所得。
结果如图5所示,320μM的小肽干预的细胞中,IL-6浓度为LPS模型孔细胞的79.19%;IL-1β浓度为LPS模型孔细胞的78.91%;TNF-α浓度为LPS模型孔细胞的61.36%;IL-10抗炎因子浓度为LPS模型孔细胞的1.14倍;320μM的小肽干预的细胞与阳性药物地塞米松干预的细胞相比,IL-6,IL-1β和TNF-α的浓度分别为阳性孔的94%、98%和95%,IL-10浓度为阳性组的1.01倍。
与空白孔相比,LPS诱导细胞后,其促炎因子IL-6,TNF-α和IL-1β的分泌显著升高(p<0.05),但当小肽APEPEPAF用不同浓度干预后,与LPS模型孔相比,促炎因子IL-6,TNF-α和IL-1β的分泌显著得到抑制(p<0.05)。IL-10在LPS处理后与空白孔相比分泌量显著增加(p<0.05),小肽APEPEPAF加样浓度20μM的处理下,与LPS模型孔相比没有显著性差异(p>0.05);当加样浓度为80μM和320μM时,IL-10的分泌有增长的趋势,且与LPS模型孔有极显著性差异(p<0.01)。故结果表明,小肽APEPEPAF能够降低LPS诱导的巨噬细胞促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌,提高IL-10抗炎因子分泌。
综上所述,本发明小肽APEPEPAF具有良好的抗炎活性,能够降低LPS诱导的RAW264.7炎症因子的分泌,提高IL-10抗炎因子分泌。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京财经大学
<120> 具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用
<130> 202107072
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 小麦胚芽
<400> 1
Ala Pro Glu Pro Glu Pro Ala Phe
1 5

Claims (8)

1.一种具有抗炎活性的小肽,其氨基酸序列如SEQ IN NO:1所示。
2.权利要求1所述小肽的制备方法,其特征在于如下步骤:(1)将麦胚蛋白通过模拟胃肠道消化,得到蛋白消化产物;(2)取所述蛋白消化产物进行超滤膜分离,取分子量小于1KDa的组分Ⅰ,得到所述小肽。
3.根据权利要求2所述制备方法,其特征在于步骤(1)中所述麦胚蛋白是采用碱提酸沉法从脱脂后的麦胚粉中提取所得。
4.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于步骤(1)中所述采用模拟胃肠道消化手段来水解麦胚蛋白,包括如下步骤:将麦胚蛋白先用胃蛋白酶消化,再用胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶进行消化。
5.根据权利要求4所述制备方法,其特征在于胃蛋白酶消化时间为3-5h,胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶化时间为5-7h。
6.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于步骤(2)中所述超滤膜孔径为1KDa。
7.权利要求1所述小肽在制备具有抗炎活性的药物、化妆品或功能性食品中的应用。
8.含有权利要求1所述小肽的药物、化妆品或功能性食品。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115947778A (zh) * 2022-09-07 2023-04-11 南京中医药大学 一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用
CN116813699A (zh) * 2023-07-04 2023-09-29 杭州佰倍优生物科技有限公司 一种卵白蛋白抗炎肽及其应用
CN117069798A (zh) * 2023-08-21 2023-11-17 南京财经大学 一种抗炎活性的藜麦小肽及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104788541A (zh) * 2015-05-07 2015-07-22 南京财经大学 具有抗氧化活性的小肽、制备方法及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108165595A (zh) * 2017-12-28 2018-06-15 杭州恒天面粉集团有限公司 一种小麦胚芽抗氧化肽的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104788541A (zh) * 2015-05-07 2015-07-22 南京财经大学 具有抗氧化活性的小肽、制备方法及其应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115947778A (zh) * 2022-09-07 2023-04-11 南京中医药大学 一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用
CN115947778B (zh) * 2022-09-07 2023-12-08 南京中医药大学 一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用
CN116813699A (zh) * 2023-07-04 2023-09-29 杭州佰倍优生物科技有限公司 一种卵白蛋白抗炎肽及其应用
CN116813699B (zh) * 2023-07-04 2024-04-26 杭州佰倍优生物科技有限公司 一种卵白蛋白抗炎肽及其应用
CN117069798A (zh) * 2023-08-21 2023-11-17 南京财经大学 一种抗炎活性的藜麦小肽及其制备方法和应用
CN117069798B (zh) * 2023-08-21 2024-05-24 南京财经大学 一种抗炎活性的藜麦小肽及其制备方法和应用

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