CN113321705B - 一种弹性蛋白酶抑制肽及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于蛋白质多肽技术领域，具体涉及一种提取自核桃粕的弹性蛋白酶抑制肽及其制备方法与应用。所述抑制肽自N端到C端的氨基酸序列为：Phe‑Phe‑Val‑Pro‑Phe(FFVPF)或Asn‑Ser‑Leu‑Asn‑Leu‑Pro‑Ile‑Leu(NSLNLPIL)。FFVPF对弹性蛋白酶的的半抑制浓度(IC₅₀)达到0.469±0.010mg/mL，且具有经过胃消化后部分分解，在肠道内全部分解的特性；NSLNLPIL对弹性蛋白酶的的半抑制浓度(IC₅₀)达到0.635±0.030mg/mL。本发明提供的短肽酶抑制作用明显，且采用核桃粕为原料，生产成本低，经济效益高。本发明还制备了负载短肽的纳米颗粒，CS‑TPP对短肽的包封率可达94.58±0.23％，粒径在140nm至180nm之间，zeta电位为+33mV至+36mV，且具有较好的环境稳定性。

Description

一种弹性蛋白酶抑制肽及其制备方法与应用

技术领域：

本发明属于蛋白质多肽技术领域，具体涉及一种提取自核桃粕的弹性蛋白酶抑制肽及其制备方法与应用。

背景技术：

弹性蛋白(Elastin)是存在于细胞外基质的一种纤维蛋白，对肺、动脉、韧带和皮肤的弹性至关重要。在人体成熟和衰老的过程中，弹性蛋白的溶解会加快衰老性疾病的发展。弹性蛋白酶(Elastase)是一种以降解弹性蛋白为特征的蛋白水解酶，它存在于微生物、蛇毒液和许多哺乳动物的细胞和组织中，包括胰腺、白细胞和巨噬细胞。近年来许多研究表明，弹性蛋白酶与皮肤光老化、肺部疾病、类风湿性关节炎等均有关联。

皮肤主要由具有支持和连接作用的蛋白质构成，其中的胶原蛋白和弹性蛋白对维持皮肤结构尤为重要，它们的降解和破坏与皮肤老化息息相关。皮肤老化分为内源性老化和外源性老化，由外界环境中的紫外线辐射引起的皮肤外源性老化即是光老化。过量紫外线照射会导致ROS(活性氧)水平升高并促进弹性蛋白酶过度分泌，加速降解弹性蛋白和细胞外基质，甚至损伤成纤维细胞，从而引起皮肤下垂和皱纹。

中性粒细胞弹性蛋白酶可以攻击细胞外基质，造成炎症和组织重塑，它的活性过高会导致呼吸道组织损伤，例如肺炎、肺气肿、呼吸窘迫和急性肺损伤(ALI)等。在急性肺损伤发生时，过量的弹性蛋白酶释放会造成组织水解，破坏肺泡结构。因此，调节弹性蛋白酶的活性被视为预防和治疗肺部疾病的可行手段。

类风湿性关节炎是一种由于软骨、肌腱和骨骼退化导致的慢性炎症疾病。研究表明，巨噬细胞弹性蛋白酶能够降解弹性蛋白以及软骨细胞中存在的多种细胞外基质，其活性增加可能会促进类风湿性关节炎的发生。

弹性蛋白酶抑制剂是指能够通过与酶活性中心上的一些基团发生相互作用，从而降低甚至破坏弹性蛋白酶活性的物质。弹性蛋白的降解与断裂可能在疾病中起到重要的作用，而弹性蛋白酶抑制剂能够阻止生物体内的弹性蛋白被过度分解，从而达到防止皮肤老化、促进健康的效果，所以弹性蛋白酶抑制剂在食品、医药和化妆品领域有潜在的应用价值。

已有相关文献报道天然产物对弹性蛋白酶的抑制作用，比如：Thring等(2009)对21种植物提取物的弹性蛋白酶抑制能力进行评估，发现其中10种具有较强的抑制活性，其中白茶提取物对弹性蛋白酶的抑制能力最高。通过升华法纯化提取的茶叶咖啡碱对弹性蛋白酶的抑制作用与浓度呈正相关，虽然其活性低于茶叶中另一种多酚EGCG，但体外稳定性良好，利用潜力高(叶心等，2020)。Andrade等(2021)对一系列香茶属(Plectranthus)植物提取物的成分进行探究，推测化合物中的五环三萜结构及类列罗酮二萜结构可以与弹性蛋白酶发生相互作用，从而抑制其活性。此外，研究者从草药和乳制品中筛选分离出6种乳酸杆菌菌株，其产生的胞外多糖对弹性蛋白酶均有较强的抑制作用，IC₅₀值均在81～142μg/mL之间。其中菌株B9-1和C11-1产生的胞外多糖的HPTLC碳水化合物谱相似且均为杂多糖，B9-1胞外多糖可以显著下调皮肤衰老相关酶的基因表达，在抗衰老、组织和皮肤再生方面有应用潜力(Shirzad et al.,2018)。

