CN115057921A - 一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽及规模化制备方法 - Google Patents

一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽及规模化制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及到一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽及其规模化制备方法。不同于以往的海马专利文献报道中普遍采用的以海马为原料直接进行生物酶解的方法，本发明先从灰海马众多的蛋白中，筛选出抗氧化活性最强的灰海马酶溶性胶原蛋白(PSC)作为酶解的母体，再进行生物酶解与活性筛选，最终获得蛋白来源明确和功能活性显著的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽；由此解决了海马多肽的蛋白来源不清楚，质量控制困难、产品生物活性不稳定、制备工艺重现性不高的难题。

Description

一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽及规模化制备方法
技术领域
本发明涉及到一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽及规模化制备方法， 涉及生物提取与酶解技术，属于食品领域。
背景技术
海马，鱼纲，海龙目，海马属(Hippocampus)，是传统中医药的重要组成部分， 具有强身健体、补肾壮阳、舒筋活络、消炎止痛、镇静安神、止咳平喘等药用功能。《中国药 典》记载5种海马：线纹海马、刺海马、大海马、三斑海马或小海马(海蛆)。国家食品药品 监督管理总局(CFDA)注册有11种海马保健品以及10种海马药品。现代研究表明，海马的 药理活性广泛，具有抗肿瘤，抗疲劳，抗衰老，抗血栓，消炎镇痛和性激素样作用。
本发明的原料：灰海马(Hippocampus erectus)，是原产自美洲的海马品种， 其与其他海马相比，具有生长速度快、成活率高、抗病能力强等的特点。2010年由上海市水 产研究所引进后，目前已经成功实现工厂化养殖，并达到90％以上的成活率。相关专利文献 调研结果显示：海马的抗氧化或抗疲劳研究主要集中在三斑海马、刺海马、大海马，而针对 灰海马的研究，主要集中在养殖和营养成分分析方面，尚未发现提取分离纯化筛选灰海马抗氧化或抗疲劳活性组份的研究报道。
在海马活性组份制备方面，除了甾体类和磷脂类等脂溶性成分以及氨基酸和微量元素等小分子化合物以外，海马蛋白质的酶解液现已成为研究的热点。相关涉及的专利技 术包括：“一种从海马提取短肽的方法”、“一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法”、 “一种海马胰蛋白酶酶解液及其作为抗氧化剂的应用”、“一种海马有效成分的提取方法”、“一 种具有抗氧化、抗疲劳活性的海马多肽及其制备工艺”、“一种海马多肽酶解液的制备方法”、 “海马提取物的新用途”和“一种多肽-凝结多糖复合凝胶及其制备方法”等。这些专利技术 都是采用以海马为原料直接进行生物酶解(单一酶解或复合酶解)的方法。然而，海马体内 是含有众多的蛋白，且这些蛋白随着时间和环境的变化，其蛋白种类和含量也不断地发生变 化，如：大海马与小海马、怀孕的海马和未怀孕的海马，它们体内的蛋白种类和含量就有很 大的区别；这就导致不同时间段和生理环境的海马的药理活性完全不同。如果仍然采用以往 海马专利文献报道中对海马直接进行生物酶解的方法，将很难保证在不同时间段和生理环境 的条件下，海马酶解产物的生物活性是稳定一致的且其蛋白来源是清楚明确的；同时也很难 保证海马酶解工艺的重现性；并最终导致海马活性组份制备工艺的质量控制困难的事实情况。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一个全新的思路，即，先从灰海马众多的蛋白中，筛选 出抗氧化活性最强的灰海马酶溶性胶原蛋白(PSC)作为酶解的母体，再进行生物酶解，以获 得蛋白来源明确、功能活性显著的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽；从而一举解决了海马多肽的蛋白来源不清楚、产品生物活性不稳定、制备工艺重现性不高、质量控制困难的难题。
本发明提供一种工艺流程简洁新颖、生产耗时少、生产效率高、蛋白来源明 确和功能活性显著的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，以期解决海马多肽长期存在的蛋白来源不清楚，质量控制困难、产品生物活性不稳定、制备工艺重现性不高的难题，实现灰海马原料的高值化开发利用。
为解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是：
一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于，其步骤如下： (1)灰海马酶溶性胶原蛋白(PSC)提取与分离纯化
将灰海马剪成0.2～0.5cm的小段，添加0.05～10mol/L的弱酸作为提取剂，灰海马与提 取剂的重量比为1:5～1:10，同时加入原料重量0.05％～5％的胃蛋白酶并进行2～4小时的匀 浆提取，匀浆速度为10000～28000转/分，伴随搅拌散热以维持提取温度为4～10℃；提取 液先进行冷冻离心过滤，离心上清液再通过膜分离工艺技术进行分离纯化。上清液先用孔径 为1～0.2μm的微滤膜去除肉眼未见的细微残渣或可能的热原，透过液再用相对分子量为 150kDa～100kDa的超滤膜去除残余的胃蛋白酶、小分子杂质和无机盐，浓缩得到灰海马酶溶 性胶原蛋白溶液；
(2)灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的生物酶解与分离纯化
