CN113444162A - 具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用，属于生物技术领域。该小肽的氨基酸序列为APEPEPAF。该小肽的制备方法包括：将麦胚蛋白通过模拟胃肠道消化得到蛋白消化产物；取所述蛋白消化产物进行超滤膜分离得到组分Ⅰ(>3KDa)、Ⅱ(1~3KDa)和Ⅲ(<1KDa)，筛选得到抗炎活性组分Ⅲ，最终进行LC‑MS/MS多肽鉴定得到所述小肽。本发明小肽具有较强抗炎活性，来源于麦胚蛋白，具有安全、高效、制备方法简单重复性好的特点，在食品、医药等领域有广阔前景，可以应用于制备预防及治疗肠炎的药物或功能性食品。

Description

具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用。

背景技术

炎症属于适应性免疫反应，它是宿主针对损伤组织或传染性病原体的防御。炎症与多种疾病密切相关，尤其是慢性炎症，这些疾病包括哮喘、炎症性肠病、癌症、II型糖尿病、脂质代谢紊乱疾病、心血管疾病(如高血压、高血脂)和中枢神经系统相关病症(如帕金森病和认知障碍)。这些慢性炎症性疾病的发病率逐年增加，已经成为全世界普遍关注的健康危害。炎症是宿主对损伤因子刺激而产生的一种正常防御反应，它是由多种细胞(比如巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞等)、多因素(信号转导和转录激活因子、血管活性胺、细胞因子、趋化因子、炎症相关酶类)参与的复杂调控过程。

小麦胚芽是小麦加工副产物，富含多种营养物质，是天然的植物蛋白，产量丰富，来源广泛。现有技术中缺乏来源于天然物质，安全性高、抗炎活性强的小肽。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较强抗炎活性的小肽，来源于麦胚蛋白，具有安全性高、来源广泛的特点。

本发明的另一目的是提供上述小肽的制备方法，该方法简单，安全，高效，重复性好。

本发明的又一目的是提供该小肽在制备具有抗炎活性的药物、化妆品或功能性食品中的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种具有抗炎活性的小肽，其氨基酸序列如SEQ IN NO:1所示。

本发明还提供所述小肽的制备方法，包括如下步骤：(1)将麦胚蛋白通过模拟胃肠道消化，得到蛋白消化产物；(2)取所述蛋白消化产物进行超滤膜分离，取分子量小于1KDa的组分，得到所述小肽。

在本发明中，步骤(1)中所述麦胚蛋白是采用碱提酸沉法从脱脂后的麦胚粉中提取所得。

在本发明中，步骤(1)中所述采用模拟胃肠道消化手段来水解麦胚蛋白，包括如下步骤：将麦胚蛋白先用胃蛋白酶消化，再用胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶进行消化。

在本发明中，胃蛋白酶消化时间为3-5h，胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶化时间为5-7h。

在本发明中，步骤(2)中所述超滤膜孔径为1KDa。

本发明还提供所述小肽在制备具有抗炎活性的药物、化妆品或功能性食品中的应用以及含有所述小肽的药物、化妆品或功能性食品。

该小肽能够降低炎症因子的分泌量，可用于预防及治疗肠炎的药物或功能性食品。本发明小肽从麦胚蛋白中分离，通过体外LPS诱导的巨噬细胞NO的含量以及炎症因子的分泌量测定得出，氨基酸序列如SEQ IN NO:1所示的小肽不仅对巨噬细胞增殖活性无影响，而且能够降低LPS诱导的巨噬细胞促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，提高IL-10抗炎因子分泌，因此具有强抗炎活性，可以应用于制备具有抗炎活性的药物、化妆品或功能性产品中，在食品、医药及化妆品领域具有广阔的前景。本发明小肽，来源于麦胚蛋白，因此安全性较高，其制备方法简单，容易操作，来源广泛。

