CN114292311A

CN114292311A - 胰脂肪酶抑制肽及其应用

Info

Publication number: CN114292311A
Application number: CN202111585193.8A
Authority: CN
Inventors: 张学武; 万泽民; 赵冰丽
Original assignee: South China University of Technology SCUT; Guangzhou Institute of Modern Industrial Technology
Current assignee: South China University of Technology SCUT; Guangzhou Institute of Modern Industrial Technology
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114292311B

Abstract

本发明公开了胰脂肪酶抑制肽及其应用，所述胰脂肪酶抑制肽的氨基酸序列分别为：Trp‑Asp‑Val‑Ser‑Leu‑Gly‑Pro‑Val‑Leu‑Pro‑Val、Glu‑Trp‑His‑Leu‑Thr‑Glu‑Leu‑Phe、Glu‑Tyr‑Pro‑Gln‑Ser‑Phe‑Leu‑Arg，纯度依次为95.95％、96.23％、95.98％。本发明肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。体外胰脂肪酶的抑制活性检测表明：三条合成肽的50％抑制浓度(IC₅₀)依次为0.4796mM、0.5634mM、0.4948mM。本发明提供三条具有潜在胰脂肪酶抑制活性的合成肽，可应用于生物制药领域。

Description

胰脂肪酶抑制肽及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及三条合成肽及其应用。

背景技术

近几十年来，全球经济水平得以持续快速增长，人们的生活质量也不断提高。但随之而来的还有人们生活节奏的加快——高热量快餐饮食、不健康的生活作息以及运动量的减少，这种生活方式使越来越多的人陷入到肥胖的沼泽中。肥胖不仅影响人们的生活质量，而且还增加了患心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压等等代谢类疾病的风险，时时刻刻威胁着人们的健康。肥胖主要是因为机体能量的摄入与机体能量的消耗之间的不平衡，而导致的脂肪堆积过多。据研究表明，肥胖与消化系统中的酶的活性有着密切的联系。消化系统中存在的脂肪酶在甘油三酯及胆固醇的分解过程中起着关键的作用。而胰脂肪酶可以将其中50％-70％的膳食脂肪分解为甘油和游离脂肪酸，因此，抑制胰脂肪酶的活性便能有效减缓脂肪的吸收以达到减肥的目的。生物活性肽易消化吸收、安全性极高而备受关注，生物活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，例如促进免疫调节、抗肥胖、降血糖、抗癌、抗氧化等生物活性。Fisayo Ajayi F等人从苋菜种子提取蛋白并利用菠萝蛋白酶、糜蛋白酶和肌动酶E进行酶解获得苋菜酶解肽，检测各酶解物对胰脂肪酶的抑制活性发现：各酶解肽的IC₅₀在0.38～2.88mg/mL范围内，随后又对鉴定得到的17条肽与胰脂肪酶(1ETH)进行分子对接，发现17条肽中仅有3条具有潜在的胰脂肪酶抑制活性。然而实验过程中并未对潜在的3条胰脂肪酶抑制肽进行体外活性验证(Fisayo Ajayi F,Mudgil P,Gan C Y,etal.Identification and characterization of cholesterol esterase and lipaseinhibitory peptides from amaranth protein hydrolysates[J].Food Chem X,2021,12:100165.)。

发明内容

本发明选取胰脂肪酶为研究对象，测定合成肽的体外减肥降脂活性作用。本发明的目的是提供胰脂肪酶抑制肽及其应用，本发明中三条具有体外抑制胰脂肪酶活性的合成肽可应用于生物制药领域。

胰脂肪酶抑制肽，所述胰脂肪酶抑制肽包括如下肽中的一种以上：一种十一肽WDVSLGPVLPV，所述十一肽WDVSLGPVLPV的氨基酸序列为Trp-Asp-Val-Ser-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Pro-Val；一种八肽EWHLTELF，所述八肽EWHLTELF的氨基酸序列为Glu-Trp-His-Leu-Thr-Glu-Leu-Phe；一种八肽EYPQSFLR，所述八肽EYPQSFLR的氨基酸序列为Glu-Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Arg。

