CN108059652A - 一种利用蛋白酶解法制备的灰树花硒螯合肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用蛋白酶解法制备的灰树花硒螯合肽，以灰树花为原料，利用碱性蛋白酶酶解灰树花蛋白制备多肽，采用超滤、Sepadex G‑25凝胶色谱和半制备RP‑HPLC‑C18反相高效液相色谱纯化得到特异性硒元素螯合肽AEKE。该多肽不仅可以螯合硒元素，将无机硒转化为有机硒，且其能够借助肽在小肠内的吸收、转运特点以配合物的整体形式被主动吸收。该多肽仍具有抗氧化、增强免疫力、降血糖等生物活性等生物活性。

Description

一种利用蛋白酶解法制备的灰树花硒螯合肽
技术领域
本发明涉及一种灰树花硒螯合肽，更具体地涉及了一种利用碱性蛋白酶酶解灰树花蛋白制备的硒螯合肽，属于生物技术领域。
背景技术
硒(Se）是维持生物体机能包括生长、发育、繁衍等不可或缺的一类物质，对生物体的生理机能的调节和营养的补充有明显的效果。虽然人体对硒的需求量极少，但是对生物体的生理健康和有关生理疾病的预防都与之密不可分。人体缺硒能造成体内重要器官的功能失调，还会使得糖尿病、肿瘤、心血管疾病、白内障、克山病等疾病的发病率提高。由于人工合成的有机硒化合物的生物安全性明显高于人工合成或天然的无机硒化物，甚至有些功能活性优于无机硒。因此，具有较高生物活性和较低毒副作用的有机硒化合物具有更广阔的发展空间。
灰树花(Grifola frondosa)属担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌属中的一种大型真菌。又名莲花菌、舞茸、千佛菌、贝叶多孔菌等。灰树花是一种珍稀的食药兼用菌，近年来大量的研究表明，灰树花具有很好的抗HIV病毒、抗肿瘤、改善免疫系统功能、调节血脂、血糖及胆固醇水平、降低血压等功能作用。
利用生物技术对灰树花蛋白质资源的深加工，联合应用超滤、凝胶过滤和高效液相色谱法对生物活性肽进分离纯化，然后通过飞行时间质谱对多肽序列进行鉴定，得到特异性硒元素螯合肽的序列。这种多肽不仅可以螯合硒元素，将无机硒转化为有机硒，且其能够借助肽在小肠内的吸收、转运特点以螯合物的整体形式被主动吸收。该多肽仍具有降血压、抗衰老力、降血糖等生物活性等生物活性，具有重要的研究意义和价值，同时能提高食药用菌的附加价值。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不同，提供了一种利用碱性蛋白酶酶解灰树花蛋白制备的硒螯合肽，使硒螯合活性得以高效地实现，将无机硒转化为有机硒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种灰树花硒螯合肽，是由4个氨基酸所构成的四肽，所述多肽的氨基酸序列为：AEKE。
所述灰树花硒螯合肽的制备方法如下：
以灰树花蛋白为原料，利用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到特异性硒螯合肽；
酶解条件为：底物浓度3wt%，酶解pH为10.0，酶解温度为50℃，酶解时间为1h，酶-底物配比为1:20（w/w）；所述酶为碱性蛋白酶；
分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用膜超滤技术进行分离，即将酶解产物（灰树花酶解多肽溶液）过0.22µm 滤膜，通过3 kDa和10 kDa 的超滤膜将酶解液分成不同分子量的溶液并冻干；测定和收集具有最高硒螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 mL/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高硒螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用0-50%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4 mL/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为30%乙腈和70%水的洗脱峰，采用LC/MS液质联用质谱仪分析，得出保留时间为3.46 min处的峰为所述硒螯合特征肽。
本发明立足于多肽具备与矿质元素离子螯合的作用位点，能够与其形成稳定的化合物，且多肽-矿质元素螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、可同时补充氨基酸和矿质元素的理论基础，以来自于灰树花的灰树花蛋白为原材料，通过碱性蛋白酶的切割条件控制，切割制备具有高硒螯合活性的肽，而使硒螯合活性得以高效地实现。本发明为食药用菌灰树花的应用提供了一条新思路。
附图说明
图1为纯化灰树花蛋白源硒螯合肽的 LC/MS微阵列图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
具体步骤如下：
本发明所采用的灰树花蛋白来自于实验室自制，酶购自购买于北京索莱宝科技有限公司(中国·北京)。称取3.0g灰树花蛋白溶解于100ml蒸馏水中，然后用2mol/L NaOH调节其pH至10.0。先将该溶液水浴加热到50℃，接着再按酶-底物配比1:20（w/w）加入相应量的酶，酶解时间1h。接着在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟。上清液收集后备用，所述酶为碱性蛋白酶。
利用膜超滤技术行分离上清，首先将上清溶液过0.22µm 滤膜，再通过3 kDa和10kDa 的超滤膜将上清液液分成不同分子量的溶液冻干，测定和收集各分子量范围样品并测定硒螯合活性；