近年来，由于生物活性肽来源安全、成本低廉，具有作为功能性食品成分的潜力，研究者将目光转向生物活性肽。Keller等(2020)从海洋蓝细菌代谢产物中分离出三个具有较强弹性蛋白酶抑制能力的环状肽，命名为Tutuilamides A-C，它们与弹性蛋白酶的结合模式均为可逆结合模式，其活性与结构上含有的特殊残基有关，包括2-氨基-2-丁烯酸(Abu)和3-氨基-6-羟基-2哌啶酮(Ahp)。与之前报道的具有弹性蛋白酶抑制活性的多肽Lyngbyastatin 7相比，Tutuilamides A柔性侧链的氨基酸骨架上有一个额外的氢键，这也许导致了其与弹性蛋白酶结合得更稳定，对酶活性的抑制能力更强。Liu等(2018)研究了牛弹性蛋白水解物对皮肤的抗光老化作用，纯化并鉴定出有弹性蛋白酶抑制能力的四条肽段，其中肽段GLPY和GPGGVGAL活性较好，可能是由于其N端的甘氨酸和C端的亮氨酸可以与弹性蛋白酶产生较强的相互作用。该团队在后续研究中发现，二者均可以通过抑制ROS生成而达到保护成纤维细胞的效果，其中GPGGVGAL可以抑制Ca²⁺流入细胞，而GLPY能够通过调节Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达和MMP-12酶的水平抑制弹性蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的损失(Liu etal.,2019)。此外，分子量为0～3kDa的高粱多肽也被报道具有弹性蛋白酶抑制活性，且抑制能力与谷胱甘肽相似(Castro-Jácome et al.,2019)。

但目前尚未见以核桃粕为原料制备的蛋白酶抑制肽产品。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种提取自核桃粕的弹性蛋白酶抑制肽，为了获取上述产品，本发明以核桃粕为原料，利用超声-酶解法制备核桃粕多肽，通过超滤纯化酶解液，并选出活性最高的组分经LC-MS/MS分析鉴定多肽序列。通过PyRx虚拟筛选结合Autodock分子对接和氨基酸组成分析结合文献调研两种判断方式，筛选出目标肽段。人工合成目标肽段并验证活性、构建纳米颗粒体系包埋短肽，并对其基本性质、相互作用力、微观结构、稳定性和体外释放特性进行探究。

本发明提供的技术方案之一，是一种弹性蛋白酶抑制肽，所述抑制肽自N端到C端的氨基酸序列为：Phe-Phe-Val-Pro-Phe，以下简称FFVPF；或者，所述抑制肽自N端到C端的氨基酸序列为：Asn-Ser-Leu-Asn-Leu-Pro-Ile-Leu，以下简称NSLNLPIL；

所述蛋白酶抑制肽FFVPF、NSLNLPIL可通过人工合成的方式获得，也可通过对核桃粕酶解筛选获得；

本发明提供的技术方案之二，是上述蛋白酶抑制肽FFVPF、NSLNLPIL在抑制弹性蛋白酶中的应用，FFVPF对弹性蛋白酶的的半抑制浓度(IC₅₀)达到0.469±0.010mg/mL；NSLNLPIL对弹性蛋白酶的的半抑制浓度(IC₅₀)达到0.635±0.030mg/mL；

本发明提供的技术方案之三，是一种纳米颗粒体系包埋短肽，是将抑制肽由壳聚糖(CS)和三聚磷酸钠(TPP)包埋获得；

进一步地，制备方法如下：

(1)将壳聚糖溶于1％(v/v)的乙酸溶液后，调节pH至4.0得浓度为1mg/mL的壳聚糖溶液；

(2)将短肽与壳聚糖溶液混合搅拌充分溶解，得短肽-壳聚糖溶液；其中，短肽与壳聚糖溶液中的壳聚糖质量比为1-4:4；

(3)将浓度为2mg/mL的三聚磷酸钠溶液按1:8(v/v)比例滴入短肽-壳聚糖溶液中，超声处理后制得纳米颗粒悬浮液。

有益效果：

本发明提供了一种新型弹性蛋白酶抑制肽以及含有该抑制肽的纳米颗粒，其酶抑制作用明显，且采用核桃粕为原料，生产成本低，经济效益高。

基于试验结果，本发明获得抑制肽FFVPF对弹性蛋白酶的的半抑制浓度(IC₅₀)达到0.469±0.010mg/mL，且具有经过胃消化后部分分解，在肠道内全部分解的特性；NSLNLPIL对弹性蛋白酶的的半抑制浓度(IC₅₀)达到0.635±0.030mg/mL。

