CN115947778B - 一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用 - Google Patents

一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115947778B
CN115947778B CN202211092181.6A CN202211092181A CN115947778B CN 115947778 B CN115947778 B CN 115947778B CN 202211092181 A CN202211092181 A CN 202211092181A CN 115947778 B CN115947778 B CN 115947778B
Authority
CN
China
Prior art keywords
small peptide
lipid
lph
enzymolysis
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211092181.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115947778A (zh
Inventor
翁泽斌
汪芳
杨高红
沈新春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University of Chinese Medicine
Nanjing University of Finance and Economics
Original Assignee
Nanjing University of Chinese Medicine
Nanjing University of Finance and Economics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing University of Finance and Economics filed Critical Nanjing University of Chinese Medicine
Priority to CN202211092181.6A priority Critical patent/CN115947778B/zh
Publication of CN115947778A publication Critical patent/CN115947778A/zh
Priority to US18/461,604 priority patent/US20240084357A1/en
Application granted granted Critical
Publication of CN115947778B publication Critical patent/CN115947778B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用，属于生物技术领域。该具有降脂活性的小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供所述小肽的制备方法，包括如下步骤：（1）将泥鳅蛋白采用蛋白酶酶解，得到酶解产物；（2）取所述酶解产物采用超滤膜分离，取分子量小于3 kDa的组分；（3）将所述分子量小于3 kDa的组分经葡聚糖凝胶Sephadex G‑15过滤分离，得到所述小肽。本发明小肽，来源于泥鳅蛋白，具有安全性高、高效、来源广泛的特点。

Description

一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用。
背景技术
肥胖是一种代谢性疾病，它是由于摄入过多的能量或者身体的新陈代谢发生了变化，导致身体的脂肪特别是甘油三酯的积累，同时伴随着II型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心血管病等疾病的发生，危害超过全球1/3的人口。长期以来，人们热衷于寻找治疗或预防肥胖的药物，如奥利司他、西布曲明、二甲双胍及他汀类药物等，但临床使用仍伴随多种副反应发生。随着医学和生物技术的发展，多肽和蛋白类药物开始不断涌现，它具有高药效、易代谢、不易蓄积、毒性低、副作用小等诸多优势，因此开发多肽和蛋白类药物成为研究的热点。
现有技术中，缺乏天然来源、高效、安全的、具有降脂活性的小肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有降脂活性的小肽，来源于泥鳅蛋白，具有安全性高、高效、来源广泛的特点。
本发明的另一目的是提供上述小肽的制备方法，该方法简单，安全，高效，重复性好。
本发明的又一目的是提供该小肽在制备具有降脂活性的药物、化妆品或功能性食品中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种具有降脂活性的小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供所述小肽的制备方法，包括如下步骤：(1)将泥鳅蛋白采用蛋白酶酶解，得到酶解产物；(2)取所述酶解产物采用超滤膜分离，取分子量小于3kDa的组分；(3)将所述分子量小于3kDa的组分经葡聚糖凝胶Sephadex G-15过滤分离，得到所述小肽。