胰脂肪酶抑制肽的应用，所述胰脂肪酶抑制肽在生物制药中的应用，具体为：十一肽WDVSLGPVLPV、八肽EWHLTELF和八肽EYPQSFLR中的任意一种肽对胰脂肪酶活性的抑制。

进一步地，所述十一肽WDVSLGPVLPV在浓度为1mmol/L时对胰脂肪酶的抑制率为93.53％±0.64％。

进一步地，所述十一肽WDVSLGPVLPV的IC₅₀值为0.4796mM。

进一步地，所述八肽EWHLTELF在浓度为1mmol/L时对胰脂肪酶的抑制率为71.67％±4.68％。

进一步地，所述八肽EWHLTELF的IC₅₀值为0.5634mM。

进一步地，所述八肽EYPQSFLR在浓度为1mmol/L时对胰脂肪酶的抑制率为67.86％±1.37％。

进一步地，所述八肽EYPQSFLR的IC₅₀值为0.4948mM。

进一步地，所述十一肽WDVSLGPVLPV的分子量为1181.37Da；所述八肽EWHLTELF的分子量为1074.18Da；所述八肽EYPQSFLR的分子量为1039.14Da。

进一步地，所述十一肽WDVSLGPVLPV的纯度为95.95％(m/m)；所述八肽EWHLTELF的纯度为96.23％(m/m)；所述八肽EYPQSFLR的纯度为95.98％(m/m)。

本发明所述胰脂肪酶抑制肽的缩写分别为WDVSLGPVLPV、EWHLTELF、EYPQSFLR，分子量依次为1181.37Da、1074.18Da、1039.14Da，纯度依次为95.95％、96.23％、95.98％，序列为：Trp-Asp-Val-Ser-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Pro-Val、Glu-Trp-His-Leu-Thr-Glu-Leu-Phe、Glu-Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Arg。其中，

Trp表示英文名称为Tryptophan，中文名称为色氨酸的氨基酸的相应残基；

Asp表示英文名称为Aspartic acid，中文名称为天冬氨酸的氨基酸的相应残基；

Val表示英文名称为Valine，中文名称为缬氨酸的氨基酸的相应残基；

Ser表示英文名称为Serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基；

Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；

Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基；

Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；

Glu表示英文名称为Glutamic acid，中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应残基；

His表示英文名称为Histidine，中文名称为组氨酸的氨基酸的相应残基；

Thr表示英文名称为Threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基；

Phe表示英文名称为Phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；

Tyr表示英文名称为Tyrosine，中文名称为酪氨酸的氨基酸的相应残基；

Gln表示英文名称为Glutarnine，中文名称为谷氨酰胺的氨基酸的相应残基；

Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基；

本发明所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的肽合成方法。将目标肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。

本发明研究了浓度为0.2-1mmol/L的合成肽WDVSLGPVLPV在25℃下与胰脂肪酶、4-甲基伞形酮油酸酯溶液混匀反应20min后，经酶标仪检测荧光强度并计算抑制率，结果表明其50％抑制浓度(IC₅₀)为0.4796mM，可在制备生物医药领域应用。

本发明研究了浓度为0.0625-1mmol/L的合成肽EWHLTELF在25℃下与胰脂肪酶、4-甲基伞形酮油酸酯溶液混匀反应20min后，经酶标仪检测荧光强度并计算抑制率，结果表明其50％抑制浓度(IC₅₀)为0.5634mM，可在制备生物医药领域应用。

本发明研究了浓度为0.0625-1mmol/L的合成肽EYPQSFLR在25℃下与胰脂肪酶、4-甲基伞形酮油酸酯溶液混匀反应20min后，经酶标仪检测荧光强度并计算抑制率，结果表明其50％抑制浓度(IC₅₀)为0.4948mM，可在制备生物医药或功能食品领域应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明首次合成了十一肽WDVSLGPVLPV、八肽EWHLTELF和八肽EYPQSFLR，并且检测了三条合成肽对胰脂肪酶的抑制活性，所述三条合成肽具有抗肥胖活性。

附图说明

图1为合成十一肽Trp-Asp-Val-Ser-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Pro-Val的HPLC图。

图2为合成十一肽Trp-Asp-Val-Ser-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Pro-Val的MS图。