同时负载短肽FFVPF的CS-TPP纳米颗粒表现了良好的酸碱环境稳定性，在pH 4～6范围内无泄漏，在pH 2～8范围内，其对FFVPF的保留率均可达到70％以上，因此它不仅可以适用于pH为4～6的食品体系，还有利于改善FFVPF在胃肠道内的稳定性。CS-TPP纳米颗粒在65℃及以下具有良好稳定性，但当温度升高至75℃时，保留率降低至76.58±1.16％以下，这说明其能够适应室温储存和65℃及以下的加工。

附图说明：

图1肽段FFVPF的化学结构；

图2肽段FFVPF的二级质谱图；

图3弹性蛋白酶与短肽FFVPF的最佳构象相互作用示意图(平面图)；

图4弹性蛋白酶与短肽FFVPF的最佳构象相互作用示意图(立体图)；

图5肽段NSLNLPIL的化学结构；

图6肽段NSLNLPIL的二级质谱图；

图7模拟消化处理前后的FFVPF的反相液相色谱图(A：消化前，B：经胃消化处理，C：经胃肠消化处理)；

图8不同短肽FFVPF添加量的纳米颗粒的包封率和负载率；

图9不同短肽FFVPF添加量的纳米颗粒的粒径和多分散指数；

图10不同短肽FFVPF添加量的纳米颗粒的Zeta电位；

图11不同比例尺下负载短肽FFVPF的CS-TPP纳米颗粒的透射电镜图；

图12不同pH对负载短肽FFVPF的CS-TPP纳米颗粒保留率的影响；

图13不同温度对负载短肽FFVPF的CS-TPP纳米颗粒保留率的影响；

图14紫外线照射时间对负载短肽FFVPF的CS-TPP纳米颗粒保留率的影响；

图15负载短肽FFVPF的CS-TPP纳米颗粒的体外释放曲线。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所述的多肽，本领域技术人员可通过人工合成的方式获得，也可通过对核桃粕酶解筛选获得。

实施例1：蛋白酶抑制肽-多肽液的提取

本实施例所使用的核桃粕是经液压压榨法(冷榨)制油后得到的副产物。

(1)脱脂

核桃粕经粉碎机磨碎，过60目筛备用。将核桃粕粉与石油醚按1:5(w/v)混合，并在常温下置于磁力搅拌器中搅拌，3h后置换石油醚，重复三次。将处理后的核桃粕粉置于通风橱中，挥发有机试剂得到脱脂粉。核桃粕脱脂粉置于4℃环境中密封储存、备用。

(2)蛋白提取

按照Mao and Hua(2012)的方法稍有修改。准确称取40.0g核桃粕脱脂粉，并将其与去离子水按1:10(w/v)比例混合，用1mol/L NaOH溶液调节其pH值至11.0，在室温下置于磁力搅拌器中搅拌2h。将混合均匀的核桃粕液置于6000rpm转速下离心25min，收集上清液，并将2mol/L HCl滴入得到的上清液中，调整pH值到4.8，再以6000rpm的转速离心25min，用水冲洗沉淀物至pH为7.0，所得即为核桃粕分离蛋白。将核桃粕分离蛋白真空冷冻干燥，并储存在-20℃环境中备用。

(3)超声-酶解法制备核桃粕多肽

取1.0g核桃粕分离蛋白粉末与蒸馏水混合，液料比为27:1(v/w)，并在410W功率下超声处理20min。超声过程中，选用6号超声变幅杆，设置超声时间和超声间隙均为2s。用1mol/L NaOH溶液和1mol/L HCl调节反应体系pH至水解酶的最适pH 10.0，加入3.3％(w/w)碱性蛋白酶搅拌均匀，并置于水浴锅中酶解4.3h(温度为酶最适温度50℃)。酶解完成后，煮沸10min灭酶，并将酶解液pH调整至7.0，在4℃下以6000rpm转速离心20min，上清液即为多肽液，冻干备用。

(4)弹性蛋白酶抑制率测定

用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝8)配制1mmol/L反应底物N-琥珀酰基-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺、100mU/mL弹性蛋白酶、0.5mg/mL阳性对照EGCG及不同浓度多肽液样品。

