CN116407572A - 一种沙棘提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种沙棘提取物及其制备方法和应用，属于沙棘技术领域。将沙棘果榨汁后，果肉和汁液混合，超声波辅助提取，分别收集沙棘汁和果渣，沙棘汁中加入乙醇沉淀，收集沉淀物和上层清液；将果渣用复合酶酶解，得到酶解液和渣料；将上层清液和酶解液混加入混合溶剂提取，得到提取物，将渣料、水层、碳源和氮源混合均匀，加入无菌水，灭菌，制得沙棘发酵培养基，接种酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液发酵，得到发酵产物，将沉淀物、提取物、发酵产物混合均匀，制备成微胶囊，得到沙棘提取物。本发明制得的沙棘提取物具有良好的提高免疫力、降血糖、降血脂、保护胃黏膜、抗氧化、抗炎等效果，具有广阔的应用前景。

Description

一种沙棘提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及沙棘技术领域，具体涉及一种沙棘提取物及其制备方法和应用。
背景技术
沙棘果为胡颓子科沙棘属植物沙棘的果实，又名醋柳果，酸刺果。沙棘果是一种小浆果植物，落叶灌木或小乔木。沙棘是目前世界上含有天然维生素种类最多的珍贵经济林树种，其维生素C的含量远远高于鲜枣和猕猴桃，从而被誉为天然维生素的宝库。沙棘果实营养丰富，据测定其果实中含有多种维生素、黄酮类化合物、三萜类化合物、油和脂肪酸、酚类、挥发油类、微量元素、磷脂类、5-羟色胺等活性物质和人体所需的各种氨基酸和蛋白质。
沙棘具有很高的营养价值、生态价值和经济价值、尤其是在“三北”防护林建设中具有重要的作用。沙棘还可以治疗烧伤、放射病、心脏病、青光眼等疾病，具有独特的药用价值，其果皮中的营养物质很高，甚至比果汁中的营养物质含量还高。
目前沙棘广泛应用于沙棘果汁、沙棘原浆液的生产，在生产过程中，将沙棘榨汁后会产生大量的沙棘果渣，往往会被当作废料丢弃，或生产成干粉当作饲料，价格非常低廉。倘若能更多的开发出沙棘果渣的利用价值，将具有极大的经济意义。
中国专利CN111773257B公开了一种沙棘提取物及其用途，通过热水溶解、过滤的前处理步骤就可得到粗提取物；再经C18填料富集后，可得到多种不同的沙棘提取物。该沙棘提取物的制备过程中还需要C18柱进行纯化富集，其制备难度大，操作困难，给其产业化带来了不小的挑战。
中国专利CN103083370B提供了沙棘总黄酮在制备治疗糖尿病性视网膜病变的药物中的用途。所述的沙棘总黄酮的制备工艺：取沙棘药材，加10倍量水煎煮3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至适量，除去沉淀；浓缩液采用大孔树脂分离，先用4倍柱体积水洗脱，再用4倍柱体积的60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，最后减压干燥，即得沙棘总黄酮提取物。但是，该方法将沙棘中大量的原料弃除，仅仅提取少量的黄酮，造成了大量的浪费。
发明内容
本发明的目的在于提出一种沙棘提取物及其制备方法和应用，制得的沙棘提取物为一种微胶囊化物质，其含有丰富的活性物质包括黄酮类物质、多酚类物质、多糖类物质、氨基酸蛋白肽类物质、脂肪酸类物质等，以及益生菌剂，实现益生菌、活性物质的长期保存的以及靶向将益生菌、活性物质输送至肠道的效果，具有良好的提高免疫力、降血糖、降血脂、保护胃黏膜、抗氧化、抗炎等效果，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种沙棘提取物的制备方法，将沙棘果榨汁后，果肉和汁液混合，超声波辅助提取，分别收集沙棘汁和果渣，沙棘汁中加入乙醇沉淀，收集沉淀物和上层清液；将果渣用复合酶酶解，得到酶解液和渣料；将上层清液和酶解液混加入混合溶剂提取，得到提取物，将渣料、水层、碳源和氮源混合均匀，加入无菌水，灭菌，制得沙棘发酵培养基，接种酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液发酵，得到发酵产物，将沉淀物、提取物、发酵产物混合均匀，制备成微胶囊，得到沙棘提取物。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，超声波辅助提取，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘多糖的醇沉：向步骤S1制得的沙棘汁中加入乙醇，置于0-4℃下沉淀，离心，收集沉淀物和上层清液；
S3.沙棘果渣的酶解：将步骤S1制得的果渣加入水中，加入复合酶，加热酶解，灭酶，过滤，收集酶解液和渣料；
S4.微波加热辅助有机溶剂提取：将步骤S2中的上层清液和步骤S3中的酶解液混合均匀，加入混合溶剂，微波加热辅助提取，分别收集混合溶剂层和水层，浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
S5.沙棘发酵培养基的制备：将步骤S3中的渣料、步骤S4中的水层混合均匀，加入碳源和氮源，加入无菌水，灭菌，制得沙棘发酵培养基；
S6.发酵：将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，发酵，冷冻干燥，得到发酵产物；
S7.沙棘提取物的制备：将步骤S2中的沉淀物、步骤S4中的提取物、步骤S6中的发酵产物混合均匀，加入海藻酸钠和乳清分离蛋白，搅拌均匀，得到水相，加入食用油中，通过快速膜乳化，滴加氯化钙溶液，常温固化，得到沙棘提取物，得到沙棘提取物。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述超声波辅助提取的功率为1200-1500W，时间为30-50min；步骤S2中所述加入乙醇至体系中乙醇含量为70-80wt％，所述沉淀时间为12-24h。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述复合酶选自纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶中的至少两种，优选地，为果胶酶和蛋白酶的混合物，质量比为3-5:2；所述蛋白酶选自中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶中的至少一种，优选地，为中性蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物，质量比为1-3:1；所述果渣和复合酶的质量比为10:1-2；所述加热酶解的温度为50-60℃，时间为2-4h。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为1-2:3-5:4-7，所述上层清液、酶解液和混合溶剂的质量比为3-5:5-7:10-15，所述微波加热辅助提取的功率为800-1200W，加热至温度为45-55℃，时间为1-3h；步骤S5中所述渣料、水层、碳源、氮源和无菌水的质量比为3-5:15-20:5-10:4-6:150-200。
优选地，所述碳源选自葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、异麦芽糖、低聚果糖、阿拉伯糖中的至少一种；所述氮源选自蛋白胨、鱼粉、硝酸盐、铵盐、尿素中的至少一种；所述硝酸盐选自硝酸钠、硝酸钾、硝酸锰、硝酸镁、硝酸铵、硝酸铜、硝酸铁中的至少一种；所述铵盐选自氯化铵、硫酸铵中的至少一种。
优选地，所述渣料、水层、葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、尿素和无菌水的质量比为4:17:5:2:2:3:170。
