CN117069798B - 一种抗炎活性的藜麦小肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗炎活性的藜麦小肽及其制备方法和应用，属于生物技术领域。该藜麦小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供所述小肽的制备方法，包括如下步骤：（1）从脱脂藜麦中提取藜麦蛋白；（2）对藜麦蛋白进行模拟胃肠道消化，得到消化产物；（3）取所述消化产物中分子量小于1kDa的组分，得到所述小肽。本发明小肽，来源于藜麦，具有安全性高、来源广泛、抗炎活性强的特点。

Description

一种抗炎活性的藜麦小肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗炎活性的藜麦小肽及其制备方法和应用。

背景技术

藜麦是属藜科藜属一年生双子叶植物，其具有很高的营养价值和食用价值，被誉为“超级谷物”，是近年来农作物中极具发展潜力的一种。同时藜麦具有无麸质和高消化率的特点，容易被人们消化吸收。

炎症是机体的一种保护性反应，在机体感染或损伤期间，清除外界刺激，维持体内平衡，其特征为发红、肿胀、发热、疼痛和机能障碍。炎症反应可分为急性炎症和慢性炎症。长期和不受控制的炎症反应能够引起各种疾病，如心血管功能障碍、代谢紊乱、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、心脏病发作、癌症等。短期的炎症反应是机体自我修复的关键步骤，涉及不同细胞和器官中的多种反应。但导致炎症的发生有很多种因素，如生物性因子、理化性因子、异常免疫反应、异物、组织坏死等。

现有技术中，缺乏源于天然物质、安全性高、抗炎活性强的小肽。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗炎活性的小肽，来源于藜麦，具有安全性高、来源广泛、抗炎活性强的特点。

本发明的另一目的是提供上述小肽的制备方法，该方法简单，安全，高效，重复性高。

本发明的又一目的是提供该小肽在制备具有抗炎活性的药物、化妆品中的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种抗炎活性的藜麦小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供所述小肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)从脱脂藜麦中提取藜麦蛋白；

(2)对藜麦蛋白进行模拟胃肠道消化，得到消化产物；

(3)取所述消化产物中分子量小于1kDa的组分，得到所述小肽。

在本发明中，步骤(1)中采用正己烷进行脱脂。

在本发明中，步骤(2)中模拟胃肠道消化包括依次采用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行消化。

在本发明中，所述胃蛋白酶消化时间为3.5-4.5小时，所述胰蛋白酶消化时间为5-7小时。

在本发明中，步骤(3)中采用截留分子量为1kDa的超滤膜对消化产物进行超滤，取透过液，即得所述小肽。

在本发明中，所述消化产物先采用纤维素膜进行分离，然后采用截留分子量为3kDa的超滤膜进行分离，取透过液采用截留分子量为1kDa的超滤膜进行超滤。

在本发明中，所述纤维素膜的孔径为0.45微米。

本发明还提供所述藜麦小肽在制备具有抗炎活性的药物、化妆品中的应用。

本发明还提供含有所述小肽的药物、化妆品。

有益效果：本发明小肽从藜麦蛋白中分离，通过建立LPS诱导的巨噬细胞炎症模型，检验其对NO的释放量以及炎症因子的分泌量的影响，结果显示该小肽不仅对巨噬细胞增殖活性无影响，而且能够减少LPS诱导的巨噬细胞促炎因子TNF-α和IL-1β的分泌量，因此具有强抗炎活性，可以应用于制备具有抗炎活性的药物、化妆品中，在医药及化妆品领域具有广阔的前景。本发明小肽，来源于藜麦蛋白，因此绿色安全，且制备方法简单，容易操作，来源广泛。

附图说明

图1为藜麦蛋白在模拟胃肠道消化过程中水解度的变化，横坐标为消化时间，纵坐标为水解度。

图2为WQPH-Ⅰ组分(<1kDa)、WQPH-Ⅱ组分(1-3kDa)、WQPH-Ⅲ组分(>3kDa)对RAW264.7巨噬细胞增殖活力的影响。其中0μg/mL是对照孔，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别指加入不同浓度的WQPH-Ⅰ、WQPH-Ⅱ、WQPH-Ⅲ的样品孔。其中“**”表示与对照孔相比具有极显著差异(P<0.01)。

