KR102209208B1 - 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물이 개시된다. 본 발명에 따른 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물에 의하면, 벌사상자의 종자를 발아하고 이를 고온 고압에서 전처리함으로써 벌사상자의 유효성분인 오스톨의 함량을 높일 수 있다.
그리고 멜라닌 형성을 억제하고 세포 내 티로시나제 활성을 저해하며, 색소 침착을 억제함으로써 우수한 미백 효능을 가질 뿐만 아니라, 세포독성이 나타나지 않아 피부 자극이 적고 안전한 천연 미백 화장료를 제공할 수 있다.

Description

오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물{Method for producing Cnidium germinating seed extract containing osthole and cosmetic composition for skin whitening including Cnidium germinating seed extract}

본 발명은 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벌사상자의 종자를 발아하고 이를 고온 고압에서 전처리함으로써 벌사상자의 유효성분인 오스톨의 함량을 높일 수 있고, 멜라닌 형성을 억제하고 세포내 티로시나제 활성을 저해하여 우수한 미백 효능을 가진 화장료로 사용될 수 있는 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

아름다움을 추구하는 여성의 본능은 어제오늘의 일이 아니지만, 최근 들어 자신을 더욱 예뻐 보이게 하기 위한 체형 관리나 미용 또는 화장품에 대한 관심이 더욱 높아지는 추세에 있다.

그리고 여성뿐만 아니라 남성들도 피부관리를 위해 화장품에 관심을 두게 됨에 따라 화장품 시장은 계속해서 확대되고 있으며, 다양한 종류의 화장품이 시장에 출시되고 있다.

일반적으로 화장품은 크게 기초 화장품, 메이크업 베이스와 색조 화장품 등으로 나눌 수 있고, 고형, 액상 또는 겔상의 화장료로 제조되며, 이들을 보관하는 화장품 용기도 다양한 형태로 적용되고 있다.

최근에는 보습, 미백, 주름개선, 자외선 차단, 여드름 완화, 아토피 완화, 항염증이나 각질용해 등 다양한 기능을 수행할 수 있는 기능성 화장품도 널리 소비되고 있다.

이러한 기능성 화장품 중 미백 화장품은 피부의 과도한 멜라닌 색소의 침착을 방지하거나 기존의 멜라닌 색소를 옅게 함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 화장품으로서, 그 효과의 기전으로 크게 색소 침착을 방지해주는 효과와 이미 생성된 멜라닌을 환원시켜 피부색을 연하게 해주는 효과를 가지는 화장품으로 구분할 수 있다. 미백은 이제 여성의 전유물이 아니라, 남성용 미백 화장품, 바디 미백 화장품 등의 시장이 확대되면서 그 중요성과 영향력을 확인할 수 있다.

미백 화장품은 지금도 활발하게 연구 개발이 이루어지고 있는데, 시장의 선호도를 파악하여 차별화된 천연 추출물에 대한 기술력 확보가 중요하다. 이를 위해 성분과 효능에 대한 전문성의 강조가 필요하며, 다양한 미백 기전을 연구해야 한다.

피부색은 혈관 분포와 혈색소, 각질층의 두께 및 카로틴, 멜라닌 등 여러 가지 요인들에 의해 좌우된다. 이 중 멜라닌은 페놀류의 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체로, 멜라닌의 분포와 양이 피부색을 결정하는 가장 중요한 인자이다. 멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌 세포에 의하여 생성되는데, 멜라닌 세포는 신경능에서 기원한 세포로 피부를 자외선으로부터 보호하기 위해 멜라닌을 생성하게 된다. 생성된 멜라닌은 주변 각질형성세포로 전이되어 피부색을 나타낸다.

하지만 과한 자외선에서의 노출은 피부에 상당량의 염증 매개물과 신호전달물질을 생성시켜 멜라닌 세포를 활성화시키고 다량의 멜라닌을 생성하여 색소 침착을 유발한다.

멜라닌 세포에서 멜라닌이 생성되기 위해서는 티로시나아제(Tyrosinase), TRP-1, TRP-2 등 여러 가지 유전자가 관여하고 있으며, a-MSH, IL-1, GM-CSF 등의 여러 가지 세포 신호전달물질들도 관여한다.

