CN100429229C - 敬钊毒素-v - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种敬钊毒素-V它的一级化学结构由29个氨基酸残基组成。该毒素的理化性状为纯化冻干样品为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明；对河豚毒素不敏感型以及敏感型钠离子通道的半数最大抑制浓度分别为27.6nmol/L和30.23nmol/L，是一种很强的趋向于抑制河豚毒素不敏感型钠通道的抑制剂。

Description

敬钊毒素-V

技术领域

本发明涉及一种用作河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂的敬钊毒素-V。

背景技术

生物毒素是一种重要的生命现象，是生物界在亿万年进化过程中为了生存而形成的，是一个巨大的潜在发现新的生物活性分子的重要资源。目前国际上已经成功筛选到一些生物毒素分子用于治疗某些相关疾病或作为新型药物的设计参考。最近疼痛治疗的重大突破是发现了新的河豚毒素不敏感型钠通道亚型Nav1.8。实验显示抑制该通道亚型能够产生镇痛效果却没有类似目前临床镇痛药物的毒副作用，Nav1.8为治疗神经性和炎症性疼痛提供了一个高效专一的分子靶标，该通道的高效专一性抑制剂非常有希望开发成为下一代镇痛新药。因此如何获得高效的Nav1.8抑制剂将是世界各大制约公司、科研院所的研究焦点与追逐目标。

发明内容

本发明旨在提供一种作为高效河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂的敬钊毒素-V。

本发明提供的这种敬钊毒素-V(JZTX-V)，其氨基酸序列如下：

Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Lys Arg Ala Cys

1                5                   10                  15

Cys Glu Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile

                20                  25

本发明敬钊毒素-V的理化性状为纯化冻干样品为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明；对河豚毒素不敏感型以及敏感型钠离子通道的半数最大抑制浓度分别为27.6nmol/L和30.23nmol/L，因此是一种很强的趋向于抑制河豚毒素不敏感型钠通道的抑制剂。JZTX-V不但可以从蜘蛛毒液中提取，还可以通过多肽化学合成再经氧化还原复性的途径获得，从JZTX-V的一级化学结构来看它的氨基酸残基很少，非常有利于大规模的工业生产和降低生产成本，可以该分子为模板，通过分子设计与蛋白质工程改造，将该分子对Kv4.2钾通道与TTX-S型钠离子通道的关键残基突变成丙氨酸，从而得到更加高效专一的TTX-R型钠通道抑制剂。而已有的科学研究发现TTX-R型钠通道抑制剂具有很好的镇痛活性而且毒副作用极小。因此本发明为日后大量生产这种镇痛药提供了可靠保障。

附图说明

图1是敬钊毒素-V(JZTX-V)的分离纯化图谱。图1中的A是粗毒的阳离子交换层析图谱，“*”表示目的峰；图1中的B是目的峰的反相高效液相色谱图，“→”表示目的峰。

图2是JZTX-V的质谱鉴定图谱。

图3是JZTX-V的一级化学结构。

图4是JZTX-V的全长cDNA序列克隆。

图5是JZTX-V的三维模建结构。图中感兴趣的碱性氨基酸用蓝色标记，酸性氨基酸用红色标记，疏水性氨基酸用紫色标记。

图6-1JZTX-V对成年鼠DRG细胞上钠通道的影响。图6-1中的A反映的是JZTX-V对TTX-R和TTX-S型钠电流的影响；图6-1中的C、D分别是JZTX-V抑制TTX-R和TTX-S型钠电流的浓效曲线。

图6-2JZTX-V对DRG细胞钠通道激活与失活动力学特征的影响。其中图6-2中的A反映的是JZTX-V对TTX-R型钠电导激活与失活曲线的影响，图6-2中的B反映的是JZTX-V对TTX-S型钠电导激活与失活曲线的影响。有三角形的曲线代表激活曲线，有圆圈的曲线代表失活曲线。

图7是JZTX-V对爪蟾卵母细胞上表达的电压门控钾通道Kv4.2的影响。图7中A显示10μMJZTX-V能够完全抑制Kv4.2钾通道；图7中B是JZTX-V抑制Kv4.2钾通道的浓效曲线；图7中C是JZTX-V对Kv4.2钾通道稳态失活动力学特征的影响。

图8是JZTX-V与磷脂膜的结合活性测定。图中A～C是JZTX-V在超离心上清中的反相HPLC图谱。图8中的A反映的是未加脂质体；图8中的B反映的是加入带由75％POPE/25％POPG制备的脂质体；图8中的C反映的是加入由100％POPC制备的脂质体。