附图说明

图1为麦胚蛋白在不同消化时间的水解度的变化，横坐标为消化时间，纵坐标为水解度。

图2为WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ和WGPH-Ⅲ对RAW 264.7巨噬细胞增殖活力的影响。其中对照组是指对照孔，WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ、WGPH-Ⅲ分别指加入WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ或WGPH-Ⅲ的样品孔。

图3为WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ、WGPH-Ⅲ对LPS诱导的RAW264.7 NO产生的影响。其中空白组为空白孔，LPS模型组为模型孔，WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ、WGPH-Ⅲ分别为加入WGPH-Ⅰ、WGPH-Ⅱ或WGPH-Ⅲ的加样组。其中##表示与空白孔相比有极显著差异(p<0.01)，**表示与模型孔相比具有极显著差异(p<0.01)下同。

图4为APEPEPAF的二级质谱图，其中横坐标表示离子的质荷比值(m/z)，纵坐标表示离子流的强度。

图5为小肽APEPEPAF对RAW264.7分泌炎症因子的影响，其中control表示空白孔，LPS表示LPS模型孔，LPS+各浓度P1表示LPS诱导细胞并用各浓度小肽APEPEPAF干预的样品孔(P1是小肽APEPEPAF的缩写)，LPS+DEX表示阳性孔。其中#表示LPS模型孔与空白孔相比具有显著差异(p<0.05)，##表示LPS模型孔与空白孔相比有极显著差异(p<0.01)，*表示样品孔或阳性孔与LPS模型孔相比具有显著差异(p<0.05)，**表示样品孔或阳性孔与LPS模型孔相比具有极显著差异(p<0.01)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.材料：实验所用的麦胚蛋白小肽由金斯瑞生物科技有限公司根据LC-MS/MS鉴定结果利用FlexPeptideTM多肽合成技术合成，序列为：APEPEPAF。胰蛋白酶(2500U/mg)生工生物有限公司；胃蛋白酶(3000U/mg)索莱宝生物有限公司；RAW 264.7细胞株(北京市疾控中心)；胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养液、Penicillin-Streptomycin(100×)、TrypsinEDTA(0.05％)、Hank平衡盐溶液(HBSS，美国Gibco公司)；荧光探针DCFH-DA、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)；NO试剂盒、ELISA试剂盒(TNF-α，IL-1，IL-6，and IL-10)、微量蛋白含量测定(BCA法)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其他试剂均为国产分析纯。

2.主要仪器与设备：生物安全柜(Thermo Fisher(中国)公司)；MZE多功能酶标仪(Molecular Devices(美国)公司)；SL16R台式离心机(Thermo Fisher(中国)公司)；二氧化碳培养箱(Thermo Fisher(中国)公司)；荧光显微镜(德国卡尔蔡司有限公司)。

实施例1制备具有抗炎活性的小肽

(1)麦胚蛋白的提取：将采用正己烷脱脂后的小麦胚芽，用粉碎机粉碎后过100目筛，取筛下部分，得到小麦胚芽粉。在50g小麦胚芽粉中，加入500mL蒸馏水，加入NaCl水溶液100mL(含有5g NaCl)，用NaOH水溶液调pH值至9.0，用磁力搅拌器搅拌30min，再于4℃、5000r/min离心10min，取上清液并用盐酸调节pH值至4.0，待出现大片白色沉淀后，离心10min，取沉淀，并用蒸馏水溶解、用NaOH水溶液调pH值至7，透析脱盐后，真空冷冻干燥得麦胚蛋白粉，并储存在-20℃的进一步使用。