이 중 티로시나아제는 멜라닌 생합성의 속도 결정 단계인 초기 반응에 관여하는 효소로, 티로신(Tyrosine)을 도파(DOPA)로 전환하고, 도파를 도파퀴논(Dopaquinone)으로 산화하여 멜라닌을 생성하는데 관여한다.

미백 효과를 보기 위해서는 티로시나아제의 발현 또는 활성을 억제하거나 생성된 티로시나아제를 분해, 생성된 멜라닌 과립을 각질형성 세포로의 분비 억제, 각질제거 등을 통해 미백 효과를 볼 수 있다.

벌사상자(Cnidium monnieri)는 쌍떡잎식물로, 높이 약 1m 정도이다. 줄기는 곧게 서고 속이 비어있고 세로로 능선이 있다. 잎은 어긋나며 3회 길꼴로 갈라지며 잎자루가 줄기를 감싼다. 꽃은 8월에 백색으로 피며 작은 우산꽃차례의 꽃대는 15~30개이며 열매는 갈래열매로 타원형이며 날개같은 능성이 있다.

벌사상자는 피부 질환, 가려움 등에 효과가 있다고 알려져 있으며, 쿠마린, 플라보노이드, 사포닌 등의 유효 성분을 함유하고 있다. 그 중 오스톨(Osthole)은 선행연구를 통해 항염, 항암, 비만억제 등의 효능이 있다고 알려져 있다. 특히, 한국공개특허 10-2017-0030836에서 오스톨을 포함하는 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물을 통해 피부에 효능효과를 가진 것을 확인하였다. 이는 오스톨이 다양한 효능을 가진 우수한 물질임을 뒷받침하는 것이다.

벌사상자의 부위 중 벌사상자의 열매, 특히 종자에서 그 효능이 나타난다. 종자는 ‘씨’, ‘씨앗’이라고도 한다. 성숙한 종자는 배와 배젖 및 바깥에 있는 종피로 구성되어 있다. 배는 극히 작은 식물체이고 배젖은 주로 녹말이지만, 사탕, 지방, 단백질들을 많이 함유하고 있는 경우도 있다. 종자는 내부에 이들 저장양분에 작용하는 여러 효소를 가지고 있으며 배의 발아, 발육, 생장에 필요한 생장 호르몬도 함유하고 있어 발아 시에 사용하게 된다. 종자를 활용한 추출물과 관련하여 오미자 종자 추출물을 포함하는 피부 미백 개선용 화장품 조성물 (한국공개특허 제10-2017-0012126호), 바실씨앗 추출물의 유효성분을 통한 주름 개선과 피부 보습, 탈모방지의 효과가 있는 화장료 조성물 (한국공개특허 제10-2015-0074537호), 산수유 종자를 추출하여 항염 효과가 있는 조성물에 관한 한국등록특허 제10-1923822호 ‘산수유 씨앗 추출물을 포함하는 항염증 조성물’등을 포함한 다수의 특허가 출원되어 있다.

발아란, 식물의 종자, 포자, 화분, 가지, 뿌리 등에서 싹이 발생 또는 생장을 개시하는 현상을 의미한다. 발아 동안에 종자는 생명 활동에 필요한 영양을 공급하기 위해 다양한 효소를 생산하게 된다. 이로 인해 종자 내의 단백질과 올리고당 등을 포함한 각종 영양 성분이 분해가 되며, 영양성분의 질적 변화, 미량 영양소의 증가, 비영양적 요소의 감소나 제거, 생리활성 물질의 증가 및 신규 물질의 생성 등의 다양한 변화가 수반된다.

기존 벌사상자 추출물과 같은 단순추출물의 경우에도 유효한 효능을 가지고 있지만, 실제로 이를 함유한 화장료 피부에 도포하였을 때는 그 효과가 미미한 문제점이 있다. 그리고 벌사상자 추출물 내의 유효성분의 함량을 높여 뛰어난 효능효과를 발휘하기 위해서 다양한 제조방법을 통해 유효성분을 극대화한 연구는 지금까지 없었다.