图3为合成八肽Glu-Trp-His-Leu-Thr-Glu-Leu-Phe的HPLC图。

图4为合成八肽Glu-Trp-His-Leu-Thr-Glu-Leu-Phe的MS图。

图5为合成八肽Glu-Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Arg的HPLC图。

图6为合成八肽Glu-Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Arg的MS图。

图7为阳性药奥利司他(Orlistat)对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。

图8为合成十一肽Trp-Asp-Val-Ser-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Pro-Val对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。

图9为合成八肽Glu-Trp-His-Leu-Thr-Glu-Leu-Phe对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。

图10为合成八肽Glu-Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Arg对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

十一肽WDVSLGPVLPV的固相合成

选用高分子树脂(南京源肽生物有限公司)，按照氨基酸序列Trp-Asp-Val-Ser-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Pro-Val的特征，先将Val的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Val的氨基和Pro的羧基缩水反应，处理后，再添加Leu，Leu的氨基和Val的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Trp氨基酸后，再切除树脂即得到目标十一肽WDVSLGPVLPV。采用高效液相色谱(HPLC)进行纯化，色谱柱型号为Sinochrom ODS-BP 5，尺寸4.6*250mm，流动相A:含有0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；流动相B:含有0.1％(v/v)三氟乙酸TFA水溶液；25min内A相由23％(v/v)上升到48％(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品十一肽WDVSLGPVLPV，要求纯度达到95％(m/m)以上，并经质谱仪(MS)鉴定结构(如图1-2所示)。

图1为合成十一肽WDVSLGPVLPV的HPLC图，由图1可知，合成十一肽WDVSLGPVLPV的保留时间为13.295min。图2为合成十一肽WDVSLGPVLPV的MS图，由图2可知，合成的肽为十一肽WDVSLGPVLPV。

八肽EWHLTELF的固相合成

选用高分子树脂(南京源肽生物有限公司)，按照氨基酸序列Glu-Trp-His-Leu-Thr-Glu-Leu-Phe的特征，先将Phe的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Phe的氨基和Leu的羧基缩水反应，处理后，再添加Glu，Glu的氨基和Thr的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Glu氨基酸后，再切除树脂即得到目标八肽EWHLTELF。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为Sinochrom ODS-BP 5μm，尺寸4.6*250mm，流动相A:含有0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；流动相B:含有0.1％(v/v)三氟乙酸TFA水溶液；25min内A相由32％(v/v)上升到57％(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品八肽EWHLTELF，要求纯度达到95％(m/m)以上，并经MS鉴定结构(如图3-4所示)。

图3为合成八肽EWHLTELF的HPLC图，由图3可知，合成八肽EWHLTELF的保留时间为13.272min。图4为合成八肽EWHLTELF的MS图，由图4可知，合成的肽为八肽EWHLTELF。

八肽EYPQSFLR的固相合成

选用高分子树脂(南京源肽生物有限公司)，按照氨基酸序列Glu-Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Arg的特征，先将Arg的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Arg的氨基和Leu的羧基缩水反应，处理后，再添加Phe，Phe的氨基和Ser的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Glu氨基酸后，再切除树脂即得到目标八肽EYPQSFLR。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为Sinochrom ODS-BP 5，尺寸4.6*250mm，流动相A:含有0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；流动相B:含有0.1％(v/v)三氟乙酸TFA水溶液；25min内A相由20％(v/v)上升到45％(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品八肽EYPQSFLR，要求纯度达到95％(m/m)以上，并经MS鉴定结构(如图5-6所示)。

图5为合成八肽EWHLTELF的HPLC图，由图5可知，合成八肽EWHLTELF的保留时间为11.620min。图6为合成八肽EWHLTELF的MS图，由图6可知，合成的肽为八肽EWHLTELF。

合成肽对胰脂肪酶的体外抑制活性

1试剂的配制

1)0.026mol/LpH＝8.0Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲液：准确称取1.575g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于400mL超纯水中,加入4.383g氯化钠，72.15mg氯化钙，搅拌溶解，用浓盐酸调节pH＝8.0，最后用蒸馏水定容至500mL。

2)40μg/mL胰脂肪酶溶液：称取10mg胰脂肪酶，溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，4℃，4000rpm离心5分钟，量取20μL上清液稀释至5mL。