(2)麦胚蛋白模拟胃肠道消化：首先用去离子水溶解麦胚蛋白粉，搅拌均匀，得到质量百分浓度为8％的麦胚蛋白溶液。将麦胚蛋白溶液在95℃水浴中加热30min，调节pH至7.0，使蛋白质完全变性。将完全变性后的麦胚蛋白溶液用盐酸调节pH为2.0，加入麦胚蛋白质量0.4％的胃蛋白酶(3000U/mg；索莱宝生物有限公司，Cat.No.P8390)，在37℃下消化4h。然后，用氢氧化钠水溶液将pH值调为7.6，加入麦胚蛋白质量0.3％的胰蛋白酶(购自生工生物有限公司，Cat.No.T0785，2500U/mg)，然后加入麦胚蛋白质量0.1％的α-胰凝乳蛋白酶(购自索莱宝生物有限公司，Cat.No.C8660，1200U/mg)，在37℃下消化6h。消化过程中，每隔1h采集一次样品，测定其水解度(DH)和肽得率。10h后，将消化水解后的溶液冷却至室温，以5000r/min离心20min，收集上清液，透析脱盐，真空冷冻干燥后，得到麦胚蛋白消化产物。

结果显示如图1所示，麦胚蛋白模拟胃肠道消化过程中，随着消化时间的增加，麦胚蛋白水解度整体呈上升趋势；在模拟胃消化阶段(胃蛋白酶)，麦胚蛋白开始水解，0～4h的水解度在1.96％～6.87％之间；在模拟肠消化阶段添加胰蛋白酶和α-糜蛋白酶后，水解度急剧增加，然后水解度增加缓慢，趋于稳定，DH最终达到13.08％。

(3)麦胚蛋白消化产物Ⅲ的分离纯化：选用截流分子量为3KDa和1KDa的超滤膜。用浓度为0.1M、pH7.6的磷酸盐缓冲液将麦胚蛋白消化产物配成质量百分浓度为0.1％的溶液，用0.45μm的纤维素膜过滤除去不溶物。将麦胚蛋白消化产物溶液，采用Labscale小型切向流超滤系统进行分离，首先选用截流分子量为3KDa的超滤膜进行分离，得到分子量大于3KDa的组分(记为组分WGPH-I)和分子量小于等于3KDa的组分，然后将分子量小于等于3KDa的组分继续用截流分子量为1KDa的超滤膜进行分离，得到分子量大于等于1KDa小于等于3KDa的组分(记为组分WGPH-II)和分子量小于1KDa的组分(记为组分WGPH-III)。超滤时，调节泵的压力为0.2MPa，超滤温度为4℃。

将超滤后获得的不同分子量的组分WGPH-Ⅰ(>3KDa)、WGPH-II(1～3KDa)和WGPH-III(<1KDa)脱盐、冷冻干燥，检测各组分对正常巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响；另外，通过检测各组分WGPH-Ⅰ(>3KDa)、WGPH-II(1～3KDa)和WGPH-III(<1KDa)对LPS诱导的RAW264.7中NO产生的影响，来评价小肽的抗炎活性。

(4)噻唑蓝(MTT)法检测各组分(WGPH-I、WGPH-II和WGPH-III)对正常巨噬细胞RAW264.7增殖活力的影响

取对数生长期的巨噬细胞RAW 264.7，用含10％FBS的RPIM 1640培养液配置成3×10⁴个/mL的细胞悬浮液。在96孔板中设置样品孔，每个样品孔中加入100μL细胞悬浮液，在细胞培养箱中培养12h使细胞贴壁。除去样品孔中的培养液后，将不同组分WGPH-Ⅰ(>3KDa)、WGPH-II(1～3KDa)和WGPH-III(<1KDa)分别溶解于含10％FBS的RPIM 1640培养液中，制成不同浓度的小肽培养液(0、50、100、200、300μg/mL)，再加入各样品孔中，每孔100μL体积；设空白孔，与样品孔相比，无细胞，以100μL的PBS替代小肽培养液；设置对照孔，与样品孔相比，有细胞，但是以100μL的PBS替代小肽培养液。将96孔板在37℃培养箱中培养2h后，每孔中加入1μg/mL的LPS水溶液10μL。继续培养24h后，然后每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)，然后培养4h后，除去96孔板中的溶液，每孔加入50μL的DMSO，37℃恒温振荡箱中振荡20min，在酶标仪中570nm波长下测吸光度。