이에 본 발명자들은 부작용과 피부 자극이 적고 유효성분 함량을 높여서 효과적인 미백용 화장료 조성물을 개발하기 위하여 다양한 추출법, 전처리 방법을 적용함으로써 벌사상자 발아 추출물의 오스톨 유효성분을 극대화하는 방법에 대한 연구를 진행하였으며, 그 결과물인 조성물이 미백 효과가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 실시예들은 벌사상자의 종자를 발아하고 이를 고온 고압에서 전처리함으로써 벌사상자의 유효성분인 오스톨의 함량을 높이고자 한다.

또한, 멜라닌 형성을 억제하고 세포 내 티로시나제 활성을 저해하며, 색소 침착을 억제함으로써 우수한 미백 효능을 가진 화장료를 제공하고자 한다.

또한, 세포독성이 나타나지 않아 피부 자극이 적고 안전한 천연 미백 화장료를 제공하고자 한다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 벌사상자 종자를 채취하는 단계; 채취한 상기 벌사상자 종자를 발아시키는 단계; 발아한 상기 벌사상자 종자를 일정 온도와 일정 압력에서 전처리하는 단계; 및, 상기 전처리한 벌사상자 종자로부터 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물을 추출하는 단계;를 포함하는 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법이 제공될 수 있다.

상기 벌사상자 종자를 발아시키는 단계는, 18℃ 내지 22℃의 온도에서 2일 내지 4일간 발아시킬 수 있다.

상기 발아된 벌사상자 종자의 새순 길이는 0.1cm 내지 0.3cm일 수 있다.

상기 벌사상자 종자를 전처리하는 단계는, 30℃ 내지 120℃의 온도와 1기압 내지 3기압의 압력 상태에서 전처리할 수 있다.

상기 벌사상자 발아 추출물을 추출하는 단계는, 물, 탄소수 1~6의 알코올, 주정, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 프로필렌글리콜 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 용매를 가하여 추출할 수 있다.

상기 추출은 가열 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 중 어느 하나가 적용될 수 있다.

상기 추출된 벌사상자 발아 추출물의 농도는 3㎍/㎖ 내지 7㎍/㎖일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기한 제조방법에 의해 제조된 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명의 실시예들은 벌사상자의 종자를 발아하고 이를 고온 고압에서 전처리함으로써 벌사상자의 유효성분인 오스톨의 함량을 높일 수 있다.

또한, 멜라닌 형성을 억제하고 세포 내 티로시나제 활성을 저해하며, 색소 침착을 억제함으로써 우수한 미백 효능을 가진 화장료를 제공할 수 있다.

또한, 세포독성이 나타나지 않아 피부 자극이 적고 안전한 천연 미백 화장료를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 발아 추출물의 농도별 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 발아 추출물의 농도별 멜라닌 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 발아 추출물의 농도별 티로시나제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 발아 추출물이 함유된 시험군과 함유되지 않은 대조군의 적용 기간에 따른 L value 값을 비교한 그래프
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 발아 추출물이 함유된 시험군과 함유되지 않은 대조군의 적용 기간에 따른 미백효과에 대한 육안평가 결과를 비교한 그래프

이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록, 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 발아 추출물의 농도별 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 발아 추출물의 농도별 멜라닌 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이며, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 발아 추출물의 농도별 티로시나제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 발아 추출물이 함유된 시험군과 함유되지 않은 대조군의 적용 기간에 따른 L value 값을 비교한 그래프이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 발아 추출물이 함유된 시험군과 함유되지 않은 대조군의 적용 기간에 따른 미백효과에 대한 육안평가 결과를 비교한 그래프이다.