在本发明中，步骤(1)中所述蛋白酶为菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶。
在本发明中，步骤(1)中将泥鳅蛋白依次采用菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶酶解。
在本发明中，步骤(1)所述菠萝蛋白酶酶解时间为4-6h，碱性蛋白酶酶解时间为0.5-1.5h。
在本发明中，步骤(2)中所述超滤膜的截留分子量为3kDa。
在本发明中，步骤(3)采用葡聚糖凝胶Sephadex G-15过滤分离中，采用去离子水进行洗脱，洗脱流速为0.8ml/min，取保留时间为125-155min的洗脱液，得到所述小肽。
本发明还提供所述小肽在制备具有降脂活性的药物、化妆品或功能性食品中的应用。
本发明还提供含有所述小肽的药物、化妆品或功能性食品。
本发明小肽从泥鳅蛋白中分离，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，通过体外PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌量以及胞内甘油三酯含量测定，发现具较强降脂活性，可以应用于制备具有降脂活性的药物、化妆品或功能性产品中，在食品、医药及化妆品领域具有广阔的前景。本发明小肽，来源于泥鳅蛋白，因此安全性较高，其制备方法简单，容易操作，来源广泛。
附图说明
图1超滤组分对PA诱导的Hep G2细胞脂质累积的影响。其中(A)为各组分对Hep G2细胞增殖活力的影响，对照组是指对照孔，LPH-Ⅰ、LPH-Ⅱ、LPH-Ⅲ分别指加入LPH-Ⅰ、LPH-Ⅱ或LPH-Ⅲ(150μg/ml)的样品孔；(B)显示了各组分对PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌的影响，其中Control为空白对照，PA是采用基础培养液干预的孔，PA/LPH-Ⅰ表示采用采用添加了150μg/ml LPH-Ⅰ的基础培养液干预的孔，PA/LPH-Ⅱ和PA/LPH-Ⅲ按照相同方法类推；(C)为各组分对PA诱导的Hep G2细胞脂质含量的影响，其中下方PA、样品表示干预过程中添加的该物质，+表示添加有对应物质，-表示未添加对应物质。(D)为各组分对PA诱导的Hep G2细胞内甘油三酯(TG)含量的影响，其中下方PA、样品表示干预过程中添加的物质，+表示添加有对应物质，-表示未添加对应物质，纵坐标为甘油三酯含量，单位为微摩尔每克蛋白(μmol/gprot)。##表示与空白孔相比有极显著差异(p<0.01)，**表示与模型孔相比具有极显著差异(p<0.01)下同。
图2显示LPH-Ⅲ经Sephadex G-15凝胶过滤分离色谱图。其中横坐标为保留时间(min)，纵坐标是220nm处的信号响应值(mV)。
图3凝胶过滤分离组分对PA诱导的Hep G2细胞脂质累积的影响。(A)为G1、G2、G3、G4、G5、G6和G7(100μg/ml)对Hep G2细胞增殖活力的影响。其中对照组是指对照孔，G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7分别指加入G1、G2、G3、G4、G5、G6或G7的样品孔；(B)为G1-G7(100μg/ml)对PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌影响，其中Control为空白对照，PA是采用基础培养液干预的孔，PA/G1表示采用添加了G1的基础培养液干预的孔；PA/G2、PA/G3、PA/G4、PA/G5、PA/G6、PA/G7按照上述方法类推。(C)为100μg/ml的G1-G7对PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌的影响，下方PA、样品表示干预过程中添加的该物质，+表示添加有对应物质，-表示未添加对应物质。(D)为G1-G7(100μg/ml)对PA诱导的Hep G2细胞内甘油三酯(TG)含量的影响，下方PA、样品表示干预过程中添加的物质，+表示添加有对应物质，-表示未添加对应物质，纵坐标为甘油三酯含量，单位为微摩尔每克蛋白(μmol/gprot)。
图4AYPF的二级质谱图。横坐标表示离子的质荷比(m/z)值，纵坐标表示离子流的强度。