将灰海马酶溶性胶原蛋白溶液投入反应釜中，加入灰海马重量0.005％～0.020％的木瓜蛋 白酶或胰蛋白酶，加入碱溶液调节pH值6.5～8.5之间，反应温度为37～55℃，反应时间为 30～60分钟。酶解液也是通过膜分离工艺技术进行分离纯化。酶解液先用相对分子质量为 10kDa～5kDa的纳滤膜去除残余的蛋白酶和大分子杂质，所得清液再用相对分子质量为 500Da～200Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，并进一步浓缩得到含量≥95％的灰海马抗 氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液；
(3)冷冻干燥
冷冻干燥灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液，得到灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原 蛋白肽固体成品。
所述步骤(1)所使用的弱酸为醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸。
所述步骤(1)所使用的离心机为6000～15000rpm的高速冷冻离心机，离心 20～30分钟。
所述步骤(1)分离纯化步骤所使用的孔径为1～0.2μm的微滤膜流速为100～ 2000立方米/(小时×平方米)，膜压力为0.1～0.6Mpa，温度为0～10℃；所使用的相对分 子量为150kDa～100kDa的超滤膜流速为100～1200立方米/(小时×平方米)，膜压力为0.1～0.6Mpa，温度为0～10℃。
所述步骤(2)所使用的碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
所述步骤(2)所使用的相对分子质量为10kDa～5kDa的纳滤膜流速为5～ 14立方米/小时，膜压力为0.5～1.0Mpa，温度为20～50℃；所使用的相对分子质量为500Da～200Da的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.5～4.5Mpa，温度为20～50℃。
所述步骤(3)中所使用的冷冻干燥的隔板温度为-10～-20℃、真空度为 13.33Pa、冻干时间为12～36小时。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明工艺的思路新颖、条理明确，不同于以往的海马专利文献报道中普 遍采用的以海马为原料直接进行生物酶解的方法，而是先从灰海马众多的蛋白中，筛选出抗 氧化活性最强的灰海马酶溶性胶原蛋白(PSC)作为酶解的母体，再进行生物酶解，获得蛋白来源明确的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽。由此不仅解决了海马多肽的蛋白来源不清 楚，质量控制困难、产品生物活性不稳定、制备工艺重现性不高的难题；而且，由于本发明 首先制备出灰海马PSC，后续的生物酶解所需蛋白酶的用量极少(仅为灰海马重量的0.005％～ 0.020％)，所需的酶解时间也可以控制在1个小时以内(30～60分钟)，因此，本发明可以极 大地减少试剂成本和时间投入。
2.本发明生产的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽(灰海马PSC胰蛋白酶 酶解产物(样品编号：I，1号样品组)和灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2 号样品组))功能活性显著：其在体外抗氧化活性检测方面(FRAP法、ABTS法和Fenton法)， 明显优于其他灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物；而且其在体内抗氧化实验的两 项指标(血清SOD活力和MDA含量)方面，也表现出显著的升高抗氧化酶活力作用和降低脂 质过氧化作用；不仅如此，其在小鼠负重游泳实验结果阳性，且血清乳酸和尿素二项生化指 标也呈阳性，可判定其具有缓解体力疲劳功能的作用。因此，本发明生产的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽有望作为临床营养品或蛋白营养补充剂直接食用；甚至具备开发成为缓 解人体疲劳的保健食品或抗氧化功能食品的巨大潜质。
附图说明
图1是本发明方法：一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方 法的工艺流程图。
图2是灰海马经过不同处理方法得到的产物的铁离子还原/抗氧化能力对比图 (n＝3)。
图3是灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物的铁离子还原/抗氧化能 力对比图(n＝3)。
图4是灰海马经过不同处理方法得到的产物的ABTS抗氧化能力对比图(n＝3)。
图5是灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物的ABTS抗氧化能力对比 图(n＝3)。
图6是灰海马经过不同处理方法得到的产物的抑制羟自由基能力对比图(n＝3)。
图7是灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物的抑制羟自由基能力对比 图(n＝3)。
图8是灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物的凝胶色谱图。
图9是灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物的凝胶色谱图。