作为本发明的进一步改进，步骤S6中所述酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液的制备方法为将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，35-37℃，50-70r/min，活化培养18-24h，得到含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液；所述酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为3-5％、0.5-1％、1-2％；所述发酵的温度为36-38℃，时间为36-48h，转速为50-70r/min，CO2含量为5-7％，O2含量为3-5％，其中，％为体积百分比含量。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述沉淀物、提取物、发酵产物、海藻酸钠和乳清分离蛋白的质量比为2-3:5-7:12-15：15-20：12-17；所述快速膜的孔径为100-300微米，所述氯化钙溶液的浓度为3-5wt％，所述常温固化的时间为30-50min；所述水相和食用油的质量比为3-5:6-7。
优选地，所述食用油选自菜籽油、玉米油、花生油、大豆油、橄榄油、亚麻籽油、芝麻油中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，1200-1500W超声波辅助提取30-50min，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘多糖的醇沉：向步骤S1制得的沙棘汁中加入乙醇至体系中乙醇含量为70-80wt％，置于0-4℃下沉淀12-24h，离心，收集沉淀物，收集上层清液；
S3.沙棘果渣的酶解：将10重量份步骤S1制得的果渣加入水中，加入1-2重量份复合酶，加热至50-60℃，酶解2-4h，灭酶，过滤，收集酶解液和渣料；
所述复合酶为果胶酶和蛋白酶的混合物，质量比为3-5:2；
所述蛋白酶为中性蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物，质量比为1-3:1；
S4.微波加热辅助有机溶剂提取：将3-5重量份步骤S2中的上层清液和5-7重量份步骤S3中的酶解液混合均匀，加入10-15重量份混合溶剂，800-1200W微波加热至45-55℃，辅助提取1-3h，分别收集混合溶剂层和水层，浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为1-2:3-5:4-7；
S5.沙棘发酵培养基的制备：将3-5重量份步骤S3中的渣料、15-20重量份步骤S4中的水层混合均匀，加入5-10重量份碳源和4-6重量份氮源，加入150-200重量份无菌水，紫外线灭菌，制得沙棘发酵培养基；
S6.发酵：将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，35-37℃，50-70r/min，活化培养18-24h，得到含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液；将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为3-5％、0.5-1％、1-2％，36-38℃，50-70r/min，CO2含量为5-7％，O2含量为3-5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵36-48h，冷冻干燥，得到发酵产物；
S7.沙棘提取物的制备：将2-3重量份步骤S2中的沉淀物、5-7重量份步骤S4中的提取物、12-15重量份步骤S6中的发酵产物混合均匀，加入水中，加入15-20重量份海藻酸钠和12-17重量份乳清分离蛋白，搅拌均匀。通过孔径为100-300微米的快速膜乳化，滴加3-5wt％的氯化钙溶液，常温固化30-50min，得到沙棘提取物。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的沙棘提取物。
本发明进一步保护一种上述的沙棘提取物在制备保护胃肠粘膜、提高免疫力、降血糖、抗炎、抗氧化的产品中的应用。
本发明具有如下有益效果：沙棘中富含丰富的营养元素，包括黄酮类化合物、多糖类化合物、脂肪酸、蛋白类化合物、多酚类化合物、沙棘甾醇等；其中，黄酮类化合物主要包括：异鼠李素、槲皮素、杨梅素和山奈酚4种苷元类化合物，主要通过消除DPPH·自由基、羟基自由基而提高还原能力，起到抗氧化、防止衰老的作用。沙棘多糖是由葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖组成的中性多糖，能够抗强烈辐射、抗传染病、抗癌、有助于血液凝固的作用。沙棘中脂肪酸含量较高包括肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、六癸酸、硬脂酸、油酸、顺式-伐木酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸和二十烷醇等，其具有改善胰岛素抵抗的功能、缓解干眼症症状、抗抑郁、抗肿瘤等作用。沙棘蛋白质中氨基酸种类丰富，其中必需氨基酸总量超过60％。沙棘中含有丰富的多酚类化合物，包括没食子酸、儿茶素、对香豆素、阿魏酸、芦丁、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、异鼠李酸-3-O-葡萄糖苷和槲皮素，其中以咖啡酸含量最高，其次是原儿茶酸、没食子酸，具有健脑、降血压、改善脂质代谢的作用。由于沙棘中含有丰富的活性物质，通过合适的方法将其提取出来，得到的沙棘提取物具有良好的提高免疫力、降血糖、降血脂、保护胃黏膜、抗氧化、抗炎等效果。
本发明将沙棘果榨汁后，将果肉和汁液混合，超声波辅助提取，将沙棘果中的大量多糖提取出来，同时，避免沸腾提取多糖对沙棘中其他营养物质如蛋白质的破坏，通过水提醇沉的方法，得到大量的沙棘多糖；
进一步，本发明通过复合酶对果渣进行酶解，复合酶包括果胶酶和蛋白酶，果胶酶能降解植物材料使细胞壁结构松散，甚至能完全水解植物材料，将活性成分释放。蛋白酶能够将大量的复杂结构的蛋白质酶解成可溶性小分子肽、短肽及氨基酸，其中，蛋白酶包括中性蛋白酶和无花果蛋白酶，中性蛋白酶能催化蛋白质肽键的水解，具有催化反应速度快、无工业污染、反应条件适应性宽等优点，还能够水解蛋白成小分子肽，大大提高了蛋白的生物效价，使其易为人体消化吸收，同时还提高了溶解，降低了粘度，改善了蛋白的功能特性；无花果蛋白酶是一类巯基蛋白酶，对多种蛋白质均有很好的降解作用，另一方面，无花果蛋白酶还能够很好的抑制沙棘果的褐变，提高对沙棘果果渣原料的保鲜能力，延长保存时间。经过复合酶酶解后，果渣中大部分活性物质溶出，大分子蛋白质酶解成小分子活性肽及氨基酸等，从而大大提高了活性物质被人体吸收的效果，从而大大改善了人体体质，具有很好的降血糖、保护胃黏膜的效果。
进一步，本发明将上层清液和酶解液在微波辅助加热的条件下，加入混合溶剂混合提取，该混合溶剂包括乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，通过合适的溶剂混合，调节混合溶剂对溶质的溶解度，并且通过调节合适的极性，通过相似相溶原理，提高混合溶剂对活性物质，如多酚、黄酮、脂肪酸等的提取，另外，选择低沸点、高溶解性的溶剂进行混合，另外还简化了溶剂去除的方法，通过简单的旋蒸(减压加热去除)就可以将混合溶剂去除，制备方法更加简单。