图9是JZTX-V与磷脂膜相互作用的荧光活性测定。图9中的A是加入(虚线)和未加(实线)由75％POPE/25％POPG制备脂质体JZTX-V的荧光谱；图9中的B是存在75％POPE/25％POPG或100％POPC脂质体时JZTX-V的红移激发漂移曲线；图9中的C是丙烯酰胺对加入脂质体后JZTX-V分子上色氨酸荧光淬灭作用的Stern-Volmer图谱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作详细说明

敬钊毒素-V(JZTX-V)可通过从敬钊缨毛蛛粗毒中提取，具体操作如下：

(1)毒液的采集：

用一个固定在铁架台上，内径3cm、高5cm的塑料杯作为毒液接收器，持大镊子从侧面夹住蜘蛛的腹部，让蜘蛛张开螯爪伸入杯中，然后用5～10V的脉冲电流刺激两螯肢基部外侧3～5s。蜘蛛感受电刺激后，即用触肢紧紧抱住杯壁，同时将螯爪有力刺向杯内壁并射出毒液。毒液用微量注射器抽取收集后，放入-40℃冷冻干燥机中经真空冷冻干燥成白色或浅黄色粉末即为粗毒。

(2)分离纯化：

根据蛋白质的带电荷性质和蛋白质的疏水性，结合阳离子交换和反相HPLC色谱法进行两次分离。将15mg敬钊缨毛蛛粗毒用2mL双蒸水(ddH₂O)溶解，14000转/分钟离心10分钟后弃去沉淀，取上清液进样到事先用0.1M磷酸盐缓冲液平衡好的Water Protein Pak CM 8HR阳离子交换柱(5毫米×50毫米)中，用0-50％氯化钠线性梯度洗脱，时间为60分钟，流速为3mL/min。收集最后一个峰进一步反相HPLC纯化(见图1中的A)。用C18反相分析柱在60min内以10-55％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)线性梯度洗脱，收集目的峰进一步反相HPLC，得到单一目的峰(见图1的B)，质谱仪检测为单一组分并测得准确分子量为3605.73Da(见图2)。样品经冷冻干燥成白色粉末，纯度可达99％以上。该毒素的理化性状为纯化冻干样品为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。敬钊毒素-V经491-A测序仪准确得到该毒素N-端28个氨基酸的序列(见图3)。由于该毒素C-末端的疏水性氨基酸残基在测序过程中容易被有机溶剂洗脱，因此第29个残基的测序得不到信号。但是根据该毒素的质谱测定分子量与N-端28个氨基酸残基的理论分子量推测第29位的氨基酸残基可能是一个异亮氨酸(Ile)或亮氨酸(Leu)，为了作出正确的判断，以下通过获得敬钊毒素-V全长cDNA序列使敬钊毒素-V的氨基酸序列得到了确定。

(3)敬钊毒素-V全长cDNA序列的获得

①3′RACE：

首先从敬钊缨毛蛛毒腺中快速抽提总RNA，反转录总RNA得到总cDNA。根据已知敬钊毒素-V的氨基酸序列设计基因特异性简并引物p1-a：5′-TA(T/C)TG(T/C)CA(G/A)AA(G/A)TGG ATG TGG-3′和p1-b：5′-AA(G/A)TGG ATG TGGAC(G/A/C/T)TG(T/C)GG-3′。用基因特异性引物和AUAP与少量cDNA链进行PCR扩增得到大小在300bp左右的一段cDNA链，纯化后克隆入pGEM Teasy载体(购自Promega公司)，进行测序。

②5′RACE

根据已得到的3′RACE测序结果设计并合成5′RACE的反义引物p2-a：5′-TCAATG CAA AAT TGC TTC AG-3′和p2-b：5′-ACG TAA GCC TTC GCA GCA TGC-3′。用基因特异性引物和巢氏引物做PCR扩增，产物纯化后克隆入pGEM Teasy载体(购自Promega公司)进行测序。