图10是灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的体内抗氧化实验测定的小鼠血 清超氧化物歧化酶(SOD)活力结果(阴性对照组——去离子水；阳性对照组——红牛功能饮料；1号样品组(低浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；1号样品组 (高浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL；2号样品组(低浓度)—— 灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；2号样品组(高浓度)——灰海马PSC 木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL)(*——P<0.05为显著相关；**——P<0.01为极显著相 关)(n＝10)。
图11是灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的体内抗氧化实验测定的小鼠血 清丙二醛(MDA)含量结果(阴性对照组——去离子水；阳性对照组——红牛功能饮料；1号 样品组(低浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；1号样品组(高浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL；2号样品组(低浓度)——灰海马 PSC木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；2号样品组(高浓度)——灰海马PSC木瓜蛋白 酶酶解产物，浓度：3mg/mL)(*——P<0.05为显著相关；**——P<0.01为极显著相关)(n＝10)。
图12是灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的缓解体力疲劳功能实验测定的 小鼠负重游泳时间结果(阴性对照组——去离子水；阳性对照组——红牛功能饮料；1号样 品组(低浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；1号样品组(高浓度) ——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL；2号样品组(低浓度)——灰海马PSC 木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；2号样品组(高浓度)——灰海马PSC木瓜蛋白酶 酶解产物，浓度：3mg/mL)(*——P<0.05为显著相关；**——P<0.01为极显著相关)(n＝10)。
图13是灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的缓解体力疲劳功能实验测定的 小鼠血清尿素氮含量结果(阴性对照组——去离子水；阳性对照组——红牛功能饮料；1号 样品组(低浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；1号样品组(高浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL；2号样品组(低浓度)——灰海马 PSC木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；2号样品组(高浓度)——灰海马PSC木瓜蛋白 酶酶解产物，浓度：3mg/mL)(*——P<0.05为显著相关；**——P<0.01为极显著相关)(n＝10)。
图14是灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的缓解体力疲劳功能实验测定的 小鼠血清乳酸脱氢酶活性结果(阴性对照组——去离子水；阳性对照组——红牛功能饮料；1号样品组(低浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；1号样品组(高 浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL；2号样品组(低浓度)——灰海 马PSC木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；2号样品组(高浓度)——灰海马PSC木瓜 蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL)(*——P<0.05为显著相关；**——P<0.01为极显著相关) (n＝10)。
图15是灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的缓解体力疲劳功能实验测定的 小鼠血清乳酸含量结果(阴性对照组——去离子水；阳性对照组——红牛功能饮料；1号样 品组(低浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；1号样品组(高浓度) ——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL；2号样品组(低浓度)——灰海马PSC 木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；2号样品组(高浓度)——灰海马PSC木瓜蛋白酶 酶解产物，浓度：3mg/mL)(*——P<0.05为显著相关；**——P<0.01为极显著相关)(n＝10)。
图16是灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的缓解中枢疲劳功能实验测定的 小鼠脑浆上清液的多巴胺含量结果(阴性对照组——去离子水；阳性对照组——红牛功能饮料；1号样品组(低浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；1号样品组 (高浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL；2号样品组(低浓度)—— 灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；2号样品组(高浓度)——灰海马PSC 木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL)(*——P<0.05为显著相关；**——P<0.01为极显著相 关)(n＝6)。