本发明所使用的弹性蛋白酶为购自SIGMA的取自猪胰腺的弹性蛋白酶，酶活1U定义如下：在25℃，pH8.0下，每分钟水解1.0μmol的N-琥珀酰-L-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺所需的酶量。

将50μL底物和100μL多肽液样品(或Tris-HCl缓冲液作为空白对照)注入96孔板并混合均匀，在410nm处扫描，吸光度记为A₁和A₀。加入50μL弹性蛋白酶，反应5min后，加入10μLHCl(2mol/L)使反应终止，在410nm下测定吸光度，记为A₂和A₃，每个样品重复3次实验。弹性蛋白酶抑制率的计算公式如下：

A₀——空白对照组反应前

A₁——样品组反应前

A₂——样品组反应后

A₃——空白对照组反应后

测定不同的样品对弹性蛋白酶的抑制率，根据实验结果拟合计算样品对弹性蛋白酶的的半抑制浓度(IC₅₀)。结果如下：

以多肽得率和弹性蛋白酶抑制率为指标(多肽浓度为3mg/mL时测定)，碱性蛋白酶对核桃粕分离蛋白水解后，其多肽得率为43.06±1.51％，对弹性蛋白酶的抑制率达到49.23±0.88％。碱性蛋白酶酶解液对弹性蛋白酶的半抑制浓度IC₅₀达到2.955±0.084mg/mL，而对照组EGCG对弹性蛋白酶的半抑制浓度IC₅₀为0.209±0.007mg/mL。

实施例2：蛋白酶抑制肽的分离纯化

经超声-碱性蛋白酶酶解得到的核桃粕酶解液中包含游离氨基酸、长度不一的多肽以及水解程度较小的蛋白等，成分复杂，要获得活性、纯度高的多肽需要将其纯化。

本实施例利用超滤的手段、以弹性蛋白酶抑制能力为指标纯化核桃粕多肽，并通过LC-MS/MS鉴定纯化后组分的多肽序列。通过PyRx虚拟筛选结合Autodock Vina分子对接以及氨基酸测序结合文献调研两种手段，筛选出可能具有较强弹性蛋白酶抑制能力的肽段。

(1)超滤

将实施例1制备的核桃粕酶解产物进行超滤处理，以纯化和富集活性成分。依次使用截留分子量为10kDa、5kDa和3kDa的超滤膜包对酶解液进行超滤分离，将多肽溶液置于冰浴中以保持活性。结束后，将四个组分的核桃粕多肽分别冷冻干燥，置于-20℃保存备用。测定不同分子段多肽的对弹性蛋白酶的半抑制浓度。如表1所示，其中0～3kDa组分的活性最强，显著高于其他组分，5～10kDa及大于10kDa组分活性次之，且无显著性差异，3～5kDa活性最弱。因此选择0～3kDa组分进行下一步的氨基酸组成分析与液质分析。

表1不同分子量的酶解液对弹性蛋白酶的半抑制浓度

注：不同大小写字母表示样品间存在显著性差异(Duncan检验，p＜0.05)

(2)LC-MS/MS多肽组成鉴定

将样品进行还原烷基化预处理，过预柱(Acclaim PepMap RPLC C18,300μm×5mm,5μm)后以300nL/min的流速注入分析柱(Acclaim PepMap RPLC C18,75μm×150mm,3μm)中。流动相A：0.1％甲酸，2％乙腈；流动相B：0.1％甲酸，80％乙腈。洗脱梯度为：0～8min，6～9％B；8～24min，9～14％B；24～60min，14～30％B；60～75min，30～40％B；75～78min，40～95％B。一级质谱分辨率为70000，AGC目标为3e6，扫描范围100～1500m/z；二级质谱分辨率为75000，AGC目标为1e5，扫描范围50～1500m/z。使用Uniprot(https://www.uniprot.org/)的Juglans regia数据库对质谱结果进行对比分析。

将0～3kDa多肽组分经过液质分析并与Uniprot的Juglans regia数据库对比，共鉴定出氨基酸数量在10个及以下的肽段序列556条。

(3)PyRx肽段虚拟筛选

使用ChemDraw软件绘制氨基酸个数在10个及以下的肽段的3D结构图。从RCSBProtein Data Bank数据库(https://www.rcsb.org)下载弹性蛋白酶三维结构文件作为本发明对接使用的受体，其PDB编号为1ELB。对酶的结构进行加氢预处理，并保存为pdbqt格式。使用PyRx软件将所有肽段设为配体，与弹性蛋白酶受体依次进行对接打分和虚拟筛选，通过对接能大小判断其相互作用力的强弱以筛选肽段。