图5小肽AYPF对PA诱导的Hep G2细胞脂质累积的影响。其中(A)为不同浓度小肽AYPF对Hep G2细胞增殖活力的影响，对照组是指对照孔，16、32、64、128、256和512分别指加入16、32、64、128、256、512μM小肽AYPF的样品孔；(B)为小肽AYPF对PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌的影响，其中Control为空白对照，PA是采用基础培养液干预的孔，PA/64μMAYPF表示采用添加了64μMAYPF的基础培养液干预的孔；PA/128μMAYPF表示采用添加了128μMAYPF的基础培养液干预的孔。(C)为不同浓度小肽AYPF对PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌的影响，下方PA、AYPF表示干预过程中添加的物质，+表示添加有对应物质，-表示未添加对应物质。(D)为不同浓度小肽AYPF对PA诱导的Hep G2细胞内甘油三酯(TG)含量的影响，下方PA、AYPF表示干预过程中添加的物质，+表示添加有对应物质，-表示未添加对应物质，纵坐标为甘油三酯含量，单位为微摩尔每克蛋白(μmol/gprot)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1.材料：菠萝蛋白酶(300U/mg)，源叶生物科技有限公司；碱性蛋白酶(200U/mg)，源叶生物科技有限公司；超滤膜(10kDa、3kDa)，美国millipore公司；Sephadex G-15，(中国)医疗集团；Hep G2细胞株，上海中科院细胞库；胎牛血清(FBS)、High Glucose DMEM培养液、Penicillin-Streptomycin(100×)、Trypsin EDTA(0.05％)、PBS磷酸盐缓冲液(1×，pH7.2)，美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司；油红O染料，源叶生物科技有限公司；钠棕榈酸酯(PA，规格：99％)，上海麦克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，美国Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，碧云天生物技术有限公司；组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒E1013，北京普利莱基因技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
2.主要仪器与设备：生物安全柜，Thermo Fisher(中国)公司；MZE多功能酶标仪，Molecular Devices(美国)公司；SL16R台式离心机，Thermo Fisher(中国)公司；二氧化碳培养箱，Thermo Fisher(中国)公司；倒置荧光显微镜，德国卡尔蔡司有限公司。
实施例1制备具有降脂活性的小肽
(1)泥鳅前处理：试验前，泥鳅置于干净的水中喂养一星期，吐脏。宰杀，去除头、尾、内脏及血，收集肉置于绞肉机中搅打两次，得到的肉糜置于聚乙烯袋中，-20℃冻藏，备用。
(2)泥鳅蛋白的酶解：称取100g泥鳅肉糜并加入200ml去离子水，搅拌均匀，可得pH值为6.5的浊液。无需调节pH，接着加入含有300mg菠萝蛋白酶(300U/mg，源叶生物科技有限公司，CAS号：37189-34-7)的水溶液1ml，55℃条件下酶解5h，沸水浴条件下灭酶10min。然后，用0.1M的氢氧化钠水溶液将pH值调为8.0，加入含有450mg碱性蛋白酶(200U/mg，源叶生物科技有限公司，CAS号：9014-01-1)的水溶液1ml，50℃条件下酶解1h，沸水浴条件下灭酶10min。将酶解后的溶液冷却至室温，以5000r/min离心20min，收集上清液，透析脱盐，真空冷冻干燥后，得到泥鳅蛋白酶解产物(Loach Protein Hydrolysate，记为LPH)。
(3)泥鳅蛋白酶解产物的超滤分离：选用截流分子量为10kDa和3kDa的超滤膜。用去离子水将泥鳅蛋白酶解产物配成质量百分浓度为1％的溶液，用0.45μm的纤维素膜过滤除去不溶物，然后采用Labscale小型切向流超滤系统进行分离，首先选用截流分子量为10kDa的超滤膜进行分离，得到分子量大于10kDa的组分(记为组分LPH-Ⅰ)和分子量小于等于10kDa的组分；然后将分子量小于等于10kDa的组分继续用截流分子量为3kDa的超滤膜进行分离，得到分子量大于等于3kDa小于等于10kDa的组分(记为组分LPH-II)和分子量小于3kDa的组分(记为组分LPH-III)。超滤时，调节泵的压力为0.2MPa，超滤温度为4℃。
将超滤后获得的不同分子量的组分LPH-Ⅰ(>10kDa)、LPH-II(3～10kDa)和LPH-III(<3kDa)分别脱盐、冷冻干燥，采用MTT法检测各组分对正常Hep G2细胞增殖活力的影响；另外，通过检测各组分LPH-Ⅰ(>10kDa)、LPH-II(3～10kDa)和LPH-III(<3kDa)对钠棕榈酸酯(PA)诱导的Hep G2细胞脂质累积(脂滴分泌、胞内甘油三酯(TG)含量)产生的影响，来评价小肽的降脂活性。
①MTT(噻唑蓝)法检测各组分(LPH-Ⅰ、LPH-II和LPH-III)对正常Hep G2细胞增殖活力的影响：取对数生长期的Hep G2细胞，用含10％FBS的High Glucose DMEM培养液配置成4×105个/mL的细胞悬浮液。在96孔板中设置样品孔，每个样品孔中加入100μl细胞悬浮液，在细胞培养箱中培养24h使细胞贴壁。除去样品孔中的培养液后，将组分LPH-Ⅰ(>10kDa)、LPH-II(3～10kDa)和LPH-III(<3kDa)分别溶解于含10％FBS的High Glucose DMEM培养液中，制成浓度为150μg/ml的小肽培养液，再加入各样品孔中，每孔100μl体积；设空白孔，与样品孔相比，无细胞，以100μl的PBS磷酸盐缓冲液(1×，pH 7.2)替代小肽培养液；设置对照孔，与样品孔相比，有细胞，但是以100μl的PBS磷酸盐缓冲液(1×，pH 7.2)替代小肽培养液。将96孔板在37℃培养箱中培养24h后，每孔加入10μl的MTT溶液(5mg/mL)，培养4h后，除去96孔板中的溶液，每孔加入150μl的DMSO，37℃恒温振荡箱中振荡20min，在酶标仪中570nm波长下测吸光度。