3)100μM 4-甲基伞形酮油酸酯(4-MUO)溶液：用DMSO溶液将底物配置成0.1M,充分溶解后，取10μL加入到9990μL蒸馏水中。

2.实验过程

向96孔黑板中加入25μL浓度为0.2-1mmol/L的十一肽WDVSLGPVLPV溶液或0.0625-1mmol/L的八肽EWHLTELF溶液或0.0625-1mmol/L的八肽EYPQSFLR溶液，随后依次加入25μL胰脂肪酶溶液和50μL4-甲基伞形酮油酸酯溶液，25℃避光孵育20min后，加入100μL柠檬酸钠溶液(0.1M PH＝4.2)以终止反应，反应结束后在激发波长320nm，发射波长450nm下测其荧光强度值记为FLU_肽，以Tris-HCl缓冲液代替多肽溶液作为阴性对照，记为FLU_对照，以奥利司他(Orlistat)代替多肽作为阳性对照。用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶溶液作为背景，其中多肽组的背景记为FLU_肽背景值；阴性对照组的背景记为FLU_{对照背景值}。

实施例1

向96孔黑板中加入25μL浓度为0.8mmol/L的十一肽WDVSLGPVLPV溶液，随后依次加入25μL胰脂肪酶溶液和50μL 4-甲基伞形酮油酸酯溶液，25℃避光孵育20min后，加入100μL柠檬酸钠溶液(0.1M PH＝4.2)以终止反应，以Tris-HCl缓冲液代替十一肽WDVSLGPVLPV溶液作为阴性对照，以奥利司他(Orlistat)代替十一肽WDVSLGPVLPV作为阳性对照。用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶溶液作为背景。反应结束后记录其在激发波长320nm，发射波长450nm下的荧光强度值并计算胰脂肪酶抑制率。

图8为合成十一肽Trp-Asp-Val-Ser-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Pro-Val对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。由图8可知0.8mmol/L的十一肽WDVSLGPVLPV对胰脂肪酶的抑制率为81.60％±1.44％。

实施例2

向96孔黑板中加入25μL浓度为1mmol/L的十一肽WDVSLGPVLPV溶液，随后依次加入25μL胰脂肪酶溶液和50μL 4-甲基伞形酮油酸酯溶液，25℃避光孵育20min后，加入100μL柠檬酸钠溶液(0.1M PH＝4.2)以终止反应，以Tris-HCl缓冲液代替十一肽WDVSLGPVLPV溶液作为阴性对照，以奥利司他(Orlistat)代替十一肽WDVSLGPVLPV作为阳性对照。用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶溶液作为背景。反应结束后记录其在激发波长320nm，发射波长450nm下的荧光强度值并计算胰脂肪酶抑制率。

图8为合成十一肽Trp-Asp-Val-Ser-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Pro-Val对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。由图8可知1mmol/L的十一肽WDVSLGPVLPV对胰脂肪酶的抑制率为93.53％±0.64％。

实施例3

向96孔黑板中加入25μL浓度为0.2-1mmol/L的十一肽WDVSLGPVLPV溶液，随后依次加入25μL胰脂肪酶溶液和50μL 4-甲基伞形酮油酸酯溶液，25℃避光孵育20min后，加入100μL柠檬酸钠溶液(0.1M PH＝4.2)以终止反应，以Tris-HCl缓冲液代替十一肽WDVSLGPVLPV溶液作为阴性对照，以奥利司他(Orlistat)代替十一肽WDVSLGPVLPV作为阳性对照。用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶溶液作为背景。反应结束后记录其在激发波长320nm，发射波长450nm下的荧光强度值并计算胰脂肪酶抑制率,采用Origin8.0软件中的Logistic函数做非线性拟合，求得其IC₅₀值。

图8为合成十一肽Trp-Asp-Val-Ser-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Pro-Val对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。由图8可知十一肽WDVSLGPVLPV抑制胰脂肪酶活性的IC₅₀值为0.4796mM。

实施例4

向96孔黑板中加入25μL浓度为0.5mM的八肽EWHLTELF溶液，随后依次加入25μL胰脂肪酶溶液和50μL4-甲基伞形酮油酸酯溶液，25℃避光孵育20min后，加入100μL柠檬酸钠溶液(0.1M pH＝4.2)以终止反应，以Tris-HCl缓冲液代替八肽EWHLTELF溶液作为阴性对照，以奥利司他(Orlistat)代替八肽EWHLTELF作为阳性对照。用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶溶液作为背景。反应结束后记录其在激发波长320nm，发射波长450nm下的荧光强度值并计算胰脂肪酶抑制率。

图9为合成八肽Glu-Trp-His-Leu-Thr-Glu-Leu-Phe对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。由图9可知0.5mM的八肽EWHLTELF对胰脂肪酶的抑制率为44.73％±3.13％。

实施例5

向96孔黑板中加入25μL浓度为1mM的八肽EWHLTELF溶液，随后依次加入25μL胰脂肪酶溶液和50μL4-甲基伞形酮油酸酯溶液，25℃避光孵育20min后，加入100μL柠檬酸钠溶液(0.1M PH＝4.2)以终止反应，以Tris-HCl缓冲液代替八肽EWHLTELF溶液作为阴性对照，以奥利司他(Orlistat)代替八肽EWHLTELF作为阳性对照。用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶溶液作为背景。反应结束后记录其在激发波长320nm，发射波长450nm下的荧光强度值并计算胰脂肪酶抑制率。

图9为合成八肽Glu-Trp-His-Leu-Thr-Glu-Leu-Phe对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。由图9可知1mM的八肽EWHLTELF对胰脂肪酶的抑制率为71.67％±4.68％。

实施例6

向96孔黑板中加入25μL浓度为0.0625-1mmol/L的八肽EWHLTELF溶液，随后依次加入25μL胰脂肪酶溶液和50μL 4-甲基伞形酮油酸酯溶液，25℃避光孵育20min后，加入100μL柠檬酸钠溶液(0.1M PH＝4.2)以终止反应，以Tris-HCl缓冲液代替八肽EWHLTELF溶液作为阴性对照，以奥利司他(Orlistat)代替八肽EWHLTELF作为阳性对照。用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶溶液作为背景。反应结束后记录其在激发波长320nm，发射波长450nm下的荧光强度值并计算胰脂肪酶抑制率，采用Origin8.0软件中的Logistic函数做非线性拟合，求得其IC₅₀值。

图9为合成八肽Glu-Trp-His-Leu-Thr-Glu-Leu-Phe对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。由图9可知八肽EWHLTELF抑制胰脂肪酶活性的IC₅₀值为0.5634mM。

实施例7

向96孔黑板中加入25μL浓度为0.5mM的八肽EYPQSFLR溶液，随后依次加入25μL胰脂肪酶溶液和50μL4-甲基伞形酮油酸酯溶液，25℃避光孵育20min后，加入100μL柠檬酸钠溶液(0.1M PH＝4.2)以终止反应，以Tris-HCl缓冲液代替八肽EYPQSFLR溶液作为阴性对照，以奥利司他(Orlistat)代替八肽EYPQSFLR作为阳性对照。用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶溶液作为背景。反应结束后记录其在激发波长320nm，发射波长450nm下的荧光强度值并计算胰脂肪酶抑制率。

图10为合成八肽Glu-Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Arg对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。由图10可知0.5mM的八肽EYPQSFLR对胰脂肪酶的抑制率为50.58％±2.11％。

实施例8

向96孔黑板中加入25μL浓度为1mM的八肽EYPQSFLR溶液，随后依次加入25μL胰脂肪酶溶液和50μL4-甲基伞形酮油酸酯溶液，25℃避光孵育20min后，加入100μL柠檬酸钠溶液(0.1M PH＝4.2)以终止反应，以Tris-HCl缓冲液代替八肽EYPQSFLR溶液作为阴性对照，以奥利司他(Orlistat)代替八肽EYPQSFLR作为阳性对照。用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶溶液作为背景。反应结束后记录其在激发波长320nm，发射波长450nm下的荧光强度值并计算胰脂肪酶抑制率。

图10为合成八肽Glu-Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Arg对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。。由图10可知1mM的八肽EYPQSFLR对胰脂肪酶的抑制率为67.86％±1.37％。