细胞增殖活力＝(OD_样品孔-OD_空白孔)/(OD_对照孔-OD_空白孔)×100％。

结果如图2所示，在各小肽处理24h后，随着小肽浓度的增加，吸光度没有显著性差异，表明不同组分WGPH-Ⅰ(>3KDa)，WGPH-II(1～3KDa)，WGPH-III(<1KDa)对巨噬细胞的活性并无影响，说明组分WGPH-Ⅰ、WGPH-II和WGPH-III安全性较好。

(5)Griess方法检测LPS诱导的RAW264.7中NO含量

各组分WGPH-Ⅰ、WGPH-II和WGPH-III对LPS诱导的RAW264.7中NO分泌量的影响，采用一氧化氮检测试剂盒(南京碧云天公司)来进行检测，具体步骤如下：取对数生长期的巨噬细胞RAW 264.7，用含有10％(体积百分浓度)FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养液配置成3×10⁴个细胞/mL的细胞悬浮液。在96孔板中设置样品孔，每个样品孔中加入100μL细胞悬浮液，在CO₂培养箱中培养12h使细胞贴壁，除去样品孔中培养液后，各样品孔中分别加入100μL不同浓度(0，20，80，320μM)的小肽培养液。在96孔板中设置对照孔和模型孔，与样品孔相比，不同之处仅在于以相同体积的PBS替代小肽培养液。将96孔板在37℃培养箱中培养2h后，样品孔和模型孔的每孔中加入1μg/mL的LPS(脂多糖，美国Sigma公司)水溶液10μL，在37℃培养箱中恒温培养24h，空白孔中不加入LPS水溶液。从96孔板的每个孔中吸取上清液50μL，转移到另一个96孔板的各孔中，然后，每孔中依次加入一氧化氮检测试剂盒中的GriessI和Griess II两种溶液，混匀后。采用酶标仪在540nm下的检测吸光度值后换算成NO摩尔浓度。其中不同浓度(0，20，80，320μM)的小肽培养液是将小肽溶解于含有10％(体积百分浓度)FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养液后所得。

结果如图3所示，组分WGPH-II和WGPH-Ⅰ干预的细胞中NO浓度与模型孔相比无显著性差异；组分WGPH-III干预的细胞中NO浓度明显降低，且具有显著性差异，说明组分WGPH-III能够显著降低LPS诱导的巨噬细胞NO的分泌，具有一定的抗炎活性。

(6)结构鉴定：采用LC-MS/MS检测组分WGPH-III中的活性组分纯度及氨基酸序列。将组分WGPH-III冷冻干燥，得到组分WGPH-III的冻干粉。将组分WGPH-III的冻干粉溶于去离子水，配制成浓度为20μg/ml的蛋白溶液。流动相A是质量百分浓度为0.1％的甲酸水溶液，B是质量百分浓度为0.1％的甲酸的乙腈溶液，选用BEH C18色谱柱。洗脱程序为：0-5min，流动相A 100～85％线性降低，流动相B 0～15％线性升高；5～10min，流动相A 85～100％线性升高，流动相B15％～0线性降低。洗脱程序中的百分数为体积百分浓度。样品经过液相色谱分离系统后，再由质谱系统将肽段打成不同分子量的碎片，并由质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器检测得到质谱图，实验结果如图4。分析质谱图，发现组分WGPH-III中的活性组分为氨基酸序列为APEPEPAF的小肽，分子量856.92Da，质量百分数大于等于98％。