도 1 내지 도 5를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법은 크게 벌사상자 종자를 채취하는 단계; 채취한 상기 벌사상자 종자를 발아시키는 단계; 발아한 상기 벌사상자 종자를 일정 온도와 일정 압력에서 전처리하는 단계; 및, 상기 전처리한 벌사상자 종자로부터 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물을 추출하는 단계;를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명은 벌사상자 추출물의 오스톨(osthole)의 우수한 효능을 인식하고, 그 유효성분의 함량을 극대화하기 위해 벌사상자 부위별 및 추출 조건별로 세분화하여 추출을 진행하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 벌사상자의 추출 대상은 식물의 꽃, 잎, 줄기, 종자, 뿌리를 포함하는 군으로부터 선택되며, 벌사상자의 종자 채취 시기는 과실의 성숙기인 10월 전후에 채취하여 사용한다.

먼저, 벌사상자 전초를 세척한 뒤 꽃, 잎, 줄기, 뿌리, 종자별로 분리하였다. 추출 용매로서 70% 에탄올 수용액 5배 중량을 넣어 60℃에서 12시간씩 총 3회 환류 추출하였다. 그 후, 원심분리와 여과포를 통해 여과를 하여 여과액을 얻고, 얻은 여과액을 60℃에서 감압 농축하여 추출물을 얻었다.

실험예 1: 부위별 오스톨 함량 측정

오스톨 분석은 액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하였다. 이동상으로는 메탄올, 아세토니트릴, 물을 각각 35% , 30%, 35%로 사용하였다. 컬럼은 안지름 약 4.6mm, 길이 약 15cm인 스테인레스 관에 5um의 액체크로마토그래프용 옥타데실실릴화한 실리카 겔을 충전하였다, 컬럼온도는 25℃이며 유속은 1.0ml/분, 측정파장은 320nm으로 진행하였다.

그 결과는 하기의 표 1에 나타내었다.

시험물질	오스톨 함량 (%)
종자 추출물	5.56
꽃 추출물	3.19
잎 추출물	1.25
줄기 추출물	1.08
뿌리 추출물	0.58

상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 벌사상자 종자 추출물의 오스톨 함량이 5.56%로 다른 부위의 추출물보다 오스톨 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있으며, 따라서 본 실시예에서는 벌사상자의 종자 추출물을 중심으로 추출을 진행한다.

그 다음 단계는 상기 채취한 벌사상자 종자를 발아시키는 것이다. 구체적으로 벌사상자 종자를 정제수에 5시간 수침시킨 후, 건져내어 발아의 최저 온도, 최적 온도, 최고 온도의 평균을 설정하여 10℃, 20℃, 30℃ 온도에서 7일간 발아하였다.

여기서 발아는 식물의 종자, 가지나 뿌리 등에 싹이 발생하거나 또는 생장이 시작되는 것을 의미한다. 발아한 벌사상자를 일수별로 수거하여 전술한 바와 동일한 방법으로 추출하여 벌사상자 발아 추출물을 제조하였다.

본 발명의 일 실시예에서 발아 조건은 최저온도 0~10℃, 최적온도 20~30℃, 최고 온도 30~50℃의 온도에서 진행하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 발아가 되는 조건들을 포함하며, 발아는 발아 조건에 놓여진 순간부터를 의미한다. 발아를 통해 껍질이 벗겨지고 새순이 나는 것을 포함하며 이때 싹의 길이 또는 방향에 있어서는 제한이 없다. 종자의 발아에는 각각의 정해진 광, 온도, 산소, 수분이 필요하다. 이러한 발아 조건에 따라 발아율, 발아속도, 유용성분과 생리활성의 변화가 일어난다. 이러한 이유로 발아를 진행할 때는 다양한 발아 조건에서의 유효 성분과 생리 활성의 측정이 필요하다.

실험예 2: 발아 조건별 새순 길이와 오스톨 함량 측정

벌사상자 종자 추출물의 오스톨 함량을 높이기 위해 전술한 조건별로 발아를 진행하였다. 오스톨 함량 분석은 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하였다.

그 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.