③全长cDNA

将3′RACE和5′RACE测序结果进行拼接，得到敬钊毒素-V的全长cDNA序列：

gggggggggg ggggggggac tcagttctta ctgaaacact ggtgctgctc

ccgaaaagaa 60

taattggtga cttgaaactc cagtaggaag atg aag gct tca gtt ttc gct gtc

ata ttg 120

                       Met Lys Ala Ser Val Phe Ala Val Ile Leu

                            -53           -50

gga ttg gtt gtg ttg tgc gcc tgt tcc ttt gct gaa gat gaa caa gat caa

ttt gtt tca 180

Gly Leu Val Val Leu Cys Ala Cys Ser Phe Ala Glu Asp Glu Gln Asp Gln Phe

Val Ser

              -40                                               -30

cct aat gaa ctg cta aaa tca atg ttt gtg gag agt aga cat gaa ttc act cct

gaa gtg 240

Pro Asn Glu Leu Leu Lys Ser Met Phe Val Glu Ser Arg His Glu Phe Thr Pro

Glu Val

               -20                                           -10

gaa gga aga tat tgc caa aaa tgg atg tgg acc tgt gat tca aaa aga gca

tgc tgc gaa 300

Glu Gly Arg Tyr Cys  Gln Lys Trp Met Trp Thr  Cys Asp Ser Lys Arg Ala

Cys Cys Glu

       -1    1                                            10

ggc tta cgt tgc aaa ctg tgg tgc aga aag ata ata gga taa 342

Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile Gly End

      20                             30

ttccgaatta atataccatt ctgaagcaat tttgcattga aattatagtt

gtgtaaatcc 402

gagaaatgg aatatgtgat atttcccttt gtttaggggt attaaaagaa

atcgaaataa 462

agtgtattca tcttgaaaaa aaaaaaaaaa  aaaa

496

从该序列可以看出它包括3′非翻译序列、5′非翻译序列、编码分子前体的阅读框、一个成熟的毒素序列和一个插入的pro序列(见图4)。将JZTX-V的氨基酸序列与该毒素的全长cDNA序列及其翻译后氨基酸序列进行比较发现，JZTX-V第30位的甘氨酸在成熟肽中已经被切除，显示该毒素的C-末端发生了酰氨化，同时也证实该毒素第29位的氨基酸残基是一个异亮氨酸残基。

(4)JZTX-V化学合成与氧化还原复性。

根据JZTX-V的氨基酸序列，在PS3固相多肽合成仪上，采用Fmoc-氨基酸和HBTU的偶联方法合成线性JZTX-V。合成的多肽粗品采用反相HPLC进行初步纯化，通过质谱分析确定目的峰，并进行第二次反相HPLC纯化，样品经冷冻干燥后在0.1M的Tris-HCl(pH＝7.5)，1.0mM/0.1mM GSH/GSSG条件下进行氧化还原复性24小时，复性产物经HPLC纯化和MALDI-TOF质谱分析显示其测定质量值与理论值相一致，复性产物与天然JZTX-V进行HPLC共洗脱呈现一个单峰，进一步的电生理活性测定证实通过化学合成得到的JZTX-V具有与天然毒素同样强的离子通道抑制活性。采用化学合成结合氧化还原复性的方法可以成功大量得到JZTX-V。

为了揭示该毒素分子的作用，我们利用膜片钳和电压钳技术测定了JZTX-V对电压门控钠、钾离子通道的抑制活性，利用脂质体离心共沉淀以及固有色氨酸荧光测定了该毒素对磷脂膜的结合活性。实验结果表明JZTX-V是一种高效的河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂。

1.主要材料和仪器

全细胞膜片钳系统采用德国HEKA公司的EPC-9放大器记录系统，倒置显微镜是日本的Olympus IX70；双极杆电压钳放大器为Turbo-Tec 03X。单层小脂质体采用宁波新芝科器研究所生产的超声波细胞粉碎机超声制备，荧光分光光度计为日立F-4500，合成仪为美国安莱公司的PS3多肽合成仪。

2.实验方法和结果

2.1JZTX-V的同源结构模建

根据同源毒素PaTx1的三维溶液结构，我们在InsightII软件上模建了JZTX-V的三维结构，发现JZTX-V的结构特征是有一个由三个芳香族氨基酸残基和二个脂肪族氨基酸残基组成的较大疏水斑片，并被一些带电荷的氨基酸残基环绕(见图5)。

2.2敬钊毒素-V对电压门控钠通道的抑制活性

50nM敬钊毒素-V对成年大鼠背根神经节DRG细胞上的河豚毒素不敏感型和河豚毒素敏感型钠电流都有明显的抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖性(见图6-1中的A和B)。敬钊毒素-V对河豚毒素不敏感型和河豚毒素敏感型钠电流的半数最大抑制浓度分别为27.6nmol/L和30.23nmol/L(见图6-1中C)。

2.3敬钊毒素-V对钠通道激活与失活动力学的影响

实验显示50nM JZTX-V能够导致河豚毒素不敏感型和河豚毒素敏感型钠电导的半数最大激活电势分别往去极化方向飘移约4.1mV和6.6mV(见图6-2中的A和B)，能够导致河豚毒素不敏感型和敏感型钠电导的半数最大稳态失活电势分别往超极化方向飘移约6.7mV和5.5mV(见图6-2中的C和D)。