图3为WQPH-Ⅰ组分(<1kDa)、WQPH-Ⅱ组分(1-3kDa)、WQPH-Ⅲ组分(>3kDa)对LPS诱导的RAW264.7中NO分泌量的影响。其中“-”、“+”分别表示“不含有”和“含有”，LPS-WQPHs-为空白孔，LPS+WQPHs-为模型孔，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别指加入不同浓度的WQPH-Ⅰ、WQPH-Ⅱ、WQPH-Ⅲ的样品孔。其中“##”表示模型孔与空白孔相比有极显著差异(P<0.01)，“**”表示样品孔与模型孔相比具有极显著差异(P<0.01)，“*”表示样品孔与模型孔相比具有显著差异(P<0.05)。

图4为WQPH-Ⅰ组分中的活性物质(TPGAFF)的二级质谱图，其中横坐标表示离子的质荷比值(m/z)，纵坐标表示离子流的强度。

图5为藜麦小肽藜麦小肽P3对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7中炎症因子的影响，其中control表示空白孔，LPS表示模型孔，LPS+各浓度P3表示LPS诱导细胞并用各浓度藜麦小肽P3干预的样品孔(P3是小肽TPGAFF的缩写)。其中“##”表示模型孔与空白孔相比有极显著差异(P<0.01)，“#”表示模型孔与空白孔相比具有显著差异(P<0.05)，“**”表示样品孔与模型孔相比具有极显著差异(P<0.01)。“*”表示样品孔与模型孔相比具有显著差异(P<0.05)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.材料：实验所用的藜麦购于青海西宁；藜麦小肽P3，序列为TPGAFF(SEQ ID NO:1)，由金斯瑞生物工程有限公司合成。胃蛋白酶(3000U/mg)和胰蛋白酶(2500U/mg)购自索莱宝生物有限公司；RAW 264.7细胞株购自美国ATCC公司；胎牛血清(FBS)、DMEM(HighGlucose)培养液、青霉素-链霉素溶液(100×)购自美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；NO试剂盒、ELISA试剂盒(TNF-α、IL-1β)、微量蛋白含量测定(BCA法)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。本发明中使用的pH7.4的PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L。

2.主要仪器与设备：生物安全柜购自Thermo Fisher(中国)公司；MZE多功能酶标仪购自Molecular Devices(美国)公司；二氧化碳培养箱购自Thermo Fisher(中国)公司；高速冷冻离心机、超声波细胞粉碎仪购自湖南湘仪仪器有限公司；荧光显微镜购自德国卡尔蔡司有限公司。

实施例1制备具有抗炎活性的小肽

(1)藜麦蛋白的提取：将藜麦置于室温下，用双蒸水浸泡2h，并洗涤3次去除皂苷，均匀地铺在平板上，纱布覆盖晾干2h。使用小型磨粉机对藜麦进行研磨，并用100目筛子对其进行筛分，取筛下部分，用正己烷进行脱脂。取脱脂后的藜麦粉60.0g，加入6000mL的双蒸水，并调节pH至9.0，搅拌30min。然后在4℃、5000r/min条件下离心10min，取上清液，并调节pH至4.0，随后弃去上清液，保留下层沉淀。用双蒸水洗涤下层沉淀，在4℃、5000r/min条件下离心10min，取沉淀即得藜麦蛋白。将藜麦蛋白用双蒸水溶解，并将pH调整至7.0，然后透析脱盐1-2天，真空冷冻干燥后即得到藜麦蛋白冻干粉，并置于-20℃下保存，备用。