발아 온도	발이 일수	새순 길이 (cm)	오스톨 함량 (%)
벌사상자 추출물		0.0	5.51
10℃	1일	0.0	5.46
	2일	0.0	5.45
	3일	0.0	5.39
	4일	0.0	5.60
	5일	0.00	5.69
	6일	0.00	5.88
	7일	0.05	6.01
20℃	1일	0.0	5.95
	2일	0.1	7.56
	3일	0.2	8.10
	4일	0.3	6.53
	5일	0.5	5.48
	6일	0.8	2.48
	7일	1.3	2.33
30℃	1일	0.0	5.61
	2일	0.0	5.58
	3일	0.0	5.66
	4일	0.0	5.65
	5일	0.00	5.76
	6일	0.05	5.80
	7일	0.05	5.83

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이, 벌사상자 추출물은 평균 20℃의 온도에서 최적의 발아율과 발아속도를 보였다. 10℃와 30℃ 발아 시에는 오히려 발아속도가 늦어졌다. 새순이 나오기 시작한 일수는 10℃에서는 7일 차, 30℃에서는 6일 차인데 반해 20℃에서는 2일 차부터 새순이 나왔다. 동일한 7일 발아 동안에 10℃와 30℃에서는 0.05cm의 새순이 나왔으며, 그에 반해 20℃에는 1.3cm의 새순이 나왔다.

벌사상자 발아의 최적 온도로는 20℃임을 확인하였으며 오스톨 함량을 통해 유효성분의 변화를 보았다. 10℃와 30℃에서 발아할 시에는 7일 차에서 가장 오스톨 함량이 높았으며, 최적의 발아 온도인 20℃에서는 일수별로 3일 차, 2일 차, 4일 차 순으로, 새순 길이별로는 0.2cm, 0.1cm, 0.3cm 순으로 오스톨 함량이 높았으며, 그 함량은 각각 8.10%, 7.56%, 6.53% 였다.

발아 속도와 오스톨 함량으로 비교하였을 때, 벌사상자의 최적의 발아조건으로는 20℃에서 3일, 새순 길이가 0.2cm일 때인 것으로 확인되었다.

즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 벌사상자 종자를 발아시키는 단계는, 바람직하게는 18℃ 내지 22℃의 온도에서 2일 내지 4일간 발아시키며, 이때, 상기 발아된 벌사상자 종자의 새순 길이는 0.1cm 내지 0.3cm일 수 있다.

그 다음 단계로서 발아한 상기 벌사상자 종자를 일정 온도와 일정 압력에서 전처리를 수행할 수 있다. 즉, 수율과 유효성분 극대화를 위해 열과 압을 이용하여 전처리를 진행하는 것이며, 고온처리 방법은 50℃ 이상의 고온에서 볶거나 스팀 처리를 하나, 이에 한정된 것은 아니다. 열처리 온도는 30℃, 40℃도 포함할 수 있다. 고압 처리 방법은 1기압 이상의 기압에서 진행한다. 추출 전 전처리로 열과 압을 이용하는 방법으로는 당업계에게 자명한 법이라면 제한이 없다.

구체적으로 본 실시예에서는 발아 전의 벌사상자 혹은 발아한 벌사상자를 추출하기 전에 각각 30℃, 50℃, 100℃에서 1기압, 1.5기압, 2기압에서 30분간 처리한 후, 첫 단계와 동일한 방법으로 추출하여 추출물을 제조하였다.

실험예 3 : 전처리 여부별 오스톨 함량 측정

벌사상자에서 최적의 발아 조건으로 확인된 20℃, 3일차, 새순길이 0.2cm에서 발아한 벌사상자를 추출하기 전에 오스톨 함량을 더욱 높이고자 고온고압처리 후 추출을 진행하였다.

오스톨 함량 분석은 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 그 결과는 하기의 표 3에 나타내었다.