细胞增殖活力＝(OD样品孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100％。
结果如图1(A)所示，在各组分处理24h后，吸光度没有显著性差异，表明不同组分LPH-Ⅰ(>10kDa)、LPH-II(3～10kDa)和LPH-III(<3kDa)对Hep G2细胞的活性并无影响，说明组分LPH-Ⅰ(>10kDa)、LPH-II(3～10kDa)和LPH-III(<3kDa)安全性较好。
②油红O染色：取对数生长期Hep G2细胞，以5×104个/孔接种于24孔板，每孔加入500μl含有10％FBS的High Glucose DMEM培养液进行培养，待细胞生长至90％融合度后，去除培养液，每孔加入500μl无FBS的High Glucose DMEM培养液饥饿处理16h，之后每孔分别加入500μl含150uM PA和1％BSA的High Glucose DMEM新鲜培养液(记为基础培养液)、含有150μg/ml的LPH-Ⅰ的基础培养液、含有150μg/ml的LPH-II的基础培养液、含有150μg/ml的LPH-III的基础培养液，每组设4个平行/孔，诱导24h，以含1％BSA的High Glucose DMEM培养液培育的细胞为空白对照。诱导结束后，吸弃上清，以PBS磷酸盐缓冲液小心润洗3次，加入10％中性福尔马林溶液固定30min，PBS磷酸盐缓冲液润洗3次，每次3min，稍晾干，以60％异丙醇水溶液分化后，加入含油红O染料的染色液(0.3g油红O染料加入到100ml的60％异丙醇水溶液所得)，37℃摇床上避光染色20min。弃去染色液，以60％异丙醇水溶液分化至背景清晰，再以PBS磷酸盐缓冲液洗涤3次，即可置于莱卡倒置显微镜下(200×)进行拍照分析。
拍照结束后，每孔加入200ul异丙醇，置于37℃摇床上复溶油红O染料，测定其在510nm处吸光度值，以空白对照的脂质含量为百分百，计算各组分小肽处理后脂质含量相对于空白对照的百分比，可测得泥鳅多肽的体外降脂效果。
结果如图1(B)和(C)所示，通过油红O染色观察到，空白对照组的细胞形态清楚，红色的微滴数目很少，而PA刺激后细胞的脂滴数目和体积都有显著的提高。而加入了LPH-Ⅰ、LPH-II和LPH-III组分的组别与模型(PA)组相比红色液滴数目明显降低；且复溶油红O染料后，测定其在510nm处吸光度值，发现加入LPH-Ⅰ、LPH-II和LPH-III组分后可以明显降低细胞的脂滴分泌量。
③细胞甘油三酯(TG)含量的测定：取对数生长期Hep G2细胞，以5×104个/孔接种于24孔板，每孔加入500μl含有10％FBS的High Glucose DMEM培养液进行培养，待细胞生长至90％融合度后，去除培养液，以每孔500μl无FBS的High Glucose DMEM培养液饥饿处理16h，之后每孔分别加入500μl含150μM PA和1％BSA的High Glucose DMEM新鲜培养液(记为基础培养液)、含有150μg/ml的LPH-Ⅰ的基础培养液、含有150μg/ml的LPH-II的基础培养液、含有150μg/ml的LPH-III的基础培养液，每组设4个平行孔，诱导24h，以含1％BSA的HighGlucose DMEM培养液培育的细胞为空白对照。诱导结束后，将细胞以预冷的PBS缓冲液润洗3次后，加入裂解液置于冰上裂解15min，结合细胞刮棒将其收集至EP管中后，4℃条件下12000rpm/min离心15min，取上清采用组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒E1013测定细胞甘油三酯(TG)含量。
结果如图1(D)所示，经PA刺激后细胞内甘油三脂含量较对照组相比明显升高，而在加入了LPH-Ⅰ、LPH-II和LPH-III组分后这种情况得到了缓解，其中LPH-III组分具最佳缓解效果。
上述实验结果表明，泥鳅蛋白酶解液经超滤分离后，LPH-Ⅰ、LPH-II和LPH-III组分均具备一定体外降脂效果，其中LPH-III组分具有最佳降脂效果。因此，对LPH-III组分进行冻干，并进行凝胶过滤分离，以便得到更加确切的降脂成分。
(4)凝胶过滤分离：采用的葡聚糖凝胶填料型号为Sephadex G-15。层析柱规格为：1.6×75cm。首先，根据层析柱体积及所需凝胶体积准备一定量凝胶填料，将干胶浸泡于洗脱液或去离子水中一段时间，之后可煮沸5-10min使充分溶胀，将填料进行装柱，注意千万不要出现断层或大气泡，装填高度为65cm左右(可根据层析柱规格进行调整)。