(2)藜麦蛋白模拟胃肠道消化：在藜麦蛋白冻干粉中，加入双蒸水溶解，搅拌均匀，配制成6％(质量百分浓度)的藜麦蛋白水溶液，在95℃水浴中加热30min，调整溶液的pH值为7.0，得到变性后的藜麦蛋白。在37℃下，对变性后的藜麦蛋白进行模拟胃肠道消化，用1mol/L的盐酸调节溶液的pH值为2.0，加入藜麦蛋白冻干粉质量0.4％的胃蛋白酶对藜麦蛋白消化4h，消化过程中采用1mol/L的盐酸控制溶液的pH值为2.0；其后，用1mol/L的NaOH水溶液调节溶液的pH值为7.6，加入藜麦蛋白冻干粉质量0.3％的胰蛋白酶，模拟肠道消化6h，消化过程中采用1mol/L的NaOH水溶液控制溶液的pH值为7.6。在模拟胃肠道消化的过程中，每隔1h对消化液采样一次，测定样品在消化过程中的水解度(degree ofhydrolysis，DH)。消化总时间达到10h时，将消化液冷却至室温，在4℃、5000r/min条件下离心20min，取上清液，透析脱盐，得到藜麦蛋白消化产物，放置于4℃冰箱保存。

结果显示如图1所示，藜麦蛋白模拟体外胃肠消化过程中，其水解度的趋势是先平稳上升后迅速升高，最终趋于平稳；在模拟胃消化的0-4h，藜麦蛋白经过胃蛋白酶酶解后，DH值并没有发生大幅度的变化，4h消化后达到28.58±1.45％。在模拟肠道消化的4-10h，胰蛋白酶的加入，大大提高了藜麦蛋白消化的DH值，并且大量小分子活性肽在此阶段产生。随着消化时间的增加，DH值缓慢升高，由于模拟过程中消化液浓度的降低以及酶水解位点的减少，DH值逐渐趋于稳定状态，最终DH值达到43.59±1.27％。

(3)藜麦蛋白消化产物的分离纯化：预先清洗孔径为0.45μm的纤维素膜、截留分子量为3kDa的超滤膜和截留分子量为1kDa的超滤膜，然后采用如下方法对藜麦蛋白消化产物进行分离纯化：取消化产物，加入双蒸水，配制成质量百分浓度为6％的水溶液，先用孔径为0.45μm的纤维素膜过滤，然后用截留分子量为3kDa的超滤膜进行超滤，得到截留液A和透过液A。截留液A所含组分记为WQPH-Ⅲ组分，其分子量大于3kDa。然后将透过液A采用截留分子量为1kDa的超滤膜进行超滤，得到截留液B和透过液B。截留液B所含组分记为WQPH-Ⅱ组分，所含组分的分子量大于等于1kDa且小于等于3kDa。透过液B所含组分的分子量小于1kDa，记为WQPH-Ⅰ组分。纤维素膜过滤时的温度为室温，压力为50MPa，超滤过程中调节泵的压力为30MPa，超滤温度为4℃。超滤结束后，将WQPH-Ⅰ组分、WQPH-Ⅱ组分和WQPH-Ⅲ组分分别透析脱盐，冷冻干燥，冻干粉置于-20℃保存备用。

(4)检测各组分对正常巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响

采用噻唑蓝(MTT)法分别检测各浓度的WQPH-Ⅰ组分、WQPH-Ⅱ组分和WQPH-Ⅲ组分对正常巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响。

以0.1mol/L、pH7.4的PBS缓冲液为溶剂，将各组分(WQPH-Ⅰ组分、WQPH-Ⅱ组分和WQPH-Ⅲ组分)分别配制成细胞干预液。

取对数生长期的巨噬细胞RAW 264.7，用含有10％(体积百分浓度)FBS的DMEM(High Glucose)培养液培养20h，用PBS缓冲液(pH7.4)清洗细胞，用含有10％(体积百分浓度)FBS的DMEM(High Glucose)培养液悬浮至50000个/mL。取96孔板，设置样品孔、对照孔和空白孔，其中每个样品孔和对照孔中加入100μL的RAW 264.7细胞悬液(5000个/孔)，空白孔中加入100μL、pH7.4的PBS缓冲液，置于培养箱中先培养12h，然后在每个样品孔中，分别加入各组分(WQPH-Ⅰ组分、WQPH-Ⅱ组分和WQPH-Ⅲ组分)的细胞干预液10μL，使得WQPH-Ⅰ组分、WQPH-Ⅱ组分和WQPH-Ⅲ组分的终浓度为20、40、80、160、320、640μg/mL，对照孔以相同体积的DMEM培养液替代细胞干预液，空白孔中不加入任何试剂，继续培养24h。待培养完成后取出96孔板，将5mg/mL的MTT溶液按照10μL/孔加入96孔板中，培养4h后将孔板中的所有液体吸出置于另一洁净的96孔板中，每孔加入100μL DMSO，于37℃恒温振荡箱中振荡15min，测定在570nm波长处的OD值。按照如下公式计算细胞增殖活力：细胞增殖活力＝(OD样品孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100％。