시험물질			오스톨 함량 (%)
	온도 (℃)	기압
발아 전 벌사상자 종자 추출물	30	1	5.53
		1.5	5.60
		2	5.87
	50	1	5.83
		1.5	6.01
		2	6.26
	100	1	6.15
		1.5	6.51
		2	7.09
3일 발아 벌사상자 추출물	30	1	8.14
		1.5	8.26
		2	8.88
	50	1	8.66
		1.5	8.93
		2	9.29
	100	1	9.10
		1.5	9.67
		2	10.65

상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 온도가 높을수록, 기압이 높을수록 오스톨 함량이 높아졌다. 이는 발아 전, 후의 벌사상자 추출물 모두 동일한 경향을 나타냈다. 3일 발아 후, 100℃에서 2기압으로 전처리하고 추출했을 경우에 오스톨 함량이 10.65%로 가장 높았다. 이 함량은 발아 전의 아무런 처리를 하지 않은 벌사상자 종자 추출물과 비교하여 약 2배 높은 함량이었다.

결론적으로, 상기 벌사상자 종자를 전처리하는 단계는, 30℃ 내지 120℃의 온도와 1기압 내지 3기압의 압력 상태에서 전처리하는 것이 바람직하다.

마지막 단계로서 상기 전처리한 벌사상자 종자로부터 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물을 추출하는 과정을 진행한다.

여기서 상기 추출물은 물, 탄소수 1~6의 알코올, 주정, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 프로필렌글리콜으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하거나 이들의 혼합 용매로 추출한다. 추출 시, 원물의 약 5배에서 20배 정도에 해당하는 용매를 가하여 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 추출은 가열 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등이 이용될 수 있으며, 추출 온도는 저온, 상온, 고온에서 이루어질 수 있다. 추출 용매와 조건에 대해서는 당업자에게 자명한 추출법이라면 제한이 없다. 추출 시간과 횟수는 추출 용매 및 온도 등의 조건에 따라 달라질 수 있다.

실험예 4 : 세포 독성 확인

위와 같은 추출 과정을 거쳐 수득한 벌사상자 발아 추출물의 피부세포에 대한 세포독성을 평가하였다. 96-웰 플레이트에 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것)에 희석된 멜라닌 세포 B16F10의 5×105의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 실시예에서 제조한 추출물을 시료농도가 0.5 ~ 20㎍/㎖ 가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumboromide, Sigma)용액을 각 well에 100㎖씩 첨가한 후 (3㎍/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150 ㎕의 디메틸 설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 microplate reader(Discover Microplate Reader)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였다.

세포생존율(%)=시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

본 실험에서와 같이 벌사상자 발아 추출물을 B16F10에 처리한 결과, 도 1에서 보는 것처럼 0.5 ~ 20㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포독성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다. 이는 일반적으로 화장품에 사용되는 농도를 고려하였을 때 피부 자극 유발 가능성이 적은 안전한 시료인 것을 말해준다.

실험예 5 : B16F10 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제 실험

위와 같은 추출 과정을 거쳐 수득한 벌사상자 발아 추출물 시료의 미백효과를 확인하기 위해 B16F10 멜라닌 세포에 대한 멜라닌 합성억제 효과를 측정하였다. 24well plate에 B16F10을 2×10⁴ cells/well씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 배양하였다. 24시간 후, 멜라닌 생성 과정을 촉진하는 α-MSH 100 nM과 함께 일정 농도의 시험물질을 처리하여 72시간 배양하였다. 72시간 후, 세포 배양액을 immunoplate에 옮겨 세포 외 멜라닌(Release melanin)의 양을 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 배지를 제거하고 남은 세포는 PBS로 세척 후, 1N의 수산화나트륨을 100㎕를 넣고 용해시켰다. 용해시켜 얻은 세포 내 멜라닌(Cellular melanin)의 양을 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 외 멜라닌 양과 세포 내 멜라닌 양을 일정 단백질 당 멜라닌 양으로 환산하여 음성대조군과 비교하였다.

단백질 정량 측정을 위해 세포 배양액을 회수하고 PBS로 세척 후, 1N의 수산화나트륨을 처리하여 세포를 용해시켜 주었다. 단백질 정량법 중 하나인 BCA 방법으로 측정하였으며 Thermo의 BCA Protein Assay Kit를 이용하였다. Reagent A와 Reagent B를 50:1로 반응시켜 준 후, 세포 용해액에 처리하여 37℃에서 30분간 반응시켜주었다. 반응 후, 560㎚에서 흡광도를 측정하여 단백질 양을 확인하였다. 최종 단백질의 양은 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin)으로부터 얻은 표준곡선을 이용하여 결정하였다.

