KR102103715B1

KR102103715B1 - 합성 PnTx(19) 펩타이드, 약학 조성물 및 용도

Info

Publication number: KR102103715B1
Application number: KR1020157006585A
Authority: KR
Inventors: 마리아 엘레나 데 리마 페레즈 가르시아; 카로리나 누네스 다 실바; 플라비아 데 마르코 알메이다; 로산젤라 다 실바 로메오; 파울로 셀지오 라셀다 베이라오; 페르난다 실바 토레스; 안드리아노 몬테이로 데 카스트로 피멘타
Original assignee: 유니버시다드 페드럴 데 미나스 게라이스-유에프엠지
Priority date: 2012-08-20
Filing date: 2013-08-20
Publication date: 2020-04-23
Also published as: WO2014028997A1; JP2015535808A; JP6430938B2; US9279004B2; MX362058B; PT2899198T; EP2899198B1; EP2899198A4; KR20150084766A; CL2015000415A1; US20150218233A1; MX2015002279A; EP2899198A1

Abstract

본 발명은 포뉴트리아 니그리벤터(Phoneutria nigriventer) 거미의 천연 독소 PnTx2-6의 서열로부터 구성된, PnTx(19)라 칭하는 19 아미노산의 합성 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기와 같은 펩타이드를 함유하는 약학 조성물 및 발기 부전의 치료 및/또는 발기 기능의 강화에 있어서 그의 용도에 관한 것이다.

Description

합성 PnTx(19) 펩타이드, 약학 조성물 및 용도{SYNTHETIC PnTx19) PEPTIDE, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND USE}

본 발명은 포뉴트리아 니그리벤터(Phoneutria nigriventer) 거미의 천연 독소 PnTx2-6의 서열로부터 구성된, PnTx(19)라 칭하는 19 아미노산의 합성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기와 같은 펩타이드를 함유하는 약학 조성물 및 발기 부전의 치료 및/또는 발기 기능의 강화에 있어서 그의 용도에 관한 것이다.

상기 포뉴트리아 니그리벤터 거미(일반적으로 "아란하 알마데이라(aranha armadeira)"("무장 거미")로서 공지됨)의 독액은, 주로 이온 채널 및 수용체로서 작용하는 상이한 약물학적 효과를 갖는 생물활성 폴리펩타이드가 풍부하다. 상기 독액에 의해 유발되는 우세한 증상들은 일반적인 과잉과민성으로부터 생성된다. 연구들은 상기 독액 독성이 주로 PhTx2 분획의 효과로부터 나옴을 입증하였다(고찰을 위해서 하기 문헌을 참조하시오: BROGES, M. H. et. Al. In: Animal Toxin: State of the Art. Perspectives in Health and Biotecnology. Maria Elena de Lima, Adriano Monteiro de Castro Pimenta, Marie France Martin-Eauclaire, Russolina Benedeta Zingali e Herve Rochat (organizadores), Belo Horizonte-MG. Editora UFMG. 800p. 2009, GOMEZ, M.V. et al. Cellular and Molecular Neurobiology, 22: 5/6, 2002). 상기 분획으로부터 공개된 독소 PnTx2-6(MM 5.291.3 Da)은 마우스에게 뇌내 주사후 전체 분획의 대증 효과를 재현한다(LE SUEUR, L. P. et al. Acta Neuropathol. 105, 125-134, 2003). 그의 작용은 나트륨 채널의 불활성화 흐름의 지연에 기여하여, 상기 채널 중 일부 하위유형의 활성화에 또한 영향을 주어 상기 활성화를 보다 음 전위 쪽으로 옮겨놓는다(MATATEL, A. et al. Biochemistry. 48 (14), 3078-3088, 2009; CASSOLI et al., com. pessoal 2012).

래트의 발기 기능에 대한 PnTx2의 효과는 이전에 "포뉴트리아 니그리벤터 거미로부터의 PnTx2-6의 약학 조성물을 사용함에 의한 발기 기능의 강화 방법"이란 표제의 특허 출원 PI0800596에, 정상혈압 래트에서 발기를 강화하고, 고혈압 동물(DOCA-sal), 및 또한 당뇨병 마우스 또는 늙은 래트의 발기 기능을 복원시키는 것으로 개시되었다(고찰을 위해서 문헌[NUNES, K.P et al. The Journal of Urology,9(10):2574-81, 2012]을 참조하시오). 이들 효과는 일산화질소 신타제(NOS) 효소의 활성화 및 질산(NO)의 방출에 의해 매개될 만하다(YONAMINE, C.M. et al. Toxicon 44, 169?172, 2004; NUNES et al., 2008, 2009). 그 밖에, 상기 질산 경로에 관여하는 일부 유전자들이, 독소 PnTx2-6에 의한 처리 후 발현되어 마우스의 발기 조직을 강화함이 제시되었다(VILLANOVA, F.E., et al. Toxicon. 54(6), 793-801, 2009).