结果如图2所示，与空白孔相比，当藜麦多肽的浓度在0-160μg/mL时，WQPH-Ⅰ组分(<1kDa)、WQPH-Ⅱ组分(1-3kDa)和WQPH-Ⅲ组分(>3kDa)对RAW 264.7细胞的活力均无显著性影响(P>0.05)，即表明在此浓度区间中的藜麦多肽对RAW264.7细胞无毒性。随着浓度的升高，当达到320μg/mL时，三个组分对RAW 264.7细胞活力均产生影响，通过统计学分析可知其细胞活力显著降低(P＜0.01)，表明藜麦多肽的浓度过高反而会对细胞的增殖有抑制作用。因此，选择20、80μg/mL和160μg/mL作为后续模型干预的浓度，具有较高的安全性。

(5)Griess方法检测LPS诱导的RAW264.7中NO含量

通过检测WQPH-Ⅰ组分、WQPH-Ⅱ组分和WQPH-Ⅲ组分对LPS诱导的RAW264.7中NO释放量的影响，来评价各组分的抗炎活性。

采用一氧化氮检测试剂盒(南京碧云天公司)检测组分WQPH-Ⅰ、WQPH-II和WQPH-III对LPS诱导的RAW264.7中NO分泌量的影响，具体步骤如下：取对数生长期的巨噬细胞(RAW 264.7)，用含有10％(体积百分浓度)FBS的DMEM(High Glucose)培养液悬浮至50000个/mL用于铺96孔板，设置空白孔、模型孔和样品孔，其中每孔均加入100μL细胞悬液(5000个/孔)，培养12h后，每个样品孔中分别加入各组分的干预液(各组分以pH7.4的PBS缓冲液为溶剂配制的溶液)10μL，使得WQPH-Ⅰ组分、WQPH-Ⅱ组分和WQPH-Ⅲ组分的终浓度为20、80、160μg/mL，孵育2h进行预保护，空白孔、模型孔中不加入任何试剂；预保护2h后，对模型孔和样品孔按照10μL/孔加入1μg/mL的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)溶液(溶剂为DMEM培养液)，空白孔中加入相同体积的PBS，并于细胞培养箱中37℃恒温下继续培养24h。每孔取50μL溶液置新板孔中，并按顺序依次添加Griess I，Griess II两种试剂各50μL，混合均匀。测定其在540nm波长处的OD值，进而计算出每孔释放的NO的摩尔浓度。

结果如图3所示，LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量较空白孔极显著增加(P＜0.01)，表明该炎症模型建立成功。其中，WQPH-Ⅱ组分和WQPH-Ⅲ组分干预的孔与模型孔相比NO释放量显著性不明显；而WQPH-Ⅰ组分浓度为80μg/mL时，NO释放量显著减少；WQPH-Ⅰ组分干预浓度为160μg/mL时，与模型孔相比NO释放量呈极显著减少，因此WQPH-Ⅰ组分能够显著降低LPS诱导的巨噬细胞NO的分泌，表现出较好的抗炎活性。