각 항목에 따라 mean±SD를 그래프에 넣었으며 Studnet’s t-test를 시행하여 P<0.05 미만의 경우, 유의성이 있는 것으로 판단하였다. (*P<0.05, **P<0.01)

B16F10 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과를 시험한 결과 본 발명의 실시예에 따라 제조된 벌사상자 발아 추출물 시료는 도 2에서 보는 것처럼 5㎍/㎖에서 유의한 멜라닌 억제 효과를 가진 것으로 확인되었다.

실험예 6 : 세포내 티로시나제 (Cellular tyrosinase) 활성 측정

위와 같은 추출 과정을 거쳐 수득한 벌사상자 발아 추출물 시료의 세포내 티로시나제 (Cellular tyrosinase) 활성을 측정하였다. Melanoma((B16F10 ATCC) 세포를 각 culture dish에 가득 배양 한 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척한다. 각 dish에 lysis buffer (67mM sodium phosphate buffer, 1% triton X-100, 0.1mM phenylmethyl, sulfonyfluoride)를 100㎕ 첨가한 후 얼음에 방치하여 세포를 파괴시키고, 세포를 수집하여 ultra sonication 한다. 이를 1시간 동안 방치한 후 13,000rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻어진 상층액을 효소용액으로 사용한다. 이를 67mM phosphate buffer(pH6.8)에 녹인 8.0mM의 L-DOPA 120㎕와 시료용액 40㎕를 96-well plate 에 넣은 후, 67mM phosphate buffer (pH 6.8)에 녹인 효소용액 40㎕을 첨가하여 37℃에서 30분간 배양한 후, 생성된 DOPA chrome의 양을 490nm에서 측정한다. 저해율은 아래와 같이 계산하였다.

저해율 (%) = (1 - 시료첨가군의 흡광도 / 무첨가군의 흡광도) × 100

세포 내 티로시나제 활성을 측정하기 위하여 B16F10 멜라노마 세포에 벌사상자 발아 추출물을 처리하여 티로시나제(Tyrosinase) 활성을 측정한 결과는 도 3과 같이 나타내었다. 벌사상자 발아 추출물 5㎍/㎖에서 약 31% (p<0.05) 정도 감소됨을 확인하였다.

실험예 4 내지 실험예 6에서 확인되는 바와 같이, 상기 추출된 벌사상자 발아 추출물의 농도는 3㎍/㎖ 내지 7㎍/㎖로 이루어지는 것이 바람직하다.

실험예 7 : 벌사상자 발아 추출물을 함유하는 화장료 조성물 제조

상기 실시예에서 수득한 벌사상자 발아 추출물을 이용하여 이를 함유하는 화장료 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물은 점성의 크림형태로, 그 조성은 하기 표 4에 나타내었다.

우선, 조성물을 제조하기 위하여 표 4의 (나)상을 해당 중량비 대로 혼합한 후 가열하여 70℃ 온도로 보존하였다. 그런 다음, (나)상에 (가)상을 해당 중량비대로 첨가하여 예비 유화시킨후 호모믹서를 이용하여 균일하게 혼합 유화시켰다. 유화된 혼합물을 서서히 냉각하여 벌사상자 발아 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 시험군으로서 제조하였다. 이를 벌사상자 발아 추출물이 함유되지 않은 대조군과 비교하였다.

		시험군 (중량%)	대조군 (중량%)
(가)	스테아릴알콜	7	7
	스테아린산	3	3
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알산	4	4
	2-옥틸도데실 알콜	7	7
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴노스테아린산 아스테르	2	2
(나)	벌사상자 발아 추출물	3	-
	프로필렌글리콜	0.05	0.05
	정제수	to 100	to 100

이와 같이 제조된 시험군 및 대조군의 화장료 조성물에 대하여 아래와 같이 미백 효능에 대한 실험을 진행하였다.