表2肽段与弹性蛋白酶的对接能排名(前十名)

PyRx软件可以批量化的将受体与不同配体模拟对接，通过对接能判断其相互作用力强弱，达到虚拟筛选的效果。对接能打分代表着受体与配体的结合潜力，较低的得分通常对应着两者之间较强的结合能力。将液质分析后得到的肽段经模拟打分并将对接能排名，结果如表2所示，在得分前十名的肽段中，苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)出现频率较高。肽段FFVPF与酶的对接能最低，为-7.6kcal mol^-1。此结果说明FFVPF可能具有较强的弹性蛋白酶抑制作用，根据其序列Phe-Phe-Val-Pro-Phe进行合成以备后续实验。肽段FFVPF的化学结构图如图1所示，二级质谱图如图2所示。

(4)Autodock Vina分子对接

配体及受体处理：使用ChemDraw软件绘制肽段的3D结构图，并使用AutodockTools1.5.6软件打开多肽和酶(PDB:1ELB)。将多肽作为配体，进行加氢、加电荷处理，检测root、进行可旋转键的搜寻与定义；将酶作为受体，添加所有的氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢，将二者均保存成pdbqt文件。

对接及分析：确定分子对接的坐标和盒子大小，对接运行次数设置为100次。采用Autodock Vina进行半柔性对接，选取对接结合能最佳的构象用于对接结合模式分析，并使用Discovery Studio进行作图。

通过分子半柔性对接研究弹性蛋白酶与短肽FFVPF的作用模式，将多肽对接至酶的活性口袋，二者间结合能为-5.22kcal mol^-1。图3和4展示了酶与多肽结合时产生的相互作用，可以看出多肽嵌入在弹性蛋白酶结构上的凹槽中，并呈现出紧凑的结合模式。

疏水相互作用、氢键、范德华力和静电作用是常见于配体与受体间的相互作用力。如图3所示，短肽FFVPF与弹性蛋白酶之间共存在7个相互作用力，其中形成疏水相互作用力(烷基键和π-烷基键两种)5个，包括在肽段N端的第二个Phe与弹性蛋白酶的氨基酸残基Val224之间键长为

的疏水作用，肽段的Val与His 60之间键长为

的疏水作用，肽段的Pro与Val 103、His60之间键长为

和

的2个疏水作用，以及肽段C端的Phe与Val 103之间键长为

的疏水作用，肽段三个Phe结构上的苯环与受体之间均有作用力存在。此外，肽段N端第二个Phe与弹性蛋白酶残基Gln 200形成了键长为

的氢键，这条氢键键长很短，说明其作用力较强。FFVPF与弹性蛋白酶的结合还在肽段N端第一个Phe和氨基酸残基Cys 229之间形成1条π-硫相互作用，键长为

。这些相互作用使得蛋白与多肽形成稳定的复合物。综上，分子对接模拟构象从分子水平和理论角度阐明了二者的结合模式，FFVPF与弹性蛋白酶之间存在较强的疏水相互作用、氢键和π-硫相互作用，这使其具有弹性蛋白酶抑制活性。

(5)氨基酸组成分析及肽段筛选结果

氨基酸组成是蛋白质和多肽最重要的性质之一。表3是对核桃粕及弹性蛋白酶抑制活性最高的0～3kDa超滤组分的氨基酸成分分析结果。核桃粕中天冬氨酸(10.10％)、谷氨酸(23.52％)和精氨酸(15.63％)含量较高，疏水氨基酸总含量为33.67％。经过超滤后，0～3kDa多肽组分中的天冬氨酸(9.73％)、谷氨酸(17.63％)、亮氨酸(10.26％)、精氨酸(12.48％)含量较高，疏水氨基酸总含量为41.17％。

表3核桃粕和0～3KDa超滤组分的氨基酸组成及含量

与核桃粕原料相比，0～3kDa多肽组分的疏水氨基酸含量有所增加，这说明多肽对弹性蛋白酶抑制能力可能与疏水氨基酸有关。经过超滤后，丝氨酸含量从5.53％增长至6.52％，丙氨酸含量从4.29％增长至6.69％，缬氨酸含量从5.18％增长至6.80％，亮氨酸含量从7.81％增长至10.26％，苯丙氨酸含量从4.65％增长至5.97％，酪氨酸含量从3.14％增长至4.40％。其中，亮氨酸(Leu)在0～3kDa组分中的含量(5.97％)和超滤前后的增加量(1.32％)均为最高，这意味着它可能与多肽抑制弹性蛋白酶的能力有关。曾有研究者报道，甘氨酸(Gly)和亮氨酸残基中的某一个，或者两者都影响着多肽的弹性蛋白酶抑制活性，与本实验结果吻合。

甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)残基与弹性蛋白酶之间的亲和力较高。而且，N端第三位是脯氨酸(Pro)或者C端第一位是亮氨酸(Leu)的肽段可能具有较强的弹性蛋白酶抑制能力。本申请根据氨基酸测序结果结合文献报道，推断肽段NSLNLPIL可能具有较强的弹性蛋白酶抑制能力。该肽段含有5个疏水氨基酸，3个亮氨酸和1个脯氨酸，具有弹性蛋白酶亲和力的氨基酸数量达50％，且其C端第一个位置有亮氨酸，此外它还含有经超滤后含量增加的丝氨酸和异亮氨酸。因此，该肽段可能具有较强的弹性蛋白酶抑制作用，根据其序列Asn-Ser-Leu-Asn-Leu-Pro-Ile-Leu进行合成以备后续实验。肽段NSLNLPIL的化学结构如图5所示，其二级质谱图如图6所示。

实施例3多肽活性验证

(1)肽段人工合成

肽段的合成采用Fmoc固相合成法，根据氨基酸序列合成肽段，经切割、析出、纯化后得到粉末状多肽。合成过程委托南京源肽生物科技有限公司。肽段FFVPF和肽段NSLNLPIL的纯度均大于95％。

(2)人工合成肽段活性验证

根据实施例1中描述的方法测定不同浓度的肽段对弹性蛋白酶的抑制率，根据实验结果拟合计算肽段对弹性蛋白酶的的半抑制浓度(IC₅₀)。肽段FFVPF的IC₅₀值为0.469±0.010mg/mL，NSLNLPIL的IC₅₀值为0.635±0.030，有较好的弹性蛋白酶抑制活性，可以作为具有功能性的生物活性肽开展后续应用。

表4人工合成肽段对弹性蛋白酶的半抑制浓度

注：不同大小写字母表示样品间存在显著性差异(Duncan检验，p＜0.05)

(3)肽段消化稳定性研究

为探究筛选出的肽段在胃肠消化过程中的稳定性，设计体外模拟消化实验，进行两段式胃肠道模拟消化。

模拟胃液：2.0g氯化钠，3.2g胃蛋白酶，7.0mL盐酸，加水溶解至1000mL，将其pH调节至2.0。

模拟肠液：6.8g磷酸二氢钾，0.62g氢氧化钠，10.0g胰酶，加水溶解至1000mL。

胃消化阶段：取10mg肽段与10mL模拟胃液混合，将混合物置于37℃水浴中以170rpm振荡2h。模拟胃消化结束后，吸取部分样品，在90℃水浴中加热10min灭酶，在6000rpm转速下离心15min，收集上清液备用。

肠消化阶段：将剩余的液体与模拟肠液按照1:1(v/v)比例混合，调整pH至7.5，并在上述相同条件下水浴振荡4h。待反应结束后，按上述方法灭酶、离心、收集上清液。将上清液过膜，使用RP-HPLC分析，将峰面积代入标准曲线即可计算肽段浓度及保留量。

多肽在胃肠道中的稳定性是其重要性质之一。通过RP-HPLC对未处理、经过胃液消化、肠液消化后的短肽FFVPF进行定性与定量，探究其模拟消化稳定性。图7(A)为消化前的FFVPF(浓度为1mg/mL)的液相色谱图，可见其出峰时间为10.70min，峰型尖窄且无拖尾。图7(B)为FFVPF经胃液消化2h后的液相色谱图，图中10.70min处的峰面积变小，且在2.50min左右有新的峰产生，说明短肽经过胃消化后部分分解。通过峰面积和标准曲线计算可知，其保留率为87.48±1.24％。图7(C)为FFVPF经胃消化2h及肠消化4h后的液相色谱图，在10.70min左右没有峰产生，且在2.00～4.00min处有响应值较大的峰出现，说明短肽在肠道内全部分解，新出现的峰所对应物质是短肽的分解产物。可见FFVPF在胃环境具有一定的稳定性，但经肠道消化后全部分解。

实施例4负载短肽FFVPF的壳聚糖-三聚磷酸钠(CS-TPP)纳米颗粒

许多蛋白水解物都具有苦涩味，肽段整体疏水性的增加会导致其苦味的增加，此外，对于含有大于等于4个氨基酸的肽段，其苦味会随着N端碱性氨基酸和C端疏水性氨基酸数量的增加而增加。从风味角度分析，短肽FFVPF可能具有苦涩的味道，不利于其应用，因此，可以考虑将其包封在运输体系中，以掩盖不良风味，提升应用可行性。