2.4敬钊毒素-V对Kv4.2钾通道的影响

实验显示10μMM的JZTX-V也能够完全抑制爪蟾卵母细胞上表达的Kv4.2钾电流，这种抑制呈剂量依赖性，其半数最大抑制浓度(IC₅₀)是604.2±9.3nM(见图7)。JZTX-V对Kv4.2钾电流的抑制也会引起其电流电压曲线往去极化方向漂移。然而10μM JZTX-V爪蟾卵母细胞上表达对Kv1.2、Kv1.3和Kv1.4钾电流没有任何影响。

2.5敬钊毒素-V与脂质体的结合活性测定

图8中的A是在没有单层脂质体存在的条件下，超离心上清中JZTX-V的高效液相色谱图，而当单层小脂质体(75％POPE/25％POPG)与含有JZTX-V的缓冲溶液混合后，通过超速离心沉降，发现几乎所有的JZTX-V都能从离心上清中被删除(见图8中的B)。实验显示JZTX-V与磷脂膜的结合需要带负电荷的磷脂，因为当JZTX-V与由中性磷脂(100％POPC)制备的脂质体混合并且离心沉降时，只有极少量的毒素肽能从离心上清中被删除(见图8中的C)。

2.6敬钊毒素-V的荧光活性测定

在JZTX-V的溶液中加入由75％POPE/25％POPG制备的单层脂质体后，其荧光谱的最大发射波长经历了5.7nm的蓝移，而荧光强度出现明显增强(见图9的A)。当加入由75％POPE/25％POPG制备的脂质体，JZTX-V的最大发射波长发生了5.7nm的红移激发漂移。而加入100％POPC的中性脂质体时，JZTX-V的红移激发漂移只有2.7nm(见图9的B)。红移激发漂移实验结果显示，当有带负电荷的磷脂膜存在时，JZTX-V分子上的色氨酸残基处在一个运动限制的环境中。丙稀酰胺荧光淬灭实验显示伴随着丙稀酰胺的加入，JZTX-V的荧光强度会以浓度依赖的方式进行衰减(见图9的C)，证实JZTX-V与带负电荷的脂质体的相互作用会引起JZTX-V分子疏水面上的色氨酸残基与水溶液的接触减少。

湖南师大敬钊毒素.txt

序列表

<110>湖南师范大学

<120>敬钊毒素-V

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>29

<212>PRT

<213>敬钊缨毛蜘蛛

<400>1

Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Lys Arg Ala Cys

1               5                    10                  15

Cys Glu Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile

                20                  25

<210>2

<211>496

<212>cDNA

<213>敬钊缨毛蜘蛛

<400>2

gggggggggg ggggggggac tcagttctta ctgaaacact ggtgctgctc

ccgaaaagaa    60

taattggtga cttgaaactc cagtaggaag atg aag gct tca gtt ttc gct

gtc ata ttg    120               Met Lys Ala Ser Val Phe Ala

Val Ile Leu

gga ttg gtt gtg ttg tgc gcc tgt tcc ttt gct gaa gat gaa caa

                     湖南师大敬钊毒素.txt

gat caa ttt gtt tca     180

Gly Leu Val Val Leu Cys Ala Cys Ser Phe Ala Glu Asp Glu Gln

Asp Gln Phe Val Set

cctaatgaa ctg cta aaa tca atg ttt gtg gag agt aga cat gaa

ttc act cct gaa gtg   240

Pro Asn Glu Leu Leu Lys Ser Met Phe Val Glu Ser Arg His Glu

Pho Thr Pro Glu Val

gaa gga aga tat tgc caa aaa tgg atg tgg acc tgt gat tca aaa

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Glu Gly Arg Tur Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr cys Asp Ser Lys

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Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile Gly End

ttctgaagca attttgcatt gaaattatag ttgtgtaaat ccgagaaatg

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catcttgaaa    480

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      496

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>敬钊缨毛蜘蛛

<400>3

taytgycara artggatgtg g

      21

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>敬钊毒素-V

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

                   湖南师大  敬钊毒素.txt

<223>n is a，c，g，or t

<400>4

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     20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>敬钊毒素-V

<400>5

tcaatgcaaa attgcttcag

     20

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>敬钊毒素-V

<400>6

acgtaagcct tcgcagcatg c

    21

Claims (1)

1、一种敬钊毒素-V，其氨基酸序列如下：

Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Lys Arg Ala Cys

Cys Glu Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg LysIl eIle。

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