(7)测定小肽APEPEPAF的抗炎活性

由金斯瑞生物科技有限公司利用FlexPeptideTM多肽合成技术合成小肽APEPEPAF(序列如SEQ ID NO:1所示)，用于以下实验。

检测小肽APEPEPAF干预对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7中炎症因子的影响，具体检测方法包括如下步骤：取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7，用含有10％(体积百分浓度)FBS的RPMI 1640培养液配置成3×10⁴个细胞/mL的细胞悬浮液。在24孔板中设置样品孔，每个样品孔中加入400μL上述细胞悬浮液，在CO₂培养箱中培养12h使细胞贴壁，分别加入不同浓度(0，20，80，320μM)的小肽培养液；在该24孔板中还设有空白孔、LPS模型孔和阳性孔，其中空白孔和LPS模型孔与样品孔相比，不同之处仅在于不添加小肽培养液；阳性孔与样品孔相比，不同之处仅在于以含有100μM的DEX(地塞米松)的培养液(溶剂为含有10％FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养液)替代小肽培养液。然后将该24孔板在培养箱中培养2h后，在样品孔、LPS模型孔和阳性孔的各孔中加入1μg/mL的LPS溶液10μL，空白孔中不加，然后在培养箱中恒温放置24h。采用ELISA试剂盒(TNF-α，IL-1，IL-6，and IL-10)(杭州联科生物技术股份有限公司)检测各炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量。其中不同浓度(0，20，80，320μM)的小肽培养液是将小肽溶解于含有10％(体积百分浓度)FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养液后所得。

结果如图5所示，320μM的小肽干预的细胞中，IL-6浓度为LPS模型孔细胞的79.19％；IL-1β浓度为LPS模型孔细胞的78.91％；TNF-α浓度为LPS模型孔细胞的61.36％；IL-10抗炎因子浓度为LPS模型孔细胞的1.14倍；320μM的小肽干预的细胞与阳性药物地塞米松干预的细胞相比，IL-6，IL-1β和TNF-α的浓度分别为阳性孔的94％、98％和95％，IL-10浓度为阳性组的1.01倍。

与空白孔相比，LPS诱导细胞后，其促炎因子IL-6，TNF-α和IL-1β的分泌显著升高(p<0.05)，但当小肽APEPEPAF用不同浓度干预后，与LPS模型孔相比，促炎因子IL-6，TNF-α和IL-1β的分泌显著得到抑制(p<0.05)。IL-10在LPS处理后与空白孔相比分泌量显著增加(p<0.05)，小肽APEPEPAF加样浓度20μM的处理下，与LPS模型孔相比没有显著性差异(p>0.05)；当加样浓度为80μM和320μM时，IL-10的分泌有增长的趋势，且与LPS模型孔有极显著性差异(p<0.01)。故结果表明，小肽APEPEPAF能够降低LPS诱导的巨噬细胞促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，提高IL-10抗炎因子分泌。

综上所述，本发明小肽APEPEPAF具有良好的抗炎活性，能够降低LPS诱导的RAW264.7炎症因子的分泌，提高IL-10抗炎因子分泌。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京财经大学

<120> 具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用

<130> 202107072

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 小麦胚芽

<400> 1

Ala Pro Glu Pro Glu Pro Ala Phe

1 5

Claims (8)

1.一种具有抗炎活性的小肽，其氨基酸序列如SEQ IN NO:1所示。

2.权利要求1所述小肽的制备方法，其特征在于如下步骤：(1)将麦胚蛋白通过模拟胃肠道消化，得到蛋白消化产物；(2)取所述蛋白消化产物进行超滤膜分离，取分子量小于1KDa的组分Ⅰ，得到所述小肽。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤(1)中所述麦胚蛋白是采用碱提酸沉法从脱脂后的麦胚粉中提取所得。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤(1)中所述采用模拟胃肠道消化手段来水解麦胚蛋白，包括如下步骤：将麦胚蛋白先用胃蛋白酶消化，再用胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶进行消化。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于胃蛋白酶消化时间为3-5h，胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶化时间为5-7h。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于步骤(2)中所述超滤膜孔径为1KDa。

7.权利要求1所述小肽在制备具有抗炎活性的药物、化妆品或功能性食品中的应用。

8.含有权利要求1所述小肽的药物、化妆品或功能性食品。

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