将凝胶柱、恒流泵、紫外检测系统与自动收集器按特定顺序进行连接。调整恒流泵至流速为0.8ml/min，以去离子水进行平衡洗脱(排除系统气泡以及冲压填料使之稳定)。将LPH-III组分的冻干样品重新溶解于去离子水中，配制成浓度为30mg/ml的样品，采用0.45μm水系滤膜过滤以去除不溶性杂质，取过滤后的样品(LPH-III组分浓度为30mg/ml)8ml上柱，以去离子水进行洗脱，洗脱速度为0.8ml/min。收集洗脱液，每管4ml，其中紫外检测波长为220nm。
如图2所示，LPH-III组分经Sephadex G-15凝胶过滤分离后被分为7个峰组分，我们将这7个峰组分命名为G1、G2、G3、G4、G5、G6和G7。
合并各峰组分液体悬蒸浓缩后冻干，采用本实施例标题①方法分别测定浓度为100μg/ml的G1-G7对Hep G2细胞增殖活力的影响；采用本实施例标题②和③中方法测定100μg/ml的G1-G7体外降脂效果，活性最高的组分用于肽序列分析。
如图3所示，G1、G2、G3、G4、G5、G6和G7在浓度为100μg/ml时对Hep G2细胞的增殖活力没有影响(见图3(A))，且能够显著降低PA诱导所致的脂滴分泌增加(见图3(B)和(C))以及缓解胞内甘油三酯含量的升高(见图3(D))。其中，又以G4峰组分(对应的保留时间为125-155min)具最佳体外降脂效果。因此，对G4峰组分的氨基酸序列进行分析。
(5)结构鉴定：采用LC-MS/MS检测G4峰中的活性组分纯度及氨基酸序列。将G4峰组分冷冻干燥，得到G4峰组分的冻干粉。将G4峰组分的冻干粉溶于去离子水，配制成浓度为20μg/ml的蛋白溶液。流动相A是质量百分浓度为0.1％的甲酸水溶液，B是质量百分浓度为0.1％的甲酸的乙腈溶液，选用BEH C18色谱柱。洗脱程序为：0-5min，流动相A 100～85％线性降低，流动相B 0～15％线性升高；5-10min，流动相A 85～100％线性升高，流动相B15～0％线性降低。洗脱程序中的百分数为体积百分浓度。样品经过液相色谱分离系统后，再由质谱系统将肽段打成不同分子量的碎片，并由质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器检测得到质谱图，如图4。分析质谱图，发现G4峰中的活性组分为氨基酸序列为AYPF的小肽，分子量为496.56Da，质量百分数大于等于98％。
实施例2小肽AYPF的降脂活性
由金斯瑞生物科技有限公司利用FlexPeptideTM多肽合成技术合成小肽AYPF(SEQID NO:1)。采用实施例1标题①方法测定小肽AYPF浓度在16、32、64、128、256、512μM时对HepG2细胞增殖活力的影响。结果如图5(A)所示，在浓度为256μM时，小肽对细胞活力产生了一定影响，故而，实验采用64μM和128μM为研究浓度进行后续实验。
采用实施例1中标题②和③中方法测定64μM和128μM小肽AYPF体外降脂效果。结果表明，小肽AYPF可以显著降低PA诱导所致的脂滴分泌增加(见图5(B)和(C))，采用PA诱导的Hep G2细胞中脂质含量达到了198.89±3.37％(以空白对照为100％计算)，采用64μM和128μM小肽AYPF干预的情况下，细胞中脂质含量仅为138.91±1.54％和117.84±1.60％。由图5(D)可见，正常Hep G2细胞中甘油三酯含量为38.04±3.18μmol/gprot，采用PA诱导的HepG2细胞中甘油三酯含量为117.89±11.78μmol/gprot，采用64μM和128μM小肽AYPF干预的情况下，细胞中甘油三酯含量仅为73.25±7.12μmol/gprot和62.83±4.51μmol/gprot，说明了小肽AYPF可以显著缓解胞内甘油三酯含量的升高，且呈现剂量依赖，可以认为该小肽具备较好体外降脂效果。
综上所述，本发明小肽AYPF具有良好的降脂活性，能够显著缓解由PA诱导的HepG2细胞的脂质累积，降低细胞内甘油三酯(TG)含量，可以应用于制备具有降脂活性的药物、化妆品或功能性产品中。

Claims (6)

1.一种具有降脂活性的小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述小肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将泥鳅蛋白采用蛋白酶酶解，得到酶解产物；（2）取所述酶解产物采用超滤膜分离，取分子量小于3 kDa的组分；（3）将所述分子量小于3 kDa的组分经葡聚糖凝胶Sephadex G-15过滤分离，得到所述小肽；步骤（1）中将泥鳅蛋白依次采用菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶酶解；步骤（1）所述菠萝蛋白酶酶解时间为4-6 h，碱性蛋白酶酶解时间为0.5-1.5 h。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤（2）中所述超滤膜的截留分子量为3kDa。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤（3）采用葡聚糖凝胶Sephadex G-15过滤分离中，采用去离子水进行洗脱，洗脱流速为0.8 ml/min，取保留时间为125-155 min的洗脱液，得到所述小肽。
5.权利要求1所述小肽在制备具有降脂活性的药物、化妆品中的应用。