일산화 질소 신타제(NOS)에 의한 L-아르기닌의 가수분해 산물인 일산화 질소(NO)는 발기 과정의 필수적인 매개인자이다(LEWIS, R.W. et al. A. Definitions, classification, and epidemiology of sexual dysfunction. In: Sexual Medicine. Sexual Disfuntion in Men and Women, Lue, T. F.; Basson, R.; Rosen, R.; Giuliano, F.; Khoury, S.; Montorsi, F., (Editores.) International for Sexual Medicine, Paris, p. 39-72, 2004). 비-아드레날린 작용성-비-콜린작용성 신경(NANC), 질소 활성화 신경 및 내피 세포에 의한 방출 후에, NO는 음경 평활근의 소주 및 혈관 부근으로 확산되어 용해성 사이클라제 구아닐레이트(GC)의 활성을 자극하여, 환상 구아노신 모노포스페이트(GMP)의 농도를 증가시킨다(TODA, No. et. Pharmacol. Ther. 106 (2), 233-266, 2005; PRIETO, D. Int. J. Impot. Res (20(1), 17-29, 2008). 상기 GMP의 형성은 세포내 칼슘 수준의 감소를 유도하여, 후속의 음경 발기와 함께 평활근 세포의 이완에 이르게 된다(TOTA et al., 2005). 발기는 포스포다이에스테라제 유형 5 효소에 의한 상기 GMP의 가수분해로 인해 종료된다(IGNARRO, L.J. et al. Biochem Biophys Res Commun., 170, 843-50, 1990; RAJFER, J. et al. N. Engl. J. Med. 326(2), 90-94, 1992; LEE, M.R. J. Biol. Chem. 272, 5063-5068, 1997; BIVALACQUA, T.J.et al. Trends Pharmacol. Sci., 21 (12), 484-489, 2000).

현재, 발기 부전에 사용되는 주요 약물요법은 PDE-5 억제제, 예를 들어 실데나필(비아그라), 탈라다필(시알리스(Cialis) 등록상표) 및 발데나필(레비트라(Levitra) 등록상표)이다(MORELAND, R.B et al. Trends Endocrinol. Metab. 10(3), 97-104, 1999; PRIVIERO, F.B. et al Acta Pharmacol. Sin. 28(6), 751-755, 2007; LEITE, R. at al. Recent Pat. Cardiovasc. Drug Discov. 2(2), 119-132, 2007). 그러나, PDE-5 억제제는 혈관 질환이 있는 환자(이 경우 NO의 생산이 손상된다)의 치료에 효율적이지 않다. 따라서, PnTx2-6에 의해 유도된 해면체의 평활근의 이완 효과는 상기 효소 PDE-5의 억제와 독립적이기 때문에, 상기 독소는 현재 입수할 수 있는 약제에 의해 치료될 수 없는 발기 부전 환자에게 유효한 약제의 생산을 가능하게 한다. PnTx2-6의 또 다른 중요한 효과는 래트의 대뇌피질 시냅토솜 글루타메이트의 방출의 자극에 관한 것이다(SILVA, 2012-com.Pessoal-SILVA, C.N. 무장 거미(포뉴트리아 니그리벤터)의 독액의 독소 PnTx2-6에 의한 래트의 대뇌피질로부터 L-글루타메이트의 방출의 분석, 글루타메이트의 방출에 있어서 및 발기 기능의 강화제로서 합성 펩타이드(PnTx-19)의 활성의 초기 평가. 2012년 8월 31일자로 제공된 석사 논문, Biochemistry and Immunology of the Unviersidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, Minas Gerais, 120 p., 2012). 요나민(Yonamine) 등(2005)은 요오드 처리된 PnTx2-6이 혈액뇌 장벽을 통과하고 따라서 CNS에 직접 약간의 효과를 발휘할 수 있음을 발견하였다(이는 문헌[Nunes et al, NUNES, K. P., et al. J. Sex Med, 7: 3879-88, 2010).]에 의해 입증되었다).