本发明通过酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的发酵处理沙棘发酵培养基，在发酵过程中，热处理能够促进保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌产酸，产生的甲酸钠同样可以促进保加利亚乳杆菌的生长，另外，嗜热链球菌产生的有机酸也能够初级保加利亚乳杆菌的生长，且能够降解沙棘中的乳糖，使得制得的沙棘提取物能够适用于乳糖不耐酸人群，还能够检索胃酸分泌，促进胃排空；但是，由于嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌无法很好地在大肠中生存繁殖，酿酒酵母通过分泌大量的有益物质，包括短链脂肪酸等，促进嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生存和定植，为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在碱性肠道环境中提供了有利的生存环境，从而起到了很好地肠道菌群调节的作用，间接促进的免疫调节，并且对胃肠道黏膜有一定的保护作用。
本发明将沉淀物、提取物和发酵产物混合均匀后，以海藻酸钠、乳清分离蛋白和氯化钙的混合物为壁材，利用微胶囊技术将活性物质和益生菌进行包埋，减少常规益生菌加工过程中的热、氧化、干燥损伤，实现益生菌、活性物质的长期保存的以及靶向将益生菌、活性物质输送至肠道的效果，有效防止菌种在储存过程中的活力损失，防止活性物质在储存过程中的变质，起到对活性物质的保护、靶向输送和缓控释的效果。
本发明制得的沙棘提取物为一种微胶囊化物质，其含有丰富的活性物质包括黄酮类物质、多酚类物质、多糖类物质、氨基酸蛋白肽类物质、脂肪酸类物质等，以及益生菌剂，实现益生菌、活性物质的长期保存的以及靶向将益生菌、活性物质输送至肠道的效果，具有良好的提高免疫力、降血糖、降血脂、保护胃黏膜、抗氧化、抗炎等效果，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1制得的沙棘提取物微胶囊的SEM图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
果胶酶，30万U/g，货号：FDG-2259；中性蛋白酶，5万U/g，货号：SDG-2430，购于夏盛(北京)生物科技开发有限公司。无花果蛋白酶，80万U/g，购于南京丰鑫全生物科技有限公司。
酿酒酵母，200亿cfu/g，购于潍坊蓝乔精酿啤酒原料有限公司；嗜热链球菌，100亿cfu/g，购于西安神农生物科技有限公司；保加利亚乳杆菌，1000亿cfu/g，购于陕西云奇生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种沙棘提取物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，1200W超声波辅助提取30min，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘多糖的醇沉：向步骤S1制得的沙棘汁中加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，置于0℃下沉淀12h，3000r/min离心15min，收集沉淀物，收集上层清液；
S3.沙棘果渣的酶解：将10重量份步骤S1制得的果渣加入水中，加入1重量份复合酶，加热至50℃，酶解2h，105℃灭酶15min，过滤，收集酶解液和渣料；
所述复合酶为果胶酶和蛋白酶的混合物，质量比为3:2；
所述蛋白酶为中性蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物，质量比为1:1；
S4.微波加热辅助有机溶剂提取：将3重量份步骤S2中的上层清液和5重量份步骤S3中的酶解液混合均匀，加入10重量份混合溶剂，800W微波加热至45℃，辅助提取1h，分别收集混合溶剂层和水层，减压浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为1:3:4；
S5.沙棘发酵培养基的制备：将3重量份步骤S3中的渣料、15重量份步骤S4中的水层混合均匀，加入2重量份葡萄糖、3重量份异麦芽糖、3重量份鱼粉、1重量份尿素，加入150重量份无菌水，紫外线灭菌30min，制得沙棘发酵培养基；
S6.发酵：将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，35℃，50r/min，活化培养18h，得到含菌量为108cfu/mL的菌种种子液；将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为3％、0.5％、1％，36℃，50r/min，CO2含量为5％，O2含量为3％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵36h，冷冻干燥，得到发酵产物；
S7.沙棘提取物的制备：将2重量份步骤S2中的沉淀物、5重量份步骤S4中的提取物、12重量份步骤S6中的发酵产物混合均匀，加入水中，加入15重量份海藻酸钠和12重量份乳清分离蛋白，搅拌15min，得到水相，将30重量份水相加入60重量份花生油中，通过孔径为100微米的快速膜乳化，滴加3wt％的氯化钙溶液，常温固化30min，得到沙棘提取物。图1为制得的沙棘提取物微胶囊的SEM图，由图可知，微胶囊表面致密，形状略不规则。
实施例2
本实施例提供一种沙棘提取物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，1500W超声波辅助提取50min，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘多糖的醇沉：向步骤S1制得的沙棘汁中加入乙醇至体系中乙醇含量为80wt％，置于4℃下沉淀24h，3000r/min离心15min，收集沉淀物，收集上层清液；
S3.沙棘果渣的酶解：将10重量份步骤S1制得的果渣加入水中，加入2重量份复合酶，加热至60℃，酶解4h，105℃灭酶15min，过滤，收集酶解液和渣料；
所述复合酶为果胶酶和蛋白酶的混合物，质量比为5:2；
所述蛋白酶为中性蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物，质量比为3:1；
S4.微波加热辅助有机溶剂提取：将5重量份步骤S2中的上层清液和7重量份步骤S3中的酶解液混合均匀，加入15重量份混合溶剂，1200W微波加热至55℃，辅助提取3h，分别收集混合溶剂层和水层，减压浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为2:5:7；
S5.沙棘发酵培养基的制备：将5重量份步骤S3中的渣料、20重量份步骤S4中的水层混合均匀，加入8重量份麦芽糖、2重量份蔗糖、4重量份鱼粉、2重量份硝酸铵，加入200重量份无菌水，紫外线灭菌30min，制得沙棘发酵培养基；
S6.发酵：将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，37℃，70r/min，活化培养24h，得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为5％、1％、2％，38℃，70r/min，CO2含量为7％，O2含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵48h，冷冻干燥，得到发酵产物；
S7.沙棘提取物的制备：将3重量份步骤S2中的沉淀物、7重量份步骤S4中的提取物、15重量份步骤S6中的发酵产物混合均匀，加入水中，加入20重量份海藻酸钠和17重量份乳清分离蛋白，搅拌15min，得到水相，将50重量份水相加入70重量份菜籽油中，通过孔径为300微米的快速膜乳化，滴加5wt％的氯化钙溶液，常温固化50min，得到沙棘提取物。
实施例3