6.含有权利要求1所述小肽的药物、化妆品。
CN202211092181.6A 2022-09-07 2022-09-07 一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用 Active CN115947778B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211092181.6A CN115947778B (zh) 2022-09-07 2022-09-07 一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用
US18/461,604 US20240084357A1 (en) 2022-09-07 2023-09-06 Oligopeptide with lipid-lowering activity, preparation method and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211092181.6A CN115947778B (zh) 2022-09-07 2022-09-07 一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115947778A CN115947778A (zh) 2023-04-11
CN115947778B true CN115947778B (zh) 2023-12-08

Family

ID=87284782

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211092181.6A Active CN115947778B (zh) 2022-09-07 2022-09-07 一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20240084357A1 (zh)
CN (1) CN115947778B (zh)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106615485A (zh) * 2017-03-17 2017-05-10 福州市佳传宝生物科技有限公司 一种治疗高血压、高血脂和高血糖的食疗营养保健茶
CN107201389A (zh) * 2017-06-05 2017-09-26 深圳知本康业有限公司 一种花生蛋白多肽及其应用
CN108531532A (zh) * 2018-04-17 2018-09-14 南京财经大学 一种大豆蛋白肽及其制备方法和应用
CN108651895A (zh) * 2018-03-30 2018-10-16 江南大学 一种即食鳗鳅的制备方法及其产品
CN109485744A (zh) * 2018-05-21 2019-03-19 福建省尤溪仙锦药业有限公司 一种泥鳅多糖提取方法及其应用
CN111499707A (zh) * 2020-04-20 2020-08-07 南京财经大学 一种降糖降脂肽及其应用
CN111556749A (zh) * 2017-11-01 2020-08-18 加利福尼亚大学董事会 靶向凋亡抑制蛋白的新型药物
CN113444162A (zh) * 2021-07-08 2021-09-28 南京财经大学 具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用
KR102529289B1 (ko) * 2022-10-07 2023-05-08 대한민국 항균 효과를 가지는 미꾸라지 NK-lysin 유래 항균 펩타이드 유도체
CN116617271A (zh) * 2023-05-24 2023-08-22 武汉真福创新生物制药有限公司 一种枯草芽孢杆菌发酵分级产物及其制备方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6753407B2 (en) * 2000-08-15 2004-06-22 North Carolina State University Antimicrobial peptides isolated from fish
WO2006063028A2 (en) * 2004-12-07 2006-06-15 The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Acting On Behalf Of Arizona State University Immunostimulatory compositions and uses thereof

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106615485A (zh) * 2017-03-17 2017-05-10 福州市佳传宝生物科技有限公司 一种治疗高血压、高血脂和高血糖的食疗营养保健茶
CN107201389A (zh) * 2017-06-05 2017-09-26 深圳知本康业有限公司 一种花生蛋白多肽及其应用