(6)结构鉴定：采用LC-MS/MS检测WQPH-Ⅰ组分中活性物质的纯度及氨基酸序列。将组分WQPH-Ⅰ冷冻干燥，得到WQPH-Ⅰ组分的冻干粉。将WQPH-Ⅰ组分的冻干粉溶于去离子水，配制成浓度为20μg/ml的蛋白溶液。流动相A是质量百分浓度为0.1％的甲酸水溶液，B是质量百分浓度为0.1％的甲酸的乙腈溶液，选用BEH C18色谱柱。洗脱程序为：0～5min，流动相A100～85％线性降低，流动相B 0～15％线性升高；5～10min，流动相A 85～100％线性升高，流动相B15％～0线性降低。洗脱程序中的百分数为体积百分浓度。样品经过液相色谱分离系统后，再由质谱系统将肽段打成不同分子量的碎片，并由质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器检测得到质谱图，实验结果如图4。分析质谱图，发现WQPH-Ⅰ组分中的活性物质为氨基酸序列为TPGAFF的小肽(记为小肽P3)，分子量639.31Da，质量百分数大于等于98％。

(7)测定藜麦小肽TPGAFF的抗炎活性

由金斯瑞生物科技有限公司利用FlexPeptideTM多肽合成技术合成小肽P3，氨基酸序列为TPGAFF(SEQ ID NO:1)，用于以下实验。

检测藜麦小肽TPGAFF的干预对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7中炎症因子的影响，具体检测方法包括如下步骤：取对数生长期的巨噬细胞(RAW 264.7)，用含有10％FBS的DEME(High Glucose)培养液制备50000个/mL的细胞悬浮液用于铺96孔板，设置空白孔、模型孔和样品孔，每孔中均加入100μL细胞悬液(5000个/孔)，培养12h后，每个样品孔中分别加入小肽P3干预液(将小肽P3以pH为7.4的PBS缓冲液为溶剂配制的溶液)10μL，使得小肽P3的终浓度分别为20、80、160μg/mL，孵育2h进行预保护，模型孔和样品孔中不加入任何试剂；预保护2h后，对模型孔和样品孔按照10μL/孔加入1μg/mL的脂多糖(LPS)溶液(溶剂为pH为7.4的PBS缓冲液)，空白孔中加入相同体积的PBS缓冲液，并于细胞培养箱中37℃恒温下继续培养，培养24h后用无菌管收集细胞培养上清，采用酶联免疫(ELISA)试剂盒(TNF-α、IL-1β)(上海源桔生物科技中心)测定炎症因子的含量。

结果如图5所示，藜麦小肽P3(TPGAFF)对促炎因子TNF-α和IL-1β分泌量的影响。与空白孔相比，模型孔的促炎因子TNF-α和IL-1β的释放水平显著升高(P<0.01)。相较于模型孔，经藜麦小肽P3干预后显著性抑制了促炎因子TNF-α的释放量(P<0.01)。同样，藜麦小肽P3的干预显著减少了促炎因子IL-1β的分泌，且随着藜麦活性肽P3对细胞干预浓度的增加，促炎因子IL-1β分泌量呈现出下降趋势(P<0.01)。

综上所述，本发明藜麦小肽P3(TPGAFF)具有良好的抗炎活性，能够降低LPS诱导的RAW264.7炎症因子的分泌，具有抗炎作用。

Claims (8)

1.一种抗炎活性的藜麦小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述小肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）从脱脂藜麦中提取藜麦蛋白；

（2）对藜麦蛋白进行模拟胃肠道消化，得到消化产物；

（3）取所述消化产物中分子量小于1kDa的组分，得到所述小肽；

步骤（2）中模拟胃肠道消化包括依次采用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行消化；所述胃蛋白酶消化时间为3.5-4.5小时，所述胰蛋白酶消化时间为5-7小时。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤（1）中采用正己烷进行脱脂。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤（3）中采用截留分子量为1 kDa的超滤膜对消化产物进行超滤，取透过液，即得所述小肽。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于所述消化产物先采用纤维素膜进行分离，然后采用截留分子量为3 kDa的超滤膜进行分离，取透过液采用截留分子量为1 kDa的超滤膜进行超滤。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于所述纤维素膜的孔径为0.45微米。

7.权利要求1所述藜麦小肽在制备具有抗炎活性的药物、化妆品中的应用。

8.含有权利要求1所述小肽的药物、化妆品。