以下将提供一种负载短肽FFVPF的壳聚糖-三聚磷酸钠(CS-TPP)纳米颗粒：(1)制备方法

采用离子凝胶法制备纳米颗粒。将壳聚糖(CS)溶于1％(v/v)乙酸溶液，配制成1mg/mL溶液，过0.45μm滤膜，并用1mol/L NaOH溶液将其pH调至4.0。将不同质量的短肽FFVPF(2.5mg、5mg、7.5mg、10mg)分别加入10mL壳聚糖溶液中(芯材壁材质量比为1:4、1:2、3:4、1:1)，搅拌20min使其充分溶解。取2mg/mL三聚磷酸钠(TPP)溶液1.25mL滴入短肽-壳聚糖溶液中，并用超声探针处理混合物4min，超声功率为120w，超声时间和间隙均为2s，制得纳米颗粒悬浮液。不加入短肽制得的为空白纳米颗粒悬浮液。使用超滤离心管除去纳米颗粒悬浮液中未包封的物质，并将其冷冻干燥，即得纳米颗粒粉末。(2)包封率(EE)和负载率(EC)测定

将纳米颗粒悬浮液置于截留分子量为0～1kDa的超滤离心管中，在4000rpm转速下离心20min。离心后，未被包封的短肽将会通过超滤膜进入离心管底部，而纳米颗粒留在管的上端。收集管底部液体，用RP-HPLC对未包封的短肽进行浓度测定，短肽包封率(EE)和负载率(EC)的计算公式如下：

结果如图8所示。当短肽添加量为5mg和7.5mg时，包封率达到94.10±0.79％和94.58±0.23％。

(3)粒径

图9总结了短肽FFVPF添加量对CS-TPP纳米颗粒的粒径和多分散指数(PDI)的影响，随着芯材量从2.5mg增加至10mg时，粒径逐渐从175.67±1.36nm减小至146.33±3.59nm。

PDI用于表征体系内粒径的均匀程度，较大的PDI值代表体系内的物质尺寸差别大，粒径分布宽。一般地，PDI小于0.3即可认为体系粒径分布较窄。当FFVPF添加量从0mg增加至10mg时，纳米颗粒的PDI均在0.2～0.25之间。因此，CS-TPP纳米体系粒径小分布窄，适合作为多肽的运载体系。

(4)Zeta电位测定

Zeta电位随短肽FFVPF添加量的变化如图10所示，CS-TPP纳米颗粒均带较强正电荷，且Zeta电位值从+33mV至+36mV不等，均大于30mV，说明体系足够稳定。随着FFVPF添加量增加，Zeta电位呈下降趋势，但统计学分析表明，它们之间并无显著差异，以电势为指标，CS-TPP作为传递功能性物质的胶体体系具有良好的稳定性。

(5)透射电镜(TEM)微观形貌观察

利用透射电镜(TEM)观察负载FFVPF的CS-TPP纳米颗粒的微观形貌，经过制样过程中的染色步骤后，纳米颗粒呈现深色。图11(A)为1000nm比例尺下的悬浮液，可以观察到纳米颗粒呈均匀球形，粒径大多在100～200nm之间，且在体系中分散均匀，与本发明所测出的粒径和PDI相符合。图(B)和(C)分别将比例尺放大至500nm和200nm，视野内颗粒数变少，可见纳米颗粒表面形貌基本光滑，略带尖角。CS与TPP在表面基团的相互作用下发生聚集，形成尺寸恒定的新粒子，并发生重新排列而形成更加致密的结构。

(6)稳定性分析

制备负载短肽的CS-TPP纳米颗粒(短肽添加量5mg，芯材壁材质量比为1:2)悬浮液，对其在不同环境条件下的稳定性进行探究分析。

pH稳定性分析

取新制备样品适量，用1mol/L HCl或1mol/LNaOH调节样品pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，调节pH后静置30min。目测观察样品的外观状态，并以短肽FFVPF在纳米颗粒中的保留率为指标探究其pH稳定性。

使用超滤离心管和RP-HPLC测定游离短肽质量，对照组为制备后未调节pH的纳米颗粒，短肽保留率的计算公式如下：

本发明制备的CS-TPP纳米颗粒的pH为4.20±0.02，其悬浮液略带乳白色，呈半透明，透光度较高且无沉淀。图12为不同pH环境下纳米颗粒中FFVPF的保留率。当pH在4～6时，FFVPF保留率几乎接近100％，纳米颗粒无泄漏稳定性高。当pH调整至7时，保留率下降至77.97±1.15％，同时可以观察到纳米颗粒悬浮液透光度降低并产生絮状沉淀，继续调整pH到8，保留率继续下降，沉淀继续增多。而在pH为2～3的高酸性环境下，纳米颗粒保留率下降至80％左右，但液体可以保持较高的透明度，无沉淀产生。