CN111556749A (zh) * 2017-11-01 2020-08-18 加利福尼亚大学董事会 靶向凋亡抑制蛋白的新型药物
CN108651895A (zh) * 2018-03-30 2018-10-16 江南大学 一种即食鳗鳅的制备方法及其产品
CN108531532A (zh) * 2018-04-17 2018-09-14 南京财经大学 一种大豆蛋白肽及其制备方法和应用
CN109485744A (zh) * 2018-05-21 2019-03-19 福建省尤溪仙锦药业有限公司 一种泥鳅多糖提取方法及其应用
CN111499707A (zh) * 2020-04-20 2020-08-07 南京财经大学 一种降糖降脂肽及其应用
CN113444162A (zh) * 2021-07-08 2021-09-28 南京财经大学 具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用
KR102529289B1 (ko) * 2022-10-07 2023-05-08 대한민국 항균 효과를 가지는 미꾸라지 NK-lysin 유래 항균 펩타이드 유도체
CN116617271A (zh) * 2023-05-24 2023-08-22 武汉真福创新生物制药有限公司 一种枯草芽孢杆菌发酵分级产物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Changes in the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates during a simulated gastrointestinal digestion;Lijun You 等;《Food Chemistry》;第120卷(第3期);第810-816页 *
酶法制备大豆蛋白成骨活性肽;翁泽斌等;《中国农业科学》;第54卷(第13期);第2885-2894页 *
酶解泥鳅蛋白制备小分子肽的工艺研究;游丽君等;《食品与发酵工艺》;第32卷(第9期);第164-167页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20240084357A1 (en) 2024-03-14
CN115947778A (zh) 2023-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11673925B2 (en) Oligopeptide with anti-inflammatory activity, preparation method, and application thereof
CN112940093A (zh) 促进成骨细胞增殖的小肽
CN113755441B (zh) 一种肺癌微肿瘤细胞模型的培养方法
CN112812155B (zh) 一种促进成骨细胞增殖的小肽
CN115947778B (zh) 一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用
CN112245342A (zh) 一种人参系列护肤提取物及其制备方法和应用
CN116649580A (zh) 小分子阿胶多肽制品的制备方法
CN114032267B (zh) 一种活性肽的制备方法和应用
CN109369781A (zh) 一种麒麟菜抗氧化四肽及其应用
CN113004384B (zh) 一种海参肠促成骨肽的制备方法及其应用
CN115537442A (zh) 一种蛋黄磷酸肽及其高效富集制备方法与应用
CN115260295A (zh) 一种具有抗氧化功能的生物活性肽tdefqlhtnvndgtefggsiyqk
CN111763243A (zh) 小公鱼免疫活性肽及其制备方法和用途
CN117069798B (zh) 一种抗炎活性的藜麦小肽及其制备方法和应用
CN115651066B (zh) 一种海参多肽、制作工艺及其应用
CN116421708B (zh) 鸽蛋清中卵白蛋白的提取及其在伤口修复方面的应用
CN109400677A (zh) 一种麒麟菜降血脂四肽及其应用
WO2006029494A1 (en) Extraction of growth and differentiating factors from colostrum
CN114403455B (zh) 一种具有免疫调节活性的鳕鱼肽及其应用
CN112048534B (zh) 一种具有提高白藜芦醇功效活性的马鲛鱼蛋白水解物及其制备方法
CN109400679B (zh) 一种源于黄姑鱼鱼鳔的降血脂六肽及其应用
CN115057921A (zh) 一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽及规模化制备方法
CN116804042A (zh) 一种多肽及其组合物与应用
CN118063529A (zh) 黑果枸杞中的矮牵牛素类衍生物furanopetanin及其提取方法和用途
CN117965668A (zh) 一种具有抗氧化和抗衰老功能的牛骨胶原蛋白肽及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant