ES2941432B2 - Extracción de péptidos y glucosinolatos de material vegetal del género Brassica y uso de los mismos en aplicaciones cosméticas - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
Extracción de péptidos v qlucosinolatos de material vegetal del género Brassica v uso de los mismos en aplicaciones cosméticas
La presente invención se refiere a un nuevo método de extracción conjunta de glucosinolatos y péptidos partiendo de material vegetal del género Brassica crecido bajo cultivo ecológico. Así mismo, se describe el uso de dichos péptidos y glucosinolatos en aplicaciones cosméticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La familia de plantas brasicáceas (Brassicaceae) o cruciferas (Cruciferae) es una familia que agrupa a numerosas especies de variados usos para el hombre, como alimento fresco e industrializado, y como plantas forrajeras, medicinales y ornamentales. En ella se encuentran numerosas especies cultivadas, como son el brócoli (Brassica oleracea var. itálica), la col (Brassica oleraceae), el berro (Nasturtium officinale) y el rábano (Raphanus sativus).
El brócoli es una planta herbácea que llega a desarrollar una inflorescencia que es la parte comestible. Posee un tallo compacto del cual emergen grandes hojas de color verde oscuro y de superficie cerosa.
Las mejores condiciones ambientales para el crecimiento del brócoli se desarrollan en climas templado-fríos, donde las temperaturas mínimas son de 15°C y las máximas de 20°C. El brócoli requiere de abundante cantidad de agua durante todo su cultivo, en especial durante el desarrollo de la inflorescencia, ya que la insuficiencia de riego puede ocasionar su floración prematura y la pérdida de calidad. La cosecha empieza aproximadamente a los 90 días desde la siembra, cuando la inflorescencia es compacta y redondeada, con un diámetro entre 10 - 14 cm. Si la planta no es cosechada, se produce la floración y la parte comestible se pierde, dando lugar a la formación de cientos de pequeñas flores de color amarillo.
Existen evidencias de que el consumo de brócoli, y de cruciferas en general, gracias a sus compuestos bioactivos, presenta numerosas ventajas para la salud y reduce el
riesgo de padecer ciertas enfermedades. Este efecto beneficio para la salud se debe a la presencia de compuestos bioactivos como los glucosinolatos, flavonoides, y la vitamina C, destacando su actividad anti carcinogénica, antioxidante, y protectora frente a radicales libres.
La buena adaptación a los cambios medio ambientales y a las prácticas agrícolas, influyen cualitativa y cuantitativamente en el contenido final de los diferentes compuestos bioactivos en la planta. Hay estudios que ponen de manifiesto la gran variabilidad en el contenido de glucosinolatos entre distintas practicas agronómicas (Vicas et al. 2013 Plant Foods Hum Nutr. 68(3):313-21) y distintas condiciones de estrés medioambiental (Rios et al. 2019. Scientia Agrícola 77(6)).
Las condiciones de estrés medioambiental, como por ejemplo las altas temperaturas y la ausencia de precipitaciones, influyen directamente en la dinámica de poblaciones de insectos, incrementando la tasa de reproducción y la sobrevivencia. Algunos estudios han demostrado que, bajo condiciones de sequía, las plagas que más se ven favorecidas son aquellas denominadas invasoras. Se ha confirmado que insectos pertenecientes al orden Hemiptera y Thysanoptera, tales como los chinches, son los más beneficiados bajo estas condiciones, puesto que el aumento en la temperatura favorece su tasa reproductiva. Esto dispara la síntesis de glucosinolatos y otros compuestos bioactivos en las plantas, en respuesta a los ataques de insectos (Mewis et al., 2005 Plant Physiol.138(2):1149-1162).
Además de estos compuestos bioactivos, se ha comprobado la presencia de péptidos hidrolizados de proteínas con diversas actividades antioxidantes y antimicrobianas, (Wang et al., 2016 Oxidative Medicine and Cellular Longevity; Taniguchi y Ochiai, 2017 Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 81(4) 634-650; Babini et al., 2017 Food chemistry, 228, 186-196) que actualmente están cobrando mucha importancia en la industria cosmética y alimentaria. Además, se ha detectado la presencia de otros muchos péptidos candidatos de poseer bioactividad, pero cuya actividad no ha sido aún comprobada.
La posibilidad de desarrollar extractos enriquecidos en estos compuestos bioactivos que ayuden a reducir la incidencia de enfermedades está tomando mucha importancia en la industria agroalimentaria, cosmética y farmacéutica.
La presente invención describe por primera vez una técnica de extracción conjunta de glucosinolatos y péptidos bioactivos a partir de plantas del género Brassica crecidas bajo cultivo ecológico, así como el uso de dichos compuestos bioactivos y composiciones comprendiendo dichos compuestos bioactivos como medicamentos o como productos cosméticos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición (“composición de la invención”) caracterizada porque comprende, o consiste en, una combinación de glucosinolatos, isotiocinatos y péptidos, en una proporción entre 0,4:0,1:5 y 1,0:0,5:15 (peso/peso).
En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende, o consiste en, una combinación de glucosinolatos, isotiocinatos y péptidos, en una proporción 0,7:0,3:10 (peso/peso).
En ciertas realizaciones, los glucosinolatos de la composición de la invención se seleccionan de entre: sinigrina, gluconarpina, progoitrina, glucoiberina, glucosativina, glucoiberberina, glucorafanina, glucoerucina, glucoalisina, gluconasturtina, glucobrasicina, neoglucobrasicina, 4-hidroxiglucobrassicina 4- metoxiglucobrassicina, y combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones, los isotiocinatos de la composición de la invención se seleccionan de entre: butironitrilo, alil isotiocianato, 3 2- metil-2-nitropropano, 4 4-(metiltio)-butanonitrilo, butil isotiocianato, isobutil isotiocianato, iberina, 4-isotiocianato-1-buteno, 3-metilbutil isotiocianato, isoamil methil sulfoxide, erucina, sulforafeno, sulforafano, 3'-diindolil metano, indol-3-carbinol, ácido lndol-3-carboxilico, ácido indol-3-acetico, 1- methoxiindol-3-carbaldehido, y combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones, los péptidos de la composición de la invención se seleccionan de entre: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y combinaciones de los mismos. La tabla 1 lista algunos de los péptidos de la composición de la invención, y su ID en la base de datos PlantPep DB, la cual recoge información sobre péptidos
bioactivos (http://www.niμgr.ac.in/PlantPepDB/l.
Tabla 1. Ejemplos de péptidos aislados en el método de la invención.
En ciertas realizaciones específicas de la composición de la invención, (i) los glucosinolatos son glucorafanina, 4-hidroxiglucobrassicina, glucobrassicina, 4-metoxiglucobrassicina y neoglucobrassicina; (ii) los isotiocianatos son sulforrafano, lndol-3-carbinol y 3,3'-diindolil metano; y (iii) los péptidos son SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.
En ciertas realizaciones de la composición de la invención, los glucosinolatos, isotiocinatos y péptidos proceden de material vegetal del género Brassica.
Como se ha descrito ya, el consumo de vegetales de la familia de las cruciferas está relacionado con diferentes efectos beneficiosos para la salud, como una actividad anticancerígena o antiinflamatoria. Esto se debe a su alto contenido en compuestos bioactivos, como los glucosinolatos y sus derivados, los isotiocinatos, así como en péptidos.
En ciertas realizaciones específicas de la composición de la invención, el material vegetal del género Brassica procede de una especie que se selecciona de entre: Brasiica oleracea, Brassica napus, Brassica nigra, Brassica perviridis y Brassica rapa.
En ciertas realizaciones preferidas de la composición de la invención, el material vegetal procede de la variedad de Brassica olerácea var. itálica.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención se caracteriza por tener una actividad dermatológica, antioxidante y regeneradora de tejidos.
En el contexto de la presente invención, el término “actividad dermatológica” se refiere a cualquier actividad sobre cualquiera de las capas de la piel (estrato córneo, epidermis, dermis e hipodermis)
La actividad dermatológica de la composición de la invención puede determinarse por distintos métodos conocidos por el experto en la materia, incluyendo, pero sin estar limitados a los análisis de la actividad microbiana contra especies que provocan infecciones cutáneas relacionadas con la aparición de acné. Dichos métodos comprenden además las determinaciones de la capacidad de proliferación celular y estimulación de la síntesis de compuestos de la matriz extracelular como el colágeno, los cuales están directamente relacionado con el efecto antiarrugas, desaparición de cicatrices, estrías y eczemas.
En el contexto de la presente invención, el término “actividad antioxidante” se refiere a la capacidad de una sustancia para inhibir la degradación oxidativa (por ejemplo, la peroxidación lipídica). Un antioxidante actúa, principalmente, gracias a su capacidad para reaccionar con radicales libres y retrasar la degradación oxidativa.
La actividad antioxidante de la composición de la invención puede determinarse por distintos métodos conocidos por el experto en la materia, incluyendo, pero sin estar limitados a, las técnicas que utilizan el radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (sección de ejemplos).
En el contexto de la presente invención, el término “actividad regeneradora de tejidos” se refiere a la capacidad de una sustancia para reparar o regenerar tejidos. La regeneración tisular es un proceso complejo en el que la piel, u otros tejidos, se reparan después de una lesión accidental, enfermedad o intervención quirúrgica. El proceso implica la actividad de una compleja red de células de la sangre, tejidos, citoquinas, y factores de crecimiento que se traduce en un aumento de la actividad celular y causa
una intensa demanda metabólica de nutrientes.
La actividad regeneradora de tejidos de la composición de la invención puede determinarse por distintos métodos conocidos por el experto en la materia, incluyendo, pero sin estar limitados a, análisis in vitro mediante la técnica ‘wound healing’ de la capacidad regeneradora y de cierre de ‘heridas’ de los compuestos en queratinocitos.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de la composición de la invención (“procedimiento de la invención”), caracterizado porque comprende: (i) una primera etapa de estimulación de una planta del género Brassica en ausencia de pesticidas; (ii) una segunda etapa de extracción de glucosinolatos, isotiocinatos y péptidos a partir del material vegetal de la planta del género Brassica estimulada según (i); y (iii) una tercera etapa de combinación de glucosinolatos, isotiocinatos y péptidos extraídos en la etapa (ii) en una proporción de entre 0,4:0,1:5 y 1,0:0,5:15 (peso/peso). En ciertas realizaciones, la primera etapa del procedimiento de obtención de la composición de la invención (i) comprende la aplicación de una sustancia de choque osmótico, a través del agua de riego, a la planta del género Brassica. El choque osmótico hace reaccionar a los cultivos de Brassica estimulando su metabolismo secundario de forma controlada.
En ciertas realizaciones del procedimiento de la invención, la sustancia de choque osmótico se selecciona de entre: CaCl2, NaCl, KCI, Na2S04, K2S04, (NH4)2S04, MgS04, KN03, NH4N03, Mg(N03)2, Ca(N03)2, KH2P04, NH4H2P04, manitol, sorbitol, polietilenglicol y combinaciones de los mismos.
En dichas realizaciones del procedimiento de la invención, dicha sustancia de choque osmótico se aplica a una concentración de entre 10 y 80 Mm.
En ciertas realizaciones específicas de la invención, la sustancia de choque osmótico es NaCl y se aplica a una concentración de 50 Mm.
En ciertas realizaciones del procedimiento de la invención, en la etapa (ii) se parte de material vegetal del género Brassica que se selecciona de entre: raíz, tallo, hojas, inflorescencia, y combinaciones de las mismas.
En ciertas realizaciones específicas del procedimiento de la invención, el material vegetal del género Brassica del que se parte es tallo.
En ciertas realizaciones del procedimiento de obtención de la composición de la invención, el material vegetal del género Brassica del que se parte procede de una especie que se selecciona de entre Brasiica oleracea, Brassica napus, Brassica nigra, Brassica perviridis y Brassica rapa.
En ciertas realizaciones específicas del procedimiento de obtención de la composición de la invención, el material vegetal del género Brassica procede de Brassica oleracea var. itálica (brócoli o brécol).
En ciertas realizaciones de la etapa (iii) del procedimiento de obtención de la composición de la invención, los glucosinolatos, isotiocinatos y péptidos extraídos en la etapa (ii) se combinan en una proporción 0,7;0,3;10(peso/peso).
La presente invención se refiere también a un procedimiento de extracción de péptidos y glucosinolatos de material vegetal del género Brassica (“procedimiento de extracción de la invención”), caracterizado porque comprende los siguientes pasos: (iv) homogenización del material vegetal del género Brassica con una disolución alcohólica de un alcohol C2-C4; (v) doble filtración del homogenado; (vi) floculación de las proteínas e inactivación de la enzima mirosinasa en el homogenizado filtrado obtenido en (v); (vii) dilución 1/1 (v/v) del extracto floculado con EtOH 100%; y (viii) centrifugación de la mezcla y separación del precipitado (proteínas) del extracto líquido (glucosinolatos).
En ciertas realizaciones del método de la invención, la etapa (ii) se caracteriza por comprender dicho procedimiento de extracción de la invención. En otras palabras, en ciertas realizaciones del método de la invención, este se caracteriza porque la segunda etapa de obtención de glucosinolatos, isotiacinatos y péptidos (ii) comprende: (iv) homogenización del material vegetal del género Brassica con una disolución alcohólica de un alcohol C2-C4; (v) doble filtración del homogenado; (vi) floculación de las proteínas e inactivación de la enzima mirosinasa en el homogenizado filtrado obtenido en (v); (vii) dilución 1/1 (v/v) del extracto floculado con EtOH 100%; y (viii) centrifugación de la mezcla y separación del precipitado (proteínas) del extracto líquido
(glucosinolatos).
En algunas realizaciones del procedimiento de extracción de la invención, la homogenización del material vegetal del género Brassica de la etapa (iv) se lleva a cabo con 30% EtOH como extractante a una dilución 2/5 (peso/volumen).
En algunas realizaciones del procedimiento de extracción de la invención, el primer paso de la filtración del homogenizado se lleva a cabo utilizando una malla.
En algunas realizaciones específicas del procedimiento de extracción de la invención, el primer paso de la filtración del homogenizado se lleva a cabo utilizando una malla de nylon.
En algunas realizaciones aún más específicas del procedimiento de extracción de la invención, el primer paso de la filtración del homogenizado se lleva a cabo utilizando una malla de nylon con un diámetro de poro de entre 50 y 800 μm.
En algunas realizaciones del procedimiento de extracción de la invención, el segundo paso de la filtración del homogenizado se lleva a cabo utilizando un filtro de papel.
En algunas realizaciones del procedimiento de extracción de la invención, la floculación de las proteínas e inactivación de la enzima mirosinasa de la etapa (vi) comprende calentar el homogenizado a 65-100°C durante 5-20 minutos.
En algunas realizaciones específicas del procedimiento de extracción de la invención, la floculación de las proteínas e inactivación de la enzima mirosinasa de la etapa (vi) comprende calentar el homogenizado a 65-75 °C durante 5-20 minutos.
En algunas realizaciones aún más específicas del procedimiento de extracción de la invención, la floculación de las proteínas e inactivación de la enzima mirosinasa de la etapa (vi) comprende calentar el homogenizado a 70°C durante 10 minutos.
En algunas realizaciones del procedimiento de extracción de la invención, la dilución obtenida en la etapa (vii) se somete a agitación durante 20 minutos antes de la etapa (viii).
En algunas realizaciones específicas del procedimiento de extracción de la invención, la centrifugación de la etapa (viii) se lleva a cabo entre 1000 y 6000 rpm durante 2 a 10 min.
En algunas realizaciones específicas del procedimiento de extracción de la invención, la centrifugación de la etapa (viii) se lleva a cabo entre 3500 y 4500 rpm durante 2 a 6 min.
En algunas realizaciones específicas del procedimiento de extracción de la invención, la centrifugación de la etapa (viii) se lleva a cabo a 4000 rpm durante 4 minutos
En ciertas realizaciones, el procedimiento de extracción de la invención comprende, además: (ix) concentración del extracto líquido obtenido en (viii).
En algunas realizaciones específicas de la etapa (ix), el etanol de la mezcla se elimina con rotavapor para concentrar el extracto líquido obtenido en (viii).
En ciertas realizaciones, el procedimiento de extracción de la invención comprende, además: (x) resuspensión del precipitado de proteínas obtenido en (viii) e hidrólisis enzimática del mismo con tripsina.
En ciertas realizaciones, el precipitado de proteínas obtenido en (viii) se resuspende en una disolución tamponada. La solución tamponada comprende al menos un tampón seleccionado del grupo que consiste en: KPB (fosfato potásico), HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid) y MOPS (4-Morpholinepropanesulfonic acid, 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid), a concentraciones de entre 10 y 100 mM y pHs comprendidos entre 4 y 7.
En ciertas realizaciones, el precipitado de proteínas obtenido en (viii) se resuspende en una disolución tamponada de KPB (fosfato potásico), a una concentración de 25 mM a pH 6,5.
En ciertas realizaciones, el precipitado de proteínas obtenido en (viii) se resuspende en una disolución tamponada de HEPES a 50 Mm a pH 7,0.
En ciertas realizaciones, el precipitado de proteínas obtenido en (viii) se resuspende en una disolución tamponada de MOPS a 80 mM a pH 5,5.
En ciertas realizaciones, el procedimiento de extracción de la invención comprende la obtención de péptidos mediante hidrólisis enzimática con tripsina.
En algunas realizaciones de la invención, la hidrólisis enzimática con tripsina se lleva a cabo con una concentración de 0,01; 0.02; 0.03; 0.04; 0.05; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; o 0.5% (p/v) del extracto de proteínas.
En algunas realizaciones de la invención, la hidrólisis enzimática con tripsina se lleva a cabo en una concentración de Na2S04 de entre 0,2 y 0,6 mM y una concentración de EDTA de entre 0,3 y 1 mM.
En algunas realizaciones específicas de la invención, la hidrólisis enzimática con tripsina se lleva a cabo con una concentración de 0,02% (p/v) del extracto de proteínas en 0,35 Mm Na2S04 y 0,68 Mm de EDTA.
En algunas realizaciones, la hidrólisis enzimática con tripsina se lleva a cabo durante 4 horas, a 50°C y pH entre 8 y 8.5.
En algunas realizaciones, la hidrólisis enzimática con tripsina se lleva a cabo con una concentración de tripsina de 0,01% (p/v).
En algunas realizaciones específicas del procedimiento de extracción de la invención, la hidrólisis enzimática con tripsina se lleva a cabo durante 4h a 50°C y pH 8-8.5, con una concentración de 0,02% (p/v) del extracto de proteínas en 0,35 Mm Na2S04 y 0,68 Mm de EDTA, y una concentración de tripsina de 0,01% (p/v).
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a la composición de la invención para uso como medicamento o como producto cosmético.
El término "medicamento” o “composición farmacéutica" se utilizan en esta invención de manera indistinta, haciendo referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de las enfermedades en el ser humano o en
los animales. La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto sola como en combinación con otras composiciones farmacéuticas.
En el contexto de la presente invención, la composición farmacéutica se caracteriza por comprender la composición de la invención en una cantidad terapéuticamente activa. En la presente invención, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la composición calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, para el caso de una composición terapéutica, por las características propias de los compuestos presentes en la composición, la ruta, forma y frecuencia de administración de los mismos, y otros factores, incluyendo la edad, estado del paciente, así como la severidad de la alteración o trastorno.
La composición terapéutica puede prepararse, por ejemplo, en forma sólida o en suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por ejemplo por vía parenteral, por vía intraarterial, por vía intravenosa, por vía oral, por vía intraperitoneal o subcutánea, preferiblemente por vía intravenosa.
La composición se puede administrar en una o en varias dosis durante la duración del tratamiento con el fin de optimizar el efecto terapéutico.
El término “producto cosmético” se refiere a cualquier producto para uso cosmético. El término “uso cosmético” se refiere a cualquier uso no terapéutico para mejorar la apariencia estética o el confort de la piel, pelo, o pelaje de un animal, preferiblemente de un mamífero, y aún más preferiblemente de un humano.
El uso cosmético incluye, en el contexto de la presente invención, evitar daños o deterioros a la piel, pelo o pelaje de un animal. En algunas realizaciones, el uso cosmético de la composición de la invención incluye retrasar el envejecimiento natural de la piel a causa de los factores ambientales, reduciendo el efecto de los radicales libres generados por la actividad oxidativa en las células debido a la capacidad antioxidante que presenta. Dicho uso comprende, en ciertas realizaciones, una actividad
protectora contra los daños generados por la radiación UV.
Finalmente, en algunas realizaciones, el uso cosmético de la composición de la invención incluye la estimulación de la regeneración y crecimiento celular de queratinocitos.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención para la elaboración de un medicamento o un producto para uso cosmético.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Composición en glucosinolatos de la fase líquida del extracto.
Figura 2.- Capacidad antioxidante equivalente aTrolox de péptidos, glucosinolatos y la combinación de ambos. Los datos aparecen como media ± SD (n = 6, experimento realizado 4 veces independientes).
Figura 3.- Viabilidad celular de queratinocitos (HaCaT) al aplicar péptidos (1.25-0.08 μg/ml), glucosinolatos (0.05-0.0031 mg liofilizado/ml) y la combinación de ambos a las 24 y 48 horas. Los datos aparecen como media ± S D ( n = 6).
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Materiales y métodos
Método de extracción de péptidos-glucosinolatos
El cultivo del broccoli se realiza bajo condiciones de agricultura ecológica y riego con aguas salinas para estimular la síntesis de glucosinoatos y de proteínas.
Los tallos frescos de brócoli de cultivo ecológico se homogenizan con etanol (EtOH) al 30% en agua con una ratio 2/5 peso / volumen. El zumo (homogenizado) se filtra por una malla de nylon con un diámetro de poro de 100 μm. Se recoge el eluido y se vuelve a filtrar en un filtro de papel. El zumo se calienta en un baño a 70°C durante 10 minutos para provocar la floculación de las proteínas del extracto y para inactivar la encima
mirosinasa presente en los tejidos vegetales que degrada glucosinolatos en isotiocianatos. Una vez producida la floculación, los conjugados proteicos precipitarán, y se realiza una dilución 1/1 del extracto floculado (30% EtOH) con EtOH 100% para obtener una mezcla aproximadamente del 70% de EtOH. Se agita durante 20 minutos para fomentar la extracción de glucosinolatos y se centrifuga a 2.500 g durante 10 minutos. Después de la centrifugación, se obtiene un precipitado, en el que están las proteínas floculadas, y una fase líquida rica en glucosinolatos.
Para la extracción de glusinolatos, la fase líquida se concentra usando un rotavapor con un baño a 35°C para eliminar el etanol de la mezcla y obtener un extracto acuoso rico en glucosinolatos.
Por otra parte, para la extracción de proteínas, se congela y se seca el precipitado en estufa a 70°. Se realiza entonces la hidrólisis enzimática con tripsina en un 0,02% (peso/volumen) del extracto de proteínas en 0,35 mM de Na2SÜ4 y 0,68 mM de EDTA. Se incuba el extracto durante 4h a 50°C y pH 8-8,5 con la tripsina al 0,01%. Después de 4h la reacción es detenida incubando la mezcla a 90°C durante 10 minutos seguido de una centrifugación a 6.000 g durante 5 minutos. Los sobrenadantes se filtran por una membrana de 0,22 μm de diámetro de poro, obteniendo finalmente una mezcla de péptidos con una concentración entre 1-3 mg de péptidos/ mi de solución.
Actividad de los extractos.
Capacidad antioxidante in vitro (Ensayo DPPH)
La capacidad antioxidante se mide mediante el ensayo DPPH, técnica que utiliza el radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). Para medir la capacidad antioxidante es necesario comparar esta con la de otro compuesto, como el reactivo Trolox (Sigma 238813-1G). En una placa de 96 pocilios se realiza una recta de concentraciones de Trolox desde 0-1000 μM, diluido con metanol (MeOH). Se añaden 10 μL por pocilio de estándar de Trolox y las muestras a analizar. A continuación, se añaden 190 μL de la solución de DPPH quedando a 105 μM e cada pocilio. Se agitan las placas y se incuban durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Finalmente, se mide la absorbancia a 517 nm en un lector de placas. La capacidad antioxidante se calcula con la siguiente formula:
Citotoxicidad en queratinocitos humanos (Ensayo MTT)
Los queratinocitos fueron tratados con un rango de concentraciones de péptidos, glucosinolatos y la combinación de ambos y efecto sobre la viabilidad celular se midió mediante el análisis de MTT, Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol. Las células fueron sembradas a una concentración de 3200 células por pocilio en 198 μL de medio completo DMEM en placas de 96 pocilios y cultivadas a 37°C y 5% CO2 hasta que alcanzan un 60-70% de confluencia. Posteriormente, se añaden 2μL 100X de los diferentes tratamientos a testar (cada muestra fue repetida 6 veces), y se incuban durante 24 y 48h. La viabilidad celular fue determinada añadiendo 200 μL de MTT (1 mg/mL DMEM) después de eliminar el medio de las células, y se incubaron durante 4h a 37°C y 5% CO2. La solución de MTT se eliminó, se añadió 100 μL de DMSO y se agitaron las placas. Se midió la absorbancia a 570 nm en un lector de placas. La viabilidad celular fue calculada mediante la siguiente formula:
Resultados
Caracterización del extracto: glucosinolatos/isotiocianatos
Como puede observarse en la figura 1, la concentración de los glucosinolatos e isotiocianatos es mucho mayor en el tallo del brócoli ecológico que en el tallo del brócoli convencional. En concreto se observa un incremento de 2 veces en la concentración de glucobrasicina (GBS), de 2.5 veces en la concentración de sulforrafano (SFN) y de 8 veces en la concentración de indol-3-carbinol (I3C).
El hecho de que en el brócoli convencional la concentración de glucosinolatos sea menor se debe a la presencia de pesticidas que se utilizan para eliminar las plagas. Hay que señalar que existe una gran variabilidad tanto en el contenido total como en el perfil de glucosinolatos entre las distintas especies de brásicas, También se han encontrado diferencias en el contenido en glucosinolatos entre distintos genotipos de la misma
especie, así como la existencia de diferencias en las proporciones relativas de los distintos glucosinolatos en los distintos tejidos de la misma planta (J. J. Ríos et al. 2020. Scientia Agrícola vol. 77 (6). Los productos resultantes de la hidrólisis de los glucosinolatos (isotiocianatos) son los responsables de las propiedades medicinales de las plantas que los producen. Estos isotiocianatos tienen un efecto destacado sobre la palatabilidad del producto por el sabor amostazado y picante que proporcionan, actúan como repelentes para determinados insectos, por lo que se sintetizan en respuesta a plagas. También se han demostrado las propiedades antifúngicas y antibacterianas de los isotiocianatos (Ríos, P. et al 2016. J. Phytopathol. 164:582-594.).
Caracterización del extracto proteico: péptidos
Han sido identificados un total de 1259 secuencias de péptidos en los hidrolizados del extracto de proteínas del tallo de brócoli. El hidrolizado en su conjunto es el que presenta las actividades requeridas para aplicaciones cosmecéuticas, pero es posible purificar ciertas secuencias de péptidos para aplicaciones más dirigidas enfocadas a la medicina regenerativa.
Las tablas 2 a 4 resumen las características del extracto de proteínas hidrolizado, así como el análisis predictivo de nuevos péptidos.
Tabla 2. Composición aminoacídica del extracto de proteínas hidrolizado y clasificación por características químicas.
Tabla 3. Péptidos identificados con función comprobada de forma experimental.
Tabla 4. Análisis predictivo de nuevos péptidos.
Actividad de los extractos.
Capacidad antioxidante in vitro (Ensayo DPPH)
La capacidad antioxidante de la mezcla de glucosinolatos y péptidos se debe principalmente a los glucosinolatos, ya que no hay diferencias con la muestra de glucosinolatos sola (Figura 2).
Citotoxicidad en queratinocitos humanos (Ensayo MTT)
La concentración de 0.08 de péptidos junto a la de 0.0031 de glucosinolatos supera la respuesta de los queratinocitos de forma individual tanto a las 24 como a las 48 horas (Figure 3).
Claims (21)
1. Composición caracterizada porque comprende, o consiste en, una combinación de glucosinolatos, isotiocinatos y péptidos, en una proporción de entre 0,4:0,1:5 a 1,0:0,5:15 (peso/peso) y donde los glucosinolatos, isotiocinatos y péptidos proceden de material vegetal del género Brassica.
2. Composición según la reivindicación 1, donde los glucosinolatos se seleccionan de entre: sinigrina, gluconarpina, progoitrina, glucoiberina, glucosativina, glucoiberberina, glucorafanina, glucoerucina, glucoalisina, gluconasturtina, glucobrasicina, neoglucobrasicina, 4-hidroxiglucobrassicina 4-metoxiglucobrassicina, y combinaciones de los mismos.