图17是灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的缓解中枢疲劳功能实验测定的 小鼠脑浆上清液的去甲肾上腺素含量结果(阴性对照组——去离子水；阳性对照组——红牛功能饮料；1号样品组(低浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；1号 样品组(高浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL；2号样品组(低浓度) ——灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；2号样品组(高浓度)——灰海马 PSC木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL)(*——P<0.05为显著相关；**——P<0.01为极显 著相关)(n＝6)。
表1是灰海马经过不同处理方法得到的产物，以及灰海马PSC经过不同酶解方 法得到的酶解产物的样品名称与样品编号对照表。
表2是灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物的分子量结果汇总表。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述。
实施例1：
一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，步骤如下：
(1)灰海马酶溶性胶原蛋白(PSC)提取与分离纯化
将灰海马剪成0.2cm的小段，添加1mol/L的柠檬酸作为提取剂，灰海马与提取剂的重量 比为1:5，同时加入原料重量0.5％的胃蛋白酶并进行2.5小时的匀浆提取，匀浆速度为18000 转/分，伴随搅拌散热以维持提取温度为5℃；提取液先进行冷冻离心过滤，所使用的离心机 为14000rpm的高速冷冻离心机，离心30分钟；离心上清液再通过膜分离工艺技术进行分离 纯化。上清液先用孔径为0.2μm的微滤膜去除肉眼未见的细微残渣或可能的热原，微滤膜流 速为1000立方米/(小时×平方米)，膜压力为0.2Mpa，温度为4℃；透过液再用相对分子量 为100kDa的超滤膜截留，超滤膜流速为450立方米/(小时×平方米)，膜压力为0.2Mpa， 温度为5℃，浓缩得到灰海马酶溶性胶原蛋白溶液；
(2)灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的生物酶解与分离纯化
将灰海马酶溶性胶原蛋白溶液投入反应釜中，加入灰海马重量0.01％的胰蛋白酶，加入 氢氧化钠溶液调节pH为8.5，反应温度为37℃，反应时间为55分钟。酶解液也是通过膜分 离工艺技术进行分离纯化。酶解液先用相对分子质量为10kDa的纳滤膜去除大分子杂质和残 余的胰蛋白酶，流速为8立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为25℃；再用相对分子质 量为500Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为5立方米/小时，膜压力为2.758Mpa， 温度为35℃；进一步浓缩得到含量为98.55％的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液；
(3)冷冻干燥
冷冻干燥灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液，设定隔板温度为-15℃、真空度为 13.33Pa、冻干时间为24小时。即得灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽固体成品。
实施例2：
一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，步骤如下：
(1)灰海马酶溶性胶原蛋白(PSC)提取与分离纯化
将灰海马剪成0.4cm的小段，添加0.5mol/L的苹果酸作为提取剂，灰海马与提取剂的重 量比为1∶8，同时加入原料重量0.25％的胃蛋白酶并进行4小时的匀浆提取，匀浆速度为16000 转/分，伴随搅拌散热以维持提取温度为8℃；提取液先进行冷冻离心过滤，所使用的离心机 为12500rpm的高速冷冻离心机，离心20分钟；离心上清液再通过膜分离工艺技术进行分离 纯化。上清液先用孔径为0.4μm的微滤膜去除肉眼未见的细微残渣或可能的热原，微滤膜流 速为1800立方米/(小时×平方米)，膜压力为0.3Mpa，温度为5℃；透过液再用相对分子量 为150kDa的超滤膜截留，超滤膜流速为600立方米/(小时×平方米)，膜压力为0.3Mpa， 温度为4℃；浓缩得到灰海马酶溶性胶原蛋白溶液；
(2)灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的生物酶解与分离纯化
将灰海马酶溶性胶原蛋白溶液投入反应釜中，加入灰海马重量0.008％的木瓜蛋白酶，加 入氢氧化钾溶液调节pH为6.5，反应温度为55℃，反应时间为45分钟。酶解液也是通过膜 分离工艺技术进行分离纯化。酶解液先用相对分子质量为5kDa的纳滤膜去除大分子杂质和残 余的木瓜蛋白酶，流速为6立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为30℃；再用相对分子 质量为200Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为4立方米/小时，膜压力为3.85Mpa， 温度为35℃，进一步浓缩得到含量为97.85％的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液；