실험예 8 : 피부 미백개선 효능 평가

본 실험은 실험예 7에서 제조한 시험군과 대조군의 화장료 조성물을 이용하여 ‘피부 미백개선에 도움을 주는 기능성 화장품’에 관한 식품의약품안전처의 가이드라인 및 ‘미백 개선 효능 평가 시험 방법 및 기준’에 따라 시험을 수행하였다.

시험은 ‘인공색소 침착 후 미백효과 평가 시험’으로 피험자 수는 통계적으로 비교가 가능하기 위해 20명 이상의 유효데이터를 확보하도록 하며, 대조군을 사용시 이중맹검법을 원칙으로 하였다. 시험 진행은 만 18~60세의 건강한 성인 남녀 20명을 대상으로 시험부위(상완)의 최소 홍반량 판정 및 자외선 조사를 4일간 진행하였으며, 8주간 제품을 1일 2회 (아침/저녁) 도포하도록 하고 시험부위의 사진촬영과 미백개선을 평가하기 위한 기기 측정 및 안정성 평가, 설문 평가를 병행하여 효과 및 안전성을 평가하였다.

이와 같은 비교측정결과 도 4에서 보는 바와 같이 미백효과 측정 시 시험진행 주차에 따른 *L value 값을 나열하였을 때 시험군은 61.53 A.U, 62.88 A.U., 63.44 A.U., 64.69A.U.이고, 대조군은 61.66 A.U., 62.72 A.U., 63.36 A.U., 64.23 A.U.로 나타났다. 시험 제품 사용 8주차에서 통계적으로 유의한 차이가 있었으며(p<0.05), 도 5에서 보는 것처럼 육안평가에서도 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(p<0.05).

결과적으로 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통계적으로 유의한 수준의 미백개선효과가 있음을 알 수 있었다.

지금까지 설명한 본 발명의 실시예들에 의한 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물에 따르면, 벌사상자의 종자를 발아하고 이를 고온 고압에서 전처리함으로써 벌사상자의 유효성분인 오스톨의 함량을 높일 수 있다.

그리고 멜라닌 형성을 억제하고 세포 내 티로시나제 활성을 저해하며, 색소 침착을 억제함으로써 우수한 미백 효능을 가질 뿐만 아니라, 세포독성이 나타나지 않아 피부 자극이 적고 안전한 천연 미백 화장료를 제공할 수 있다.

상기에서는 본 발명의 일 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 당업자는 이하에서 서술하는 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경 실시할 수 있을 것이다. 그러므로 변형된 실시가 기본적으로 본 발명의 특허청구범위의 구성요소를 포함한다면 모두 본 발명의 기술적 범주에 포함된다고 보아야 한다.

Claims (8)

1. 벌사상자 종자를 채취하는 단계;
   채취한 상기 벌사상자 종자를 발아시키는 단계;
   발아한 상기 벌사상자 종자를 일정 온도와 일정 압력에서 전처리하는 단계; 및,
   상기 전처리한 벌사상자 종자로부터 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물을 추출하는 단계;를 포함하는 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 벌사상자 종자를 발아시키는 단계는,
   18℃ 내지 22℃의 온도에서 2일 내지 4일간 발아시키는 것을 특징으로 하는 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 발아된 벌사상자 종자의 새순 길이는 0.1cm 내지 0.3cm인 것을 특징으로 하는 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 벌사상자 종자를 전처리하는 단계는,
   30℃ 내지 120℃의 온도와 1기압 내지 3기압의 압력 상태에서 전처리하는 것을 특징으로 하는 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 벌사상자 발아 추출물을 추출하는 단계는,
   물, 탄소수 1~6의 알코올, 주정, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 프로필렌글리콜 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 용매를 가하여 추출하는 것을 특징으로 하는 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 추출은 가열 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 중 어느 하나가 적용되는 것을 특징으로 하는 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법.
7. 제5항에 있어서,
   상기 추출된 벌사상자 발아 추출물의 농도는 3㎍/㎖ 내지 7㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물 제조방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 의한 제조방법에 의해 제조된 오스톨 유효성분을 함유하는 벌사상자 발아 추출물을 포함하는 미백 화장료 조성물.
   

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