3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde los isotiocianatos se seleccionan de entre: butironitrilo, alil isothiocianato, 32- metil-2-nitropropano, 4 4-(metiltio)-butanonitrilo, butil isothiocianato, isobutil isotiocianato, iberina, 4-isotiocianato-1-buteno, 3-metilbutil isotiocianato, isoamil methil sulfoxide, erucina, sulforafeno, sulforafano, 3'-diindolil metano, indol-3-carbinol, ácido Indol-3-carboxilico, ácido indol-3-acetico, 1- methoxiindol-3-carbaldehido, y combinaciones de los mismos.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde los péptidos se seleccionan de entre: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y combinaciones de los mismos.
5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde:
(i) los glucosinolatos son glucorafanina, 4-hidroxiglucobrassicina, glucobrassicina, 4- metoxiglucobrassicina y neoglucobrassicina; (ii) los isotiocianatos son sulforrafano, Indol-3-carbinol y 3,3'-diindolil metano; y (iii) los péptidos son SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:
8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el material vegetal del género Brassica procede de una especie que se selecciona de entre: Brasiica olerácea, Brassica napus, Brassica nigra, Brassica perviridis y Brassica rapa.
7. Composición según la reivindicación 6, donde el material vegetal procede de la variedad de Brassica oleracea var. itálica.
8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con una actividad dermatológica, antioxidante y regeneradora de tejidos.
9. Procedimiento de obtención de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende:
(i) una primera etapa de estimulación de una planta del género Brassica en ausencia de pesticidas;
(ii) una segunda etapa de extracción de glucosinolatos, isotiocinatos y péptidos a partir del material vegetal de la planta del género Brassica estimulada según (i); y
(iii) una tercera etapa de combinación de glucosinolatos, isotiocinatos y péptidos extraídos en la etapa (ii) en una relación entre 0,4:0,1:5 y 1,0:0,5:15 (peso/peso).
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa (i) comprende la aplicación de una sustancia de choque osmótico, a través del agua de riego.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la sustancia de choque osmótico se selecciona de entre: CaCh, NaCl, KCl, Na2SO4 , K2SO4 , (NH4ESO4, MgSO4 , KNO3 , NH4NO3 , Mg(NO3)2 , Ca(NO3)2 , KH2 PO4, NH4H2 PO4, manitol, sorbitol, polietilenglicol y combinaciones de los mismos.
12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, caracterizado
porque la sustancia de choque osmótico se aplica a una concentración de entre 10 y 80 Mm.
13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde la sustancia de choque osmótico es NaCl y se aplica a una concentración de 50 Mm.
14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde en la segunda etapa de obtención de glucosinolatos, isotiacianatos y péptidos se parte de material vegetal del género Brassica que se selecciona de entre: raíz, tallo, hojas, inflorescencia, y combinaciones de las mismas.
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, donde el material vegetal es tallo.
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, donde el material vegetal del género Brassica procede de una especie que se selecciona de entre Brasiica olerácea, Brassica napus, Brassica nigra, Brassica perviridis y Brassica rapa.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, donde el material vegetal procede de variedad de Brassica oleracea var. Itálica.
18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, caracterizado porque la segunda etapa de obtención de glucosinolatos, isotiacinatos y péptidos (ii) comprende:
(iv) homogenización del material vegetal del género Brassica con una disolución alcohólica de un alcohol C2-C4;
(v) doble filtración del homogenizado obtenido en la etapa (iv);
(vi) floculación de las proteínas e inactivación de la enzima mirosinasa en el homogenizado filtrado obtenido en (v);
(vii) dilución 1/1 (v/v) del extracto floculado obtenido en (vii) con EtOH 100%; y (viii) centrifugación de la mezcla y separación del precipitado (proteínas) del extracto líquido (glucosinolatos).
19. Procedimiento según la reivindicación 18, comprendiendo, además:
(ix) concentración del extracto líquido obtenido en (viii).
20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, comprendiendo, además:
(x) resuspensión del precipitado de proteínas obtenido en (vii) e hidrólisis enzimática del mismo con tripsina.
21. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso como medicamento o como producto cosmético.
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