实施例9

向96孔黑板中加入25μL浓度为0.25mM的八肽EYPQSFLR溶液，随后依次加入25μL胰脂肪酶溶液和50μL4-甲基伞形酮油酸酯溶液，25℃避光孵育20min后，加入100μL柠檬酸钠溶液(0.1M PH＝4.2)以终止反应，以Tris-HCl缓冲液代替八肽EYPQSFLR溶液作为阴性对照，以奥利司他(Orlistat)代替八肽EYPQSFLR作为阳性对照。用Tris-HCl缓冲液代替胰脂肪酶溶液作为背景。反应结束后记录其在激发波长320nm，发射波长450nm下的荧光强度值并计算胰脂肪酶抑制率，采用Origin8.0软件中的Logistic函数做非线性拟合，求得其IC₅₀值。

图10为合成八肽Glu-Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Arg对胰脂肪酶的抑制活性拟合曲线图。由图10可知八肽EYPQSFLR抑制胰脂肪酶活性的IC₅₀值为0.4948mM。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 胰脂肪酶抑制肽及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 千两茶(Camellia sinensis L)

<400> 1

Trp Asp Val Ser Leu Gly Pro Val Leu Pro Val

1 5 10

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 千两茶(Camellia sinensis L)

<400> 2

Glu Trp His Leu Thr Glu Leu Phe

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 黑砖茶( Camellia sinensis L)

<400> 3

Glu Tyr Pro Gln Ser Phe Leu Arg

1 5

Claims

1.胰脂肪酶抑制肽，其特征在于，所述胰脂肪酶抑制肽包括如下肽中的一种以上：一种十一肽WDVSLGPVLPV，所述十一肽WDVSLGPVLPV的氨基酸序列为Trp-Asp-Val-Ser-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Pro-Val；一种八肽EWHLTELF，所述八肽EWHLTELF的氨基酸序列为Glu-Trp-His-Leu-Thr-Glu-Leu-Phe；一种八肽EYPQSFLR，所述八肽EYPQSFLR的氨基酸序列为Glu-Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Arg。

2.权利要求1所述胰脂肪酶抑制肽的应用，其特征在于，所述胰脂肪酶抑制肽在生物制药中的应用，具体为：十一肽WDVSLGPVLPV、八肽EWHLTELF和八肽EYPQSFLR中的任意一种肽对胰脂肪酶活性的抑制。

3.根据权利要求2所述的胰脂肪酶抑制肽的应用，其特征在于，所述十一肽WDVSLGPVLPV在浓度为1mmol/L时对胰脂肪酶的抑制率为93.53％±0.64％。

4.根据权利要求2所述的胰脂肪酶抑制肽的应用，其特征在于，所述十一肽WDVSLGPVLPV的IC₅₀值为0.4796mM。

5.根据权利要求2所述的胰脂肪酶抑制肽的应用，其特征在于，所述八肽EWHLTELF在浓度为1mmol/L时对胰脂肪酶的抑制率为71.67％±4.68％。

6.根据权利要求2所述的胰脂肪酶抑制肽的应用，其特征在于，所述八肽EWHLTELF的IC₅₀值为0.5634mM。

7.根据权利要求2所述的胰脂肪酶抑制肽的应用，其特征在于，所述八肽EYPQSFLR在浓度为1mmol/L时对胰脂肪酶的抑制率为67.86％±1.37％。

8.根据权利要求2所述的胰脂肪酶抑制肽的应用，其特征在于，所述八肽EYPQSFLR的IC₅₀值为0.4948mM。

9.根据权利要求2所述的胰脂肪酶抑制肽的应用，其特征在于，所述十一肽WDVSLGPVLPV的分子量为1181.37Da；所述八肽EWHLTELF的分子量为1074.18Da；所述八肽EYPQSFLR的分子量为1039.14Da。

10.根据权利要求2-9任一项所述的胰脂肪酶抑制肽的应用，其特征在于，所述十一肽WDVSLGPVLPV的纯度为95.95％；所述八肽EWHLTELF的纯度为96.23％；所述八肽EYPQSFLR的纯度为95.98％。