글루타메이트(L-글루타메이트 또는 L-glu)는 포유동물의 CNS의 가장 풍부하고 중요한 흥분성 신경전달물질이다. 상기는 시냅스 가소성(인지 및 기억과 같은 행동 과정의 생리학적 기초의 부분이다)에 근원하는 기전에서 중요한 역할을 발휘한다. L-glu는 또한 시냅시스의 형성, 리모델링, 제거, 이동, 증식, 신경 분화 및 세포사와 같은 신경계의 발생에 관련된 기능들을 수행한다(PRYBYLOWSKI, K. et al. J Biol Chem. 279, 9673-6, 1994; MCKINNEY, R.A.. Journal Physiology. 588 (1),107-116, 2010; MANENT, J.B., REPRESA, A. The Neuroscientist,13 (3), 268-279, 2007; SCHLETT, K. Current Topics Medicinal Chemistry. 6(10), 949-960, 2006; VECINO, E. et al. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 965-974, 2004). 그 밖에, 글루타메이트는 특히 실방핵(PVN), 복측피개영역(VTA), 시상하부와 같은 발기 기능의 조절에 관련된 일부 대뇌 영역들을 활성화시킴으로써 음경 발기를 촉진할 수 있다(ARGIOLAS, A., MELIS, M.R.. Prog. Neurobiol. 47, 235-255, 1995; SONG, Y., RAJASEKARAN, M. Urology. 64(6), 1250-1254, 2004; MELIS M.R., ARGIOLAS A. Neuroscience and Biobehavioral. Reviews 35, 939-955, 2011; UCCU, S. et al. Neuropharmacology. 61(1-2), 181-188, 2011).

PnTx2-6이 뇌의 상기 신경계상에서 작용할 것 같으며, 따라서 상기 독소에 의한 첫 번째 독성 시험이 뇌내 주사를 통해 이루어졌고 상기가 발기를 일으키는 것으로 밝혀졌다(고찰을 위해서 문헌[NUNES et al., 2009]을 참조하시오). 다른 한편으로, 발기 기능의 강화 연구를 목적으로 상기 독소에 의해 수행된 다른 생체내 시험이 피하 또는 정맥내 주사에 의해 이루어졌으며, 양성 반응이 생성되었다(NUNES, 2008b, NUNES et al, 2008a). 그 밖에, 요나민 등은 요오드화된 PnTx2-6이 혈액뇌 장벽을 통과할 수 있고 따라서 CNS에 대해 직접 일부 효과를 발휘할 수 있음을 발견하였다. 우리 그룹이 또한, 테크네슘에 의해 표지되고 말초적으로 주사된 PnTx-6이, 음경 중에 농축하기는 하지만, 신경 조직 중에 소량으로 또한 존재함을 보였으며, 이는 적어도 그의 일부가 혈액뇌 장벽을 가로지름을 믿게 하였다(NUNES et al., 2010a). 상기 혈액뇌 장벽에 대한 상기 독소의 작용에 대한 연구는 초기 단계에 있으며, 상기 연구는 상기 독소의 CNS 내로의 가능한 침입에 대한 이해를 목적으로 한다. 알고 있는 것은 말초 및 중추 경로 모두에 의해 주사된 상기 독소 PnTx2-6이 발기를 유도할 수 있다는 것이다. 상기 작용이 일어나는 기전을 입증해야 한다. 상기 발기에 대한 상기 독소의 말초적 작용의 명확한 결과는 상기 독소를 상기 시험관내 제조에 직접 적용할 때 해면체 조각의 이완을 나타낸다는 것이다(NUNES et al. 2010a; 2010b; 2012).

마타벨(Matavel) 등(2009)은 분자 모델링 도구를 사용하여, 나트륨 채널과 상호작용한다고 하는 미지의 에피토프 중의 상기 PnTx2-6의 몇몇 아미노산을 나타내었다. 이와 관련하여, 상기 아미노산을 포함하는 PnTx2-6의 부분 펩타이드 서열의 화학 합성은 상기 분자와 그의 수용체와의 상호작용의 구조 및 약물학적 특성화에 대한 새로운 관점을 열었다. 그 밖에, 비교적 간단하고 높은 수율의 가능성을 갖는 펩타이드 합성은 상이한 조직들에 대한 약물학적 연구에 필요한 물질을 제공하여, 어렵고 값비싼 상기 독액의 정제 또는 심지어 이종 발현에 의해 수득되는 물질에 대해 관찰되는 한계를 극복할 수 있다(MATAVEL, A. et al. Biochemistry 48(14), 3078-3088, 2009). 따라서, 현재의 기술에서 19 아미노산의 짧은 폴리펩타이드 쇄를 나타내는 변형된 합성 펩타이드 PnTx(19)가 개발되었으며, 이는 상업적인 목적을 위해서 쉽게 수득할 수 있어, 발기 부전의 치료 및/또는 발기 기능의 강화에 사용하기 위한 약학 조성물의 개발을 제공한다. 그 밖에, 현재의 기술에서 상기 펩타이드는 래트의 대뇌피질 시냅토솜에서 글루타메이트의 방출을 유도하고, 마우스 및 래트의 해면체 조각의 이완을 자극하며, 상기 펩타이드가 유도되는 천연 독소에 관하여 보다 낮은 독성 효과를 나타내고, 더욱이 시중에 존재하는 비아그라와 달리, 심장 독성을 나타내지 않음이 입증되었다. 상기는 또한 고혈압 동물에서 유효하며 낮은 면역원성을 나타낸다.