人体胃液环境pH为2.0左右，肠液环境pH为7.5左右，在此范围内短肽保留率均能达到70％以上。可见，负载FFVPF的CS-TPP纳米颗粒不仅可以适用于pH为4～6的食品体系，还有利于改善FFVPF在胃肠道内的稳定性。

温度稳定性分析

取适量新制备样品置于离心管中，分别置于55℃、65℃、75℃、85℃水浴锅中加热30min，待样品冷却至室温后，测定短肽在纳米颗粒中的保留率。保留率测定及计算方法同上，对照组为加热前的样品。

纳米颗粒在食品加工、储藏过程中可能会经过热处理，研究不同温度下纳米颗粒的稳定性，有利于找到合适的加工方式和储藏条件，延长相关产品货架期。温度对纳米颗粒中FFVPF保留率的影响如图13所示，当纳米颗粒环境温度不高于65℃时，短肽的保留率接近100％，状态很稳定。在75℃和85℃加热30min后，悬浮液体系并无肉眼可见的沉淀，但保留率下降至76.58±1.16％和76.82±0.22％，说明加热过程会使纳米颗粒间碰撞增加，从而导致芯材的泄露。

紫外线光照稳定性分析

取适量新制备样品置于小玻璃瓶中，置于紫外光源下持续照射150min，每隔30min测定短肽在纳米颗粒中的保留率。保留率测定及计算方法同上，对照组为未经紫外线光照处理的样品。

纳米颗粒递送系统是保护功能性物质的有效手段，但在食品贮存和运输过程中，紫外线等环境因素可能会破坏纳米颗粒结构，造成芯材的释放。图14为紫外线照射时间对纳米颗粒中FFVPF的保留率的影响。实验结果表明，随着紫外暴露时间延长，装载在纳米颗粒中的FFVPF保留率不断降低，体系稳定性下降，当紫外照射时间在60min以内时，保留率能够维持在90％以上。当照射时间达到150min时，保留率降低至63.41±1.24％。以上结果表明，若将CS-TPP体系用于食品工业中，该产品需要使用深色包装或避光保存以免功能因子泄露。

(7)体外释放特性探究

利用透析膜法并选用pH 7.4、37℃的水浴环境探究纳米颗粒的释放特性，这是为了模拟其在血液中的芯材释放。制备负载短肽FFVPF的CS-TPP纳米颗粒(短肽添加量5mg)，并将其悬浮液置于透析袋(截留分子量为3500Da)中。将透析袋置于装有50mL PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)的烧杯中，在37℃、100rpm的条件下水浴振荡。每隔一定时间从烧杯中取出1mL样品并注入1mL PBS缓冲液以维持体系体积不变，并使用RP-HPLC测定样品中FFVPF的浓度，释放率计算公式如下：

CS-TPP纳米颗粒的体外释放曲线如图15所示，纳米颗粒在0～120min时出现突释现象，随着时间增加，其释放率增加但释放速度逐渐变慢。此实验采用RP-HPLC测定短肽浓度，说明在包埋和释放过程中，其化学结构未发生变化，因此活性也未发生变化。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (4)

1.一种弹性蛋白酶抑制肽，其特征在于，所述抑制肽自N端到C端的氨基酸序列为：Phe-Phe-Val-Pro-Phe，简称FFVPF；或者，所述抑制肽自N端到C端的氨基酸序列为：Asn-Ser-Leu-Asn-Leu-Pro-Ile-Leu，简称NSLNLPIL。

2.权利要求1所述抑制肽在抑制弹性蛋白酶的非疾病治疗或诊断中的应用。

3.一种包含权利要求1所述抑制肽的纳米颗粒体系包埋短肽，其特征在于，是将抑制肽由壳聚糖和三聚磷酸钠包埋获得。

4.如权利要求3所述的一种包含权利要求1所述抑制肽的纳米颗粒体系包埋短肽，其特征在于，制备方法如下：

(1)将壳聚糖溶于1％的乙酸溶液后，调节pH至4.0得浓度为1mg/mL的壳聚糖溶液；

(2)将短肽与溶液中的壳聚糖按照质量比1-4:4混合搅拌充分溶解，得短肽-壳聚糖溶液；

(3)将浓度为2mg/mL的三聚磷酸钠溶液按体积比1:8比例滴入短肽-壳聚糖溶液中，超声处理后制得纳米颗粒悬浮液。

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