对膜超滤技术分离的具有最高硒螯合活性的样品再进行下一步的分离，用SephadexG-25凝胶过滤色谱（长100cm，外径2.0cm）进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 mL/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高硒螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用0-50%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4 mL/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为30%乙腈和70%水的洗脱峰，采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出保留时间为3.46min处的峰为所述硒螯合特征肽。
冷冻干燥得到本发明的硒螯合肽。
AEKE的硒螯合力为85.07mg/g。
采用比色法测定硒螯合肽对硒离子的螯合作用。称取多肽溶液6mL，按亚硒酸钠和多肽体积比为4:6加入亚硒酸钠（0.5mol/L），搅拌均匀，调节pH至9.0，在50℃条件下持续反应90min，冷却4500r/min离心10min去除固体，加入5倍体积95%乙醇，沉淀静置12h，4500r/min离心10min去除上清液，用等体积无水乙醇洗涤数次，干燥得螯合物粉末。称取灰树花蛋白肽-硒螯合物0.2g左右，放入100mL小烧杯中，加入5mL消化液，在电炉上消化至无色透明为止，用40% NaOH溶液和5% NaOH溶液调节pH7.0左右，后定容至50mL，待测。将定容好的溶液放至10mL离心管中（保存），取0.5mL样液，加入40mL蒸馏水，用1mol/L HCl 调节pH至2~3后，加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液2mL，然后加入0.5%的3,3'-二氨基联苯胺（DBA）2mL，置于60℃水浴50min（避光）震荡，取出用1 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0~7.5，准确加入10mL甲苯，震荡摇匀2min，静置3~4min分层，然后将甲苯层于420nm处测定溶液的吸光度（甲苯做空白）。
采用3,3'-二氨基联苯胺比色法测定硒含量。
式中：p为从标准曲线中查得的相当于硒的标准质量浓度/（µg/mL）；V为甲苯萃取所得的样品体积/mL；m为样品的质量/g；N为用于测定的样品体积占总定容后样品的体积分数/%。
标准曲线的制作：
硒标准溶液：准确称取2.1940g干燥的亚硒酸钠，溶于蒸馏水，定容至1L，制备成含硒1g/L的硒贮备液，临用时用蒸馏水稀释成5mg/mL的硒标准溶液。
取5个锥形瓶，分别放入2.0、4.0、。6.、8.0、10.0 mL的硒标准溶液，各加蒸馏水至40mL蒸馏水，用1mol/L HCl 调节pH至2~3后，加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液2mL，然后加入0.5%的3,3'-二氨基联苯胺（DBA）2mL，置于60℃水浴50min（避光）震荡，取出用1 mol/LNaOH溶液调节pH至7.0~7.5，准确加入10mL甲苯，震荡摇匀2min，静置3~4min分层，然后将甲苯层于420nm处测定溶液的吸光度（甲苯做空白）。所得到的标准曲线是y=0.00385x+0.02753。
对纯化的特异性硒螯合肽利用ESI质谱仪(WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS,Waters Co., U.S.A) 测定特异性硒螯合肽的氨基酸序列。所述硒螯合肽的氨基酸序列为：AEKE。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建农林大学
<120> 一种利用蛋白酶解法制备的灰树花硒螯合肽
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Ala Glu Lys Glu
1

Claims (4)

1.一种灰树花硒螯合肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：AEKE。
2.一种如权利要求1所述的灰树花硒螯合肽的制备方法，其特征在于：以灰树花蛋白为原料，采用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到所述灰树花硒螯合肽。
3.根据权利要求2所述的灰树花硒螯合肽的制备方法，其特征在于：所述酶解条件为：底物浓度3wt%，酶解pH为10.0，酶解温度为50℃，酶解时间为1h，酶-底物配比为1:20（w/w）；所述酶为碱性蛋白酶。
4.根据权利要求2所述的灰树花硒螯合肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用膜超滤技术进行分离，即将酶解产物过0.22µm 滤膜，通过3kDa和10 kDa 的超滤膜将酶解液分成不同分子量的溶液并冻干；测定和收集具有最高硒螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3ml/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高硒螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用0-50%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4 ml/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为30%乙腈和70%水的洗脱峰，采用LC/MS液质联用质谱仪分析，得出保留时间为3.46 min处的峰为所述硒螯合特征肽。
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