(3)冷冻干燥
冷冻干燥灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液，设定隔板温度为-20℃、真空度为 13.33Pa、冻干时间为18小时。即得灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽固体成品。
如表1所示，灰海马经过不同处理方法得到的产物，以及灰海马PSC经过不同 酶解方法得到的酶解产物的样品名称与其样品编号一一对应。其中，灰海马PSC(样品编号： A)的制备方法为本发明实施例1的步骤(1)灰海马酶溶性胶原蛋白(PSC)提取与分离纯化 的制备方法；灰海马ASC(样品编号：B)的制备方法是在本发明实施例1的步骤(1)灰海 马酶溶性胶原蛋白(PSC)提取与分离纯化的制备方法的基础上，不加入胃蛋白酶进行制备； 灰海马胃蛋白酶酶解产物(样品编号：C)是在本发明实施例1的步骤(1)灰海马酶溶性胶 原蛋白(PSC)提取与分离纯化的制备方法的基础上，将提取温度提高到37℃且不实施分离 纯化进行制备；灰海马胃+胰蛋白酶酶解产物(样品编号：D)模拟了灰海马在人体的胃肠道 消化的过程，具体如下：灰海马加入自身重量5倍的乙酸溶液和0.5％的胃蛋白酶，控制pH 为2，在37℃条件下，酶解6小时；再调节pH为8.5，加入0.5％胰蛋白酶，在50℃条件下， 酶解8小时即可。灰海马传统水煮产物(样品编号：E)是将灰海马加入自身重量5倍的去离 子水，在95℃条件下，水煮6小时即可；灰海马脱钙水煮产物(样品编号：F)是将灰海马 先经过5％盐酸脱钙，时间为1小时，而后再加入自身重量5倍的去离子水，在95℃条件下， 水煮6小时即可；灰海马硫酸水煮产物(样品编号：G)是将灰海马加入自身重量5倍的稀硫 酸溶液中，控制pH为2，在95℃条件下，水煮3小时即可；灰海马PSC中性蛋白酶酶解产物 (样品编号：H)是在本发明实施例1的步骤(2)灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的生 物酶解与分离纯化的制备方法的基础上，加入灰海马重量0.01％的中性蛋白酶，调节pH为7， 反应温度为50℃，反应时间为60分钟，其他条件不变下进行制备；灰海马PSC胰蛋白酶酶 解产物(样品编号：I)是本发明实施例1的制备方法；灰海马PSC菠萝蛋白酶酶解产物(样 品编号：J)是在本发明实施例1的步骤(2)灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的生物酶 解与分离纯化的制备方法的基础上，加入灰海马重量0.01％的菠萝蛋白酶，调节pH为6，反 应温度为53℃，反应时间为60分钟，其他条件不变下进行制备；灰海马PSC海产蛋白酶酶 解产物(样品编号：K)是在本发明权利要求书的步骤(2)灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋 白肽的生物酶解与分离纯化的制备方法的基础上，加入灰海马重量0.01％的海产蛋白酶，调 节pH为7，反应温度为55℃，反应时间为60分钟，其他条件不变下进行制备；灰海马PSC 风味蛋白酶酶解产物(样品编号：L)是在本发明实施例1的步骤(2)灰海马抗氧化抗疲劳 活性胶原蛋白肽的生物酶解与分离纯化的制备方法的基础上，加入灰海马重量0.01％的风味 蛋白酶，调节pH为6.5，反应温度为53℃，反应时间为60分钟，其他条件不变下进行制备； 灰海马PSC碱性蛋白酶酶解产物(样品编号：M)是在本发明实施例1的步骤(2)灰海马抗 氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的生物酶解与分离纯化的制备方法的基础上，加入灰海马重量 0.01％的碱性蛋白酶，调节pH为9，反应温度为55℃，反应时间为60分钟，其他条件不变下 进行制备；灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N)是本发明实施例2的制备方法。
图2、图4和图6是通过三种不同机理的体外抗氧化活性检测方法(FRAP法、 ABTS法和Fenton法)测定灰海马经过不同处理方法得到的产物的铁离子还原/抗氧化能力、 ABTS抗氧化能力和抑制羟自由基能力，结果如图2、图4和图6所示：灰海马PSC(样品编 号：A)的体外抗氧化活性明显优于其他灰海马经过不同处理方法得到的产物，因此，灰海马 PSC(样品编号：A)被选为下一步的酶解反应的母体。
图3、图5和图7是通过三种不同机理的体外抗氧化活性检测方法(FRAP法、 ABTS法和Fenton法)测定灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物的铁离子还原/抗氧 化能力、ABTS抗氧化能力和抑制羟自由基能力，结果如图3、图5和图7所示：灰海马PSC 胰蛋白酶酶解产物(样品编号：I)和灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N)的体 外抗氧化活性均明显优于其他灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物，因此，灰海马 PSC胰蛋白酶酶解产物(样品编号：I)和灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N) 分别被选做本发明的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽。