종래 기술에서, "발기 부전의 치료를 위한 조성물 및 방법"이란 표제 하의 출원 WO2009083808에 개시된 바와 같이, 거미 독액으로부터 유도된 폴리펩타이드를 기본으로 하는 신규 제형이 존재하며, 상기 출원은 검정 과부 거미(라트로덱투스 막탄스(Latrodectus mactans))의 독액으로부터 단리된 폴리펩타이드 및 그의 생물 활성 단편을 포함하는 조성물을 개시한다. 그러나, 발기 부전의 치료를 위해 본 발명의 펩타이드와 유사한 어떠한 펩타이드도 발견되지 않았다.

본 발명은 포뉴트리아 니그리벤터(Phoneutria nigriventer) 거미의 천연 독소 PnTx2-6의 서열로부터 구성된 합성 폴리펩타이드, 상기 펩타이드를 함유하는 약학 조성물, 그리고 상기 펩타이드를 발기 부전의 치료 및/또는 발기 기능의 강화를 목적으로 이용하는 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 과제 해결을 위하여, 본 발명은 서열 GERRQYFWIAWYKLANSKK(서열번호 1)를 포함함을 특징으로 하는 합성 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 발기 부전을 앓고 있는 환자의 치료 및/또는 발기 기능의 강화를 위한 약제의 제조에 이용됨을 특징으로 하는 상기한 합성 펩타이드의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 서열에 의해 나타내는 합성 펩타이드와, 부형제 또는 약학적으로 허용 가능한 부형제들의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 발기 부전을 앓고 있는 환자의 치료 및/또는 발기 기능의 강화를 위한 약제의 제조에 이용됨을 특징으로 하는 상기한 약학 조성물의 용도를 제공한다.

도 1은 펩타이드 PnTx(19)의 합성 산물의 HPLC 시스템에서의 역상 크로마토그래피이다. 예비 컬럼 스파실(Sphasil) 펩타이드 C8 5μ ST 4.6/100, 나머지는 수 밀리(Milli)-Q 0.1% TFA(부피 기준)이고, 3 분간 0 내지 25% 용액 B(0.1% TFA/아세토나이트릴 v/v), 30 분간 25 내지 35%의 B 및 5 분간 35 내지 100%의 용액 B의 구배로 2.0 ㎖/분의 유량으로 용리된다.
도 2는 합성 펩타이드 PnTx(19)를 함유하는 분획의 질량 분광분석한 그래프이다. MALDI-TOF에 의해 2484.9 Da의 PnTx(19)의 분자량이 측정되었다.
도 3은 락테이트 데하이드로게나제 효소(NADH를 NAD+로 산화시킨다)의 활성에 의해 입증된 시냅토솜 생육력을 나타낸 그래트이다. 상기는 판독(339 ㎚)에서 감소를 측정하며, 이는 효소 활성의 정량분석을 가능하게 한다. 상기 반응 혼합물을 60 분 동안 PnTx(19)(10^-5 M; 3x10^-5 M; 10^-6 M; 3x10^-6 M)와 함께 배양하고 활성 백분율을 100%의 용해로 간주되는 트리톤 X-100에 의해 촉발된 용해에 관하여 평가하였다. 상기 효소의 활성은 상기 시냅토솜의 파손에 비례하며, 상기 효소는 세포내 구획의 효소인 것으로 간주된다.
도 4는 L-글루타메이트의 방출에서 상이한 농도의 PnTx(19)의 효과를 나타낸 그래프이다. ELISA 플레이트는 칼슘(2 mM)과 함께 KRH 중의 시냅토솜 혼합물(10% 최종 부피) 및 NADP+(1 mM의 최종 농도) 300 ㎕/웰을 함유하며, 이를 일정한 교반