本实施例提供一种沙棘提取物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，1350W超声波辅助提取40min，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘多糖的醇沉：向步骤S1制得的沙棘汁中加入乙醇至体系中乙醇含量为75wt％，置于2℃下沉淀18h，3000r/min离心15min，收集沉淀物，收集上层清液；
S3.沙棘果渣的酶解：将10重量份步骤S1制得的果渣加入水中，加入1.5重量份复合酶，加热至55℃，酶解3h，105℃灭酶15min，过滤，收集酶解液和渣料；
所述复合酶为果胶酶和蛋白酶的混合物，质量比为4:2；
所述蛋白酶为中性蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物，质量比为2:1；
S4.微波加热辅助有机溶剂提取：将4重量份步骤S2中的上层清液和6重量份步骤S3中的酶解液混合均匀，加入12重量份混合溶剂，1000W微波加热至50℃，辅助提取2h，分别收集混合溶剂层和水层，减压浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为1.5:4:6；
S5.沙棘发酵培养基的制备：将4重量份步骤S3中的渣料、17重量份步骤S4中的水层混合均匀，加入5重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、2重量份蛋白胨、3重量份尿素，加入170重量份无菌水，紫外线灭菌30min，制得沙棘发酵培养基；
S6.发酵：将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，36℃，60r/min，活化培养21h，得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为4％、0.7％、1.5％，37℃，60r/min，CO2含量为6％，O2含量为4％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵40h，冷冻干燥，得到发酵产物；
S7.沙棘提取物的制备：将2.5重量份步骤S2中的沉淀物、6重量份步骤S4中的提取物、13.5重量份步骤S6中的发酵产物混合均匀，加入水中，加入17重量份海藻酸钠和15重量份乳清分离蛋白，搅拌15min，得到水相，将40重量份水相加入65重量份大豆油中，通过孔径为200微米的快速膜乳化，滴加4wt％的氯化钙溶液，常温固化40min，得到沙棘提取物。
实施例4
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的果胶酶。
实施例5
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的蛋白酶。
实施例6
与实施例3相比，不同之处在于，蛋白酶为单一的中性蛋白酶。
实施例7
与实施例3相比，不同之处在于，蛋白酶为单一的无花果蛋白酶。
实施例8
与实施例3相比，不同之处在于，混合溶剂为单一的乙醚。
实施例9
与实施例3相比，不同之处在于，混合溶剂为单一的乙酸乙酯。
实施例10
与实施例3相比，不同之处在于，混合溶剂为单一的二氯甲烷。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未进行1350W超声波辅助提取40min。
具体如下：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，过滤，分别收集沙棘汁和果渣。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S2。
具体如下：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，1350W超声波辅助提取40min，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘果渣的酶解：将10重量份步骤S1制得的果渣加入水中，加入1.5重量份复合酶，加热至55℃，酶解3h，105℃灭酶15min，过滤，收集酶解液和渣料；
所述复合酶为果胶酶和蛋白酶的混合物，质量比为4:2；
所述蛋白酶为中性蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物，质量比为2:1；
S3.微波加热辅助有机溶剂提取：将4重量份步骤S1中的沙棘汁和6重量份步骤S2中的酶解液混合均匀，加入12重量份混合溶剂，1000W微波加热至50℃，辅助提取2h，分别收集混合溶剂层和水层，减压浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为1.5:4:6；
S4.沙棘发酵培养基的制备：将4重量份步骤S2中的渣料、17重量份步骤S3中的水层混合均匀，加入5重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、2重量份蛋白胨、3重量份尿素，加入170重量份无菌水，紫外线灭菌30min，制得沙棘发酵培养基；
S5.发酵：将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，36℃，60r/min，活化培养21h，得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为4％、0.7％、1.5％，37℃，60r/min，CO2含量为6％，O2含量为4％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵40h，冷冻干燥，得到发酵产物；
S6.沙棘提取物的制备：将6重量份步骤S3中的提取物、13.5重量份步骤S5中的发酵产物混合均匀，加入水中，加入17重量份海藻酸钠和15重量份乳清分离蛋白，搅拌15min，得到水相，将40重量份水相加入65重量份大豆油中，通过孔径为200微米的快速膜乳化，滴加4wt％的氯化钙溶液，常温固化40min，得到沙棘提取物。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S3。
具体如下：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，1350W超声波辅助提取40min，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘多糖的醇沉：向步骤S1制得的沙棘汁中加入乙醇至体系中乙醇含量为75wt％，置于2℃下沉淀18h，3000r/min离心15min，收集沉淀物，收集上层清液；
S3.微波加热辅助有机溶剂提取：将4重量份步骤S2中的上层清液和6重量份步骤S1制得的果渣混合均匀，加入12重量份混合溶剂，1000W微波加热至50℃，辅助提取2h，过滤，得到渣料，分别收集混合溶剂层和水层，减压浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为1.5:4:6；
S4.沙棘发酵培养基的制备：将4重量份步骤S3中的渣料、17重量份步骤S3中的水层混合均匀，加入5重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、2重量份蛋白胨、3重量份尿素，加入170重量份无菌水，紫外线灭菌30min，制得沙棘发酵培养基；
S5.发酵：将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，36℃，60r/min，活化培养21h，得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为4％、0.7％、1.5％，37℃，60r/min，CO2含量为6％，O2含量为4％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵40h，冷冻干燥，得到发酵产物；
S6.沙棘提取物的制备：将2.5重量份步骤S2中的沉淀物、6重量份步骤S3中的提取物、13.5重量份步骤S5中的发酵产物混合均匀，加入水中，加入17重量份海藻酸钠和15重量份乳清分离蛋白，搅拌15min，得到水相，将40重量份水相加入65重量份大豆油中，通过孔径为200微米的快速膜乳化，滴加4wt％的氯化钙溶液，常温固化40min，得到沙棘提取物。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未进行微波加热辅助。
具体如下：
S4.微波加热辅助有机溶剂提取：将4重量份步骤S2中的上层清液和6重量份步骤S3中的酶解液混合均匀，加入12重量份混合溶剂，搅拌提取2h，分别收集混合溶剂层和水层，减压浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为1.5:4:6。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S4。
具体如下：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，1350W超声波辅助提取40min，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘多糖的醇沉：向步骤S1制得的沙棘汁中加入乙醇至体系中乙醇含量为75wt％，置于2℃下沉淀18h，3000r/min离心15min，收集沉淀物，收集上层清液；
S3.沙棘果渣的酶解：将10重量份步骤S1制得的果渣加入水中，加入1.5重量份复合酶，加热至55℃，酶解3h，105℃灭酶15min，过滤，收集酶解液和渣料；
所述复合酶为果胶酶和蛋白酶的混合物，质量比为4:2；
所述蛋白酶为中性蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物，质量比为2:1；
S4.沙棘发酵培养基的制备：将4重量份步骤S3中的渣料、17重量份步骤S2中的上层清液混合均匀，加入5重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、2重量份蛋白胨、3重量份尿素，加入170重量份无菌水，紫外线灭菌30min，制得沙棘发酵培养基；
S5.发酵：将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，36℃，60r/min，活化培养21h，得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为4％、0.7％、1.5％，37℃，60r/min，CO2含量为6％，O2含量为4％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵40h，冷冻干燥，得到发酵产物；
S6.沙棘提取物的制备：将2.5重量份步骤S2中的沉淀物、6重量份步骤S3中的酶解液、13.5重量份步骤S5中的发酵产物混合均匀，加入水中，加入17重量份海藻酸钠和15重量份乳清分离蛋白，搅拌15min，得到水相，将40重量份水相加入65重量份大豆油中，通过孔径为200微米的快速膜乳化，滴加4wt％的氯化钙溶液，常温固化40min，得到沙棘提取物。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中仅接种了酿酒酵母菌种种子液。
具体如下：
S6.发酵：将酿酒酵母接种至高氏培养基中，36℃，60r/min，活化培养21h，得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；将酿酒酵母菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为6.2％，37℃，60r/min，CO2含量为6％，O2含量为4％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵40h，冷冻干燥，得到发酵产物。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中仅接种了嗜热链球菌菌种种子液。
具体如下：
S6.发酵：将嗜热链球菌接种至高氏培养基中，36℃，60r/min，活化培养21h，得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；将嗜热链球菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为6.2％，37℃，60r/min，CO2含量为6％，O2含量为4％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵40h，冷冻干燥，得到发酵产物。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中仅接种了保加利亚乳杆菌菌种种子液。
具体如下：
S6.发酵：将保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，36℃，60r/min，活化培养21h，得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；将保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为6.2％，37℃，60r/min，CO2含量为6％，O2含量为4％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵40h，冷冻干燥，得到发酵产物。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S6。
具体如下：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，1350W超声波辅助提取40min，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘多糖的醇沉：向步骤S1制得的沙棘汁中加入乙醇至体系中乙醇含量为75wt％，置于2℃下沉淀18h，3000r/min离心15min，收集沉淀物，收集上层清液；
S3.沙棘果渣的酶解：将10重量份步骤S1制得的果渣加入水中，加入1.5重量份复合酶，加热至55℃，酶解3h，105℃灭酶15min，过滤，收集酶解液和渣料；
所述复合酶为果胶酶和蛋白酶的混合物，质量比为4:2；
所述蛋白酶为中性蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物，质量比为2:1；
S4.微波加热辅助有机溶剂提取：将4重量份步骤S2中的上层清液和6重量份步骤S3中的酶解液混合均匀，加入12重量份混合溶剂，1000W微波加热至50℃，辅助提取2h，分别收集混合溶剂层和水层，减压浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为1.5:4:6；
S5.沙棘提取物的制备：将2.5重量份步骤S2中的沉淀物、6重量份步骤S4中的提取物、13.5重量份混合料(步骤S3中的渣料和步骤S4中的水层的质量比为4:17)混合均匀，加入水中，加入17重量份海藻酸钠和15重量份乳清分离蛋白，搅拌15min，得到水相，将40重量份水相加入65重量份大豆油中，通过孔径为200微米的快速膜乳化，滴加4wt％的氯化钙溶液，常温固化40min，得到沙棘提取物。
对比例10
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未进行微胶囊化。
具体如下：
S7.沙棘提取物的制备：将2.5重量份步骤S2中的沉淀物、6重量份步骤S4中的提取物、13.5重量份步骤S6中的发酵产物混合均匀，得到沙棘提取物。
测试例1
将1g本发明实施例1-3和对比例10制得的沙棘提取物分别加入到9mL人工模拟胃液和9mL人工模拟肠液中，在37℃、50r/min条件下分别反应2h和3h，另外，取等量的沙棘提取物加入到9mL人工模拟胃液中，先置于摇床中，在37℃、50r/min条件下反应2h后，离心，再加入9mL人工模拟肠液继续反应3h。反应结束后进行益生菌群细胞计数。
模拟胃液：取稀盐酸16.4mL，加水约800mL，调pH2.0，胃蛋白酶10g，搅匀后加水定容至1000mL。
模拟肠液：磷酸二氢钾6.8g，加水500mL蒸馏水溶解，用0.4％的氢氧化钠调节pH至6.8；120℃灭菌20min；胰蛋白酶10g，加无菌水适量使溶解，将两液混合后，加水定容至1000mL。
按照以下公式计算存活率：
存活率(％)＝Nt/N0×100％
式中，Nt为在体外孵育一定时间后存活的益生菌浓度(cfu/g)，N0为益生菌原始浓度(cfu/g)。
按照以下公式计算释放率：
释放率(％)＝(Wt-W0)/W0×100％
式中，Wt为样品起始重量；W0为样品在体外孵育一定时间后重量。
结果见表1。
表1
Figure BDA0004166883250000231
由上表可知，本发明实施例1-3制得的沙棘提取物在人工模拟胃液中能保持较好的完整性，转移至人工模拟肠液中后，微胶囊结构发生崩塌，释放出大量的益生菌和活性物质，说明该微胶囊结构可以实现益生菌、活性物质的长期保存的以及靶向将益生菌、活性物质输送至肠道的效果，有效防止菌种在储存过程中的活力损失，防止活性物质在储存过程中的变质，起到对活性物质的保护、靶向输送和缓控释的效果。
测试例2活性含量测定
样品为将本发明实施例1-10和对比例1-9制得的沙棘提取物未经过微胶囊前的固体混合物。
总酸含量测定参考GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》。
总游离氨基酸含量的测定：移取0.5g样品置于50mL容量瓶中，加入5mL乙酸锌溶液和5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，定容，静止沉淀后，过滤，吸取1.0mL试液于25mL具塞试管中，加2mL pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液，充分摇匀，加2mL3％茚三酮乙二醇溶液，摇匀。将试管同时置于沸水浴中，待水沸腾后精确计时15min，取出试管置于冷水中冷却至室温，于567nm处测定吸光度，代入回归方程y＝0.03x-0.0369计算出总游离氨基酸的浓度。
含量测定公式：总游离氨基酸的浓度×50mL/0.5g×100％
总黄酮的测定：移取0.5mL样品置于10mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，待测。吸取1.0mL试液于50mL容量瓶中，加乙醇至总体积为15mL，依次加入100g/L硝酸铝溶液1mL，9.8g/L醋酸钾溶液1mL，摇匀，加水至刻度，摇匀。静置1h。吸取待测试溶液1.0mL，置于50mL容量瓶中，加乙醇至总体积为15mL，加水稀释至刻度，摇匀后作为参比，于415nm处测定吸光度，代入回归方程y＝0.5736x-0.0044计算出总黄酮的浓度。
含量测定公式：总黄酮的浓度×10mL/0.5g×100％
结果见表2。
表2
Figure BDA0004166883250000241
Figure BDA0004166883250000251
由上表可知，本发明实施例1-3制得的沙棘提取物含有丰富的总酸、总黄酮以及总游离氨基酸，其活性物质含量丰富。
测试例3抗氧化活性分析
样品溶液为实施例1-10和对比例1-9制得的沙棘提取物未经过微胶囊前，配制成的浓度为0.01mg/mL的溶液。
1、DPPH自由基清除活性测定
配制0.01mg/mL的样品溶液及0.1mg/mL的维生素C溶液，各取1mL，分别加入2mL0.2mol/L DPPH自由基的乙醇溶液，混合均匀，在室温避光静置30min，在波长517nm处测定吸光度，以维生素C溶液为阳性对照，清除率按下式进行计算：
DPPH自由基清除率(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0×100
式中：A1为待测样DPPH自由基的乙醇溶液；A2为待测样+无水乙醇；A0为无水乙醇+DPPH自由基的乙醇溶液。
2、ABTS阳离子自由基清除活性测定
配制0.01mg/mL的样品溶液及0.1mg/mL的维生素C溶液，各取1mL，加入4mL ABTS工作液，完全混合，暗处反应6min，734nm波长处测定吸光度，以维生素C溶液为阳性对照，按下式计算其清除率：
ABTS阳离子基清除率(％)＝[1-(A1-A)/A0]×100
式中：A1为试样与ABTS混合溶液吸光度；A为不含ABTS样品溶液吸光度；A0为取代样品溶液的蒸馏水的吸光度。
结果见表3。
表3
Figure BDA0004166883250000261
由上表可知，本发明实施例1-3制得的沙棘提取物具有极好的抗氧化性能。
测试例4抗炎能力测试
将Raw264.7细胞接至含10％胎牛血清的1640培养基(含双抗)，于37℃、5％(体积百分数)CO2的培养箱中培养至对数生长期，按2×104个/mL接种于96孔板，继续培养12h后弃去培养液。取培养好的Raw264.7细胞，分别设对照组CON、DXMS组、LPS组和实施例1-10和对比例1-10组。
CON组：加入1640培养基；
LPS组：经终浓度1μg/mL的LPS诱导细胞；
DXMS组：经终浓度100μg/mL地塞米松预处理后加入终浓度1μg/mL的LPS诱导细胞；
实施例1-10和对比例1-9组：经终浓度实施例1-10和对比例1-10制得的沙棘提取物(未经过微胶囊前的固体粉末)100μg/mL和终浓度1μg/mL的LPS诱导细胞。于37℃、5％(体积百分数)CO2培养箱中培养24h后，离心沉淀取上清后，NO、IL-6、TNF-α、COX-2含量的测定采用Griess和酶联免疫吸附测定法，依据小鼠细胞因子试剂盒说明书进行操作。
结果见表4。
表4
Figure BDA0004166883250000271
Figure BDA0004166883250000281
由上表可知，本发明实施例1-3制得的沙棘提取物具有极好的降低炎症因子水平的效果。
测试例5提高免疫力测试
将168只小鼠随机分21组：空白组(蒸馏水)、实施例1-10和对比例1-10组(1g/kg/日)。基础饲料适应喂养7d，每日灌胃一次，连续30d后断粮给水24h后颈椎处死，对细胞免疫功能(迟发型病态反应试验－耳肿胀程度)进行测定、NK细胞活性(乳酸脱氢酶活性)进行测定。
灌胃第25d将每只鼠腹部用脱毛膏脱毛约4cm×4cm，用50μL DNCB(二硝基氯苯)溶液均匀涂抹到脱毛处致敏，5d后用10μLDNCB溶液均匀涂抹于小鼠右耳两侧，24h后处死小鼠剪下左右耳壳，用打孔器取下直径6mm的圆片并称重。按下列公式计算耳肿胀率：
耳肿胀率(％)＝右耳重量(g)-左耳重量(g)左耳重量(g)×100
30d后处死后，小鼠眼球取血后立即将血液3000r/min离心15min得到血清，并按乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒的测定方法进行测定。乳酸脱氢酶活性按下式进行计算：
LDH活性(U/L)＝测定OD值-对照OD值标准OD值-空白OD值×标准品浓度(0.2μmol/mL)×1000
结果见表5。
表5
组别 耳肿胀率(％) LDH活性(U/L)
空白组 9.8±2.4 260.2±56.2
实施例1 47.2±12.1* 772.1±90.4*
实施例2 48.1±12.9* 770.8±78.3*
实施例3 48.7±12.5* 775.3±93.5*
实施例4 44.5±11.6 756.7±89.7
实施例5 39.2±11.9 702.5±80.2
实施例6 45.7±12.0 760.2±88.5
实施例7 46.2±11.5 758.9±91.2
实施例8 40.2±11.3 730.4±85.7
实施例9 38.9±12.9 725.7±84.8
实施例10 38.0±12.1 720.1±89.7
对比例1 42.2±11.3 740.2±79.2
对比例2 39.8±11.8 728.7±91.2
对比例3 37.5±11.1 689.3±84.7
对比例4 37.1±12.2 682.1±85.2
对比例5 35.7±12.5 665.7±82.5
对比例6 34.7±11.3 645.2±91.1
对比例7 33.9±11.2 632.7±89.4
对比例8 33.4±10.5 630.1±90.4
对比例9 32.0±11.6 618.5±88.2
对比例10 20.3±10.7 340.2±78.3
注释：*为与空白组相比，P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的沙棘提取物具有较好的提高免疫力的效果。
测试例6降血糖试验
选择健康小鼠240只，禁食12h后腹腔注射四氧嘧啶200mg/kg，3d后，禁食5h，剪尾尖取血测血糖，筛选出空腹血糖在11.1mmol/L以上的小鼠为糖尿病小鼠，小鼠随机分为高血糖模型组、阳性对照组、实施例1-10和对比例1-10组，每组10只。盐酸二甲双胍组为阳性对照组，按125mg/kg·d的剂量给药盐酸二甲双胍。实施例1-10和对比例1-10组按照200mg/kg·d的剂量给药相应实施例或对比例制得的沙棘提取物。另选择10只正常小鼠，为正常对照组。高血糖模型组和正常对照组等体积的生理盐水，每天给药1次连续给药2周，末次给药前12h禁食，末次给药2h后，眼眶取血，测定血糖水平。
结果见表6。
表6
Figure BDA0004166883250000301
Figure BDA0004166883250000311
注释：*为与正常对照组相比，P<0.05；#为与高血糖模型组相比，P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的沙棘提取物具有较好的降血糖的效果。
实施例4、5与实施例3相比，复合酶为单一的果胶酶或蛋白酶。实施例6、7与实施例3相比，蛋白酶为单一的中性蛋白酶或无花果蛋白酶。对比例3与实施例3相比，未进行步骤S3。实施例5中各种活性物质含量下降，提高免疫力效果下降，抗氧化效果和抗炎效果下降、降血糖效果下降。实施例4、实施例6-7和对比例3总氨基酸含量下降，提高免疫力效果下降，抗氧化效果和抗炎效果下降。本发明通过复合酶对果渣进行酶解，复合酶包括果胶酶和蛋白酶，果胶酶能降解植物材料使细胞壁结构松散，甚至能完全水解植物材料，将活性成分释放。蛋白酶能够将大量的复杂结构的蛋白质酶解成可溶性小分子肽、短肽及氨基酸，其中，蛋白酶包括中性蛋白酶和无花果蛋白酶，中性蛋白酶能催化蛋白质肽键的水解，具有催化反应速度快、无工业污染、反应条件适应性宽等优点，还能够水解蛋白成小分子肽，大大提高了蛋白的生物效价，使其易为人体消化吸收，同时还提高了溶解，降低了粘度，改善了蛋白的功能特性；无花果蛋白酶是一类巯基蛋白酶，对多种蛋白质均有很好的降解作用，另一方面，无花果蛋白酶还能够很好的抑制沙棘果的褐变，提高对沙棘果果渣原料的保鲜能力，延长保存时间。经过复合酶酶解后，果渣中大部分活性物质溶出，大分子蛋白质酶解成小分子活性肽及氨基酸等，从而大大提高了活性物质被人体吸收的效果，从而大大改善了人体体质，具有很好的降血糖、保护胃黏膜的效果。
实施例8、9、10与实施例3相比，混合溶剂为单一的乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷。对比例4与实施例3相比，步骤S4中未进行微波加热辅助。对比例5与实施例3相比，未进行步骤S4。总黄酮、总酸含量下降，抗氧化、抗炎活性下降，提高免疫力效果和降血糖下降。本发明将上层清液和酶解液在微波辅助加热的条件下，加入混合溶剂混合提取，该混合溶剂包括乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，通过合适的溶剂混合，调节混合溶剂对溶质的溶解度，并且通过调节合适的极性，通过相似相溶原理，提高混合溶剂对活性物质，如多酚、黄酮、脂肪酸等的提取，另外，选择低沸点、高溶解性的溶剂进行混合，另外还简化了溶剂去除的方法，通过简单的旋蒸(减压加热去除)就可以将混合溶剂去除，制备方法更加简单。微波辅助加热提取进一步促进了活性物质的提取，提高了提取率。
对比例1与实施例3相比，步骤S1中未进行1350W超声波辅助提取40min。对比例2与实施例3相比，未进行步骤S2。抗氧化、抗炎活性下降，提高免疫力效果和降血糖下降。本发明将沙棘果榨汁后，将果肉和汁液混合，超声波辅助提取，将沙棘果中的大量多糖提取出来，同时，避免沸腾提取多糖对沙棘中其他营养物质如蛋白质的破坏，通过水提醇沉的方法，得到大量的沙棘多糖。
对比例6、7、8与实施例3相比，步骤S6中仅接种了酿酒酵母、嗜热链球菌或保加利亚乳杆菌菌种种子液。对比例9与实施例3相比，未进行步骤S6。总酸、总氨基酸含量下降，抗氧化、抗炎活性下降，提高免疫力效果下降。本发明通过酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的发酵处理沙棘发酵培养基，在发酵过程中，热处理能够促进保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌产酸，产生的甲酸钠同样可以促进保加利亚乳杆菌的生长，另外，嗜热链球菌产生的有机酸也能够初级保加利亚乳杆菌的生长，且能够降解沙棘中的乳糖，使得制得的沙棘提取物能够适用于乳糖不耐酸人群，还能够检索胃酸分泌，促进胃排空；但是，由于嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌无法很好地在大肠中生存繁殖，酿酒酵母通过分泌大量的有益物质，包括短链脂肪酸等，促进嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生存和定植，为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在碱性肠道环境中提供了有利的生存环境，从而起到了很好地肠道菌群调节的作用，间接促进的免疫调节，并且对胃肠道黏膜有一定的保护作用。
对比例10与实施例3相比，步骤S7中未进行微胶囊化。提高免疫力效果和降血糖明显下降。本发明将沉淀物、提取物和发酵产物混合均匀后，以海藻酸钠、乳清分离蛋白和氯化钙的混合物为壁材，利用微胶囊技术将活性物质和益生菌进行包埋，减少常规益生菌加工过程中的热、氧化、干燥损伤，实现益生菌、活性物质的长期保存的以及靶向将益生菌、活性物质输送至肠道的效果，有效防止菌种在储存过程中的活力损失，防止活性物质在储存过程中的变质，起到对活性物质的保护、靶向输送和缓控释的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种沙棘提取物的制备方法，其特征在于，将沙棘果榨汁后，果肉和汁液混合，超声波辅助提取，分别收集沙棘汁和果渣，沙棘汁中加入乙醇沉淀，收集沉淀物和上层清液；将果渣用复合酶酶解，得到酶解液和渣料；将上层清液和酶解液混加入混合溶剂提取，得到提取物，将渣料、水层、碳源和氮源混合均匀，加入无菌水，灭菌，制得沙棘发酵培养基，接种酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液发酵，得到发酵产物，将沉淀物、提取物、发酵产物混合均匀，制备成微胶囊，得到沙棘提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，超声波辅助提取，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘多糖的醇沉：向步骤S1制得的沙棘汁中加入乙醇，置于0-4℃下沉淀，离心，收集沉淀物和上层清液；
S3.沙棘果渣的酶解：将步骤S1制得的果渣加入水中，加入复合酶，加热酶解，灭酶，过滤，收集酶解液和渣料；
S4.微波加热辅助有机溶剂提取：将步骤S2中的上层清液和步骤S3中的酶解液混合均匀，加入混合溶剂，微波加热辅助提取，分别收集混合溶剂层和水层，浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
S5.沙棘发酵培养基的制备：将步骤S3中的渣料、步骤S4中的水层混合均匀，加入碳源和氮源，加入无菌水，灭菌，制得沙棘发酵培养基；
S6.发酵：将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，发酵，冷冻干燥，得到发酵产物；
S7.沙棘提取物的制备：将步骤S2中的沉淀物、步骤S4中的提取物、步骤S6中的发酵产物混合均匀，加入海藻酸钠和乳清分离蛋白，搅拌均匀，得到水相，加入食用油中，通过快速膜乳化，滴加氯化钙溶液，常温固化，得到沙棘提取物，得到沙棘提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述超声波辅助提取的功率为1200-1500W，时间为30-50min；步骤S2中所述加入乙醇至体系中乙醇含量为70-80wt％，所述沉淀时间为12-24h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述复合酶选自纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶中的至少两种，优选地，为果胶酶和蛋白酶的混合物，质量比为3-5:2；所述蛋白酶选自中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶中的至少一种，优选地，为中性蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物，质量比为1-3:1；所述果渣和复合酶的质量比为10:1-2；所述加热酶解的温度为50-60℃，时间为2-4h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为1-2:3-5:4-7，所述上层清液、酶解液和混合溶剂的质量比为3-5:5-7:10-15，所述微波加热辅助提取的功率为800-1200W，加热至温度为45-55℃，时间为1-3h；步骤S5中所述渣料、水层、碳源、氮源和无菌水的质量比为3-5:15-20:5-10:4-6:150-200。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S6中所述酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液的制备方法为将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，35-37℃，50-70r/min，活化培养18-24h，得到含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液；所述酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为3-5％、0.5-1％、1-2％；所述发酵的温度为36-38℃，时间为36-48h，转速为50-70r/min，CO2含量为5-7％，O2含量为3-5％，其中，％为体积百分比含量。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中所述沉淀物、提取物、发酵产物、海藻酸钠和乳清分离蛋白的质量比为2-3:5-7:12-15：15-20：12-17；所述快速膜的孔径为100-300微米，所述氯化钙溶液的浓度为3-5wt％，所述常温固化的时间为30-50min；所述水相和食用油的质量比为3-5:6-7。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.沙棘的预处理：将沙棘果洗净，干燥，榨汁，将果肉和汁液混合，1200-1500W超声波辅助提取30-50min，过滤，分别收集沙棘汁和果渣；
S2.沙棘多糖的醇沉：向步骤S1制得的沙棘汁中加入乙醇至体系中乙醇含量为70-80wt％，置于0-4℃下沉淀12-24h，离心，收集沉淀物，收集上层清液；
S3.沙棘果渣的酶解：将10重量份步骤S1制得的果渣加入水中，加入1-2重量份复合酶，加热至50-60℃，酶解2-4h，灭酶，过滤，收集酶解液和渣料；
所述复合酶为果胶酶和蛋白酶的混合物，质量比为3-5:2；
所述蛋白酶为中性蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物，质量比为1-3:1；
S4.微波加热辅助有机溶剂提取：将3-5重量份步骤S2中的上层清液和5-7重量份步骤S3中的酶解液混合均匀，加入10-15重量份混合溶剂，800-1200W微波加热至45-55℃，辅助提取1-3h，分别收集混合溶剂层和水层，浓缩去除混合溶剂，得到提取物；
所述混合溶剂为乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物，体积比为1-2:3-5:4-7；
S5.沙棘发酵培养基的制备：将3-5重量份步骤S3中的渣料、15-20重量份步骤S4中的水层混合均匀，加入5-10重量份碳源和4-6重量份氮源，加入150-200重量份无菌水，紫外线灭菌，制得沙棘发酵培养基；
S6.发酵：将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种至高氏培养基中，35-37℃，50-70r/min，活化培养18-24h，得到含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液；将酿酒酵母、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5制得的沙棘发酵培养基中，接种量为3-5％、0.5-1％、1-2％，36-38℃，50-70r/min，CO2含量为5-7％，O2含量为3-5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比含量，发酵36-48h，冷冻干燥，得到发酵产物；
S7.沙棘提取物的制备：将2-3重量份步骤S2中的沉淀物、5-7重量份步骤S4中的提取物、12-15重量份步骤S6中的发酵产物混合均匀，加入水中，加入15-20重量份海藻酸钠和12-17重量份乳清分离蛋白，搅拌均匀，得到水相，将30-50重量份水相加入60-70重量份食用油中，通过孔径为100-300微米的快速膜乳化，滴加3-5wt％的氯化钙溶液，常温固化30-50min，得到沙棘提取物。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的沙棘提取物。
10.一种如权利要求9所述的沙棘提取物在制备保护胃肠粘膜、提高免疫力、降血糖、抗炎、抗氧化的产品中的应用。
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