如图10所示，服用低浓度(0.3mg/mL)和高浓度(3mg/mL)的灰海马抗氧化 抗疲劳活性胶原蛋白肽(灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物(样品编号：I，1号样品组)和灰海 马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2号样品组))，其小鼠血清SOD活力，相对于阴 性对照组(去离子水)，均有显著升高且有统计学意义，判定本发明的灰海马抗氧化抗疲劳活 性胶原蛋白肽有升高抗氧化酶活力作用，该项指标结果阳性。
如图11所示，服用低浓度(0.3mg/mL)和高浓度(3mg/mL)的灰海马抗氧化 抗疲劳活性胶原蛋白肽(灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物(样品编号：I，1号样品组)和灰海 马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2号样品组))，其小鼠血清MDA含量，相对于阴 性对照组(去离子水)，在条件下，均有显著降低且有统计学意义，判定本发明的灰海马抗氧 化抗疲劳活性胶原蛋白肽有降低脂质过氧化作用，该项指标结果阳性。
如图12所示，服用低浓度(0.3mg/mL)和高浓度(3mg/mL)的灰海马抗氧化 抗疲劳活性胶原蛋白肽(灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物(样品编号：I，1号样品组)和灰海 马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2号样品组))，其小鼠负重游泳时间明显长于阴 性对照组(去离子水)，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。
如图13所示，服用低浓度(0.3mg/mL)和高浓度(3mg/mL)的灰海马PSC胰 蛋白酶酶解产物(样品编号：I，1号样品组)，其小鼠血清尿素氮含量明显低于阴性对照组 (去离子水)，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性；而服用低浓度(0.3mg/mL)的灰海 马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2号样品组)，其小鼠血清尿素氮含量明显低于 阴性对照组(去离子水)，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。
如图14所示，服用低浓度(0.3mg/mL)和高浓度(3mg/mL)的灰海马抗氧化 抗疲劳活性胶原蛋白肽(灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物(样品编号：I，1号样品组)和灰海 马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2号样品组))，其小鼠血清乳酸脱氢酶活性，相 对于阴性对照组(去离子水)，均有显著提升且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。乳酸 脱氢酶是无氧代谢中一个重要的酶，能够在乳酸循环中催化乳酸与丙酮酸的相互转变，其活 性的增强既有利于机体通过糖酵解途径获取ATP，也能够加速乳酸的清除，减少乳酸的积累。 由于乳酸是代谢的盲端，其代谢的唯一方式是转变成丙酮酸再沿着丙酮酸的各条代谢途径进行代谢，而乳酸又只有在乳酸脱氢酶的作用下才能生成丙酮酸，所以乳酸脱氢酶活性增强对 于加速乳酸清除意义重大。
如图15所示，服用低浓度(0.3mg/mL)和高浓度(3mg/mL)的灰海马抗氧化 抗疲劳活性胶原蛋白肽(灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物(样品编号：I，1号样品组)和灰海 马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2号样品组))，其小鼠血清乳酸含量，相对于阴 性对照组(去离子水)，均有显著降低且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。
如图16所示，服用低浓度(0.3mg/mL)和高浓度(3mg/mL)的灰海马抗氧化 抗疲劳活性胶原蛋白肽(灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物(样品编号：I，1号样品组)和灰海 马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2号样品组))，其小鼠脑浆上清液的多巴胺含量， 相对于阴性对照组(去离子水)，均有显著升高且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。
如图15所示，服用低浓度(0.3mg/mL)和高浓度(3mg/mL)的灰海马抗氧化 抗疲劳活性胶原蛋白肽(灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物(样品编号：I，1号样品组)和灰海 马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2号样品组))，其小鼠脑浆上清液的去甲肾上腺 素含量，相对于阴性对照组(去离子水)，均有显著升高且差异有显著性，可判定该实验结果 阳性。
综上所述，本发明制备的灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物(样品编号：I，1号 样品组)和灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2号样品组)在体外抗氧化活性 检测方面(FRAP法、ABTS法和Fenton法)，明显优于其他灰海马PSC经过不同酶解方法得到 的酶解产物；而且在体内抗氧化实验的两项指标(血清SOD活力和MDA含量)方面，也表现 出显著的升高抗氧化酶活力作用和降低脂质过氧化作用；不仅如此，其在小鼠负重游泳实验 结果阳性，且血清乳酸和尿素二项生化指标呈阳性，可判定其具有缓解体力疲劳功能的作用； 同时，测定它们对运动性小鼠中枢神经系统神经递质影响的结果显示：小鼠脑浆上清液的多巴胺和去甲肾上腺素含量均有显著升高，预示两者还具有缓解中枢疲劳功能的作用；最后再 鉴于其还是来自灰海马PSC的酶解产物；因此，本发明制备的灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物 (样品编号：I，1号样品组)和灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2号样品组)完全可以被称为是灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽。
表1
Figure BDA0003652400470000131
表2
Figure BDA0003652400470000132

Claims (10)

1.一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)灰海马酶溶性胶原蛋白PSC提取与分离纯化
将灰海马剪成0.2～0.5cm的小段，添加0.05～10mol/L的弱酸作为提取剂，灰海马与提取剂的重量比为1:5～1:10，同时加入原料重量0.05％～5％的胃蛋白酶并进行2～4小时的匀浆提取，匀浆速度为1000～28000转/分，伴随搅拌散热以维持提取温度为4～10℃；提取液先进行冷冻离心过滤，离心上清液再通过膜分离工艺技术进行分离纯化：上清液先用孔径为1～0.2μm的微滤膜去除肉眼未见的细微残渣或可能的热原，透过液再用相对分子量为150kDa～100kDa的超滤膜去除残余的胃蛋白酶、小分子杂质和无机盐，浓缩得到灰海马酶溶性胶原蛋白溶液；
(2)灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的生物酶解与分离纯化
将灰海马酶溶性胶原蛋白溶液投入反应釜中，加入灰海马重量0.005％～0.020％的木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，加入碱溶液调节pH值6.5～8.5之间，反应温度为37～55℃，反应时间为30～60分钟；酶解液也是通过膜分离工艺技术进行分离纯化：酶解液先用相对分子质量为10kDa～5kDa的纳滤膜去除残余的蛋白酶和大分子杂质，所得清液再用相对分子质量为500Da～200Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，并进一步浓缩得到含量≥95％的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液；
(3)冷冻干燥
冷冻干燥灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液，得到灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽固体成品。
2.根据权利要求1所述一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：步骤(1)中所使用的弱酸为醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸。
3.根据权利要求1所述一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述冷冻离心过滤步骤所使用的离心机为6000～15000rpm的高速冷冻离心机，离心20～30分钟。
4.根据权利要求1所述一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述分离纯化步骤所使用的孔径为1～0.2μm的微滤膜流速为100～2000立方米/(小时×平方米)，膜压力为0.1～0.6Mpa，温度为0～10℃。
5.根据权利要求1所述一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：步骤(1)中所使用相对分子量为150kDa～100kDa的超滤膜流速为100～1200立方米/(小时×平方米)，膜压力为0.1～0.6Mpa，温度为0～10℃。
6.根据权利要求1所述一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：步骤(2)所使用的碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
7.根据权利要求1所述一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：步骤(2)所使用的相对分子质量为10kDa～5kDa的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.5～1.0Mpa，温度为20～50℃。
8.根据权利要求1所述一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：步骤(2)所使用的相对分子质量为500Da～200Da的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.5～4.5Mpa，温度为20～50℃。
9.根据权利要求1所述一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：步骤(3)中所使用的冷冻干燥的隔板温度为-10～-20℃、真空度为13.33Pa、冻干时间为12～36小时。
10.一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽，其特征在于，根据权利要求1-9任一项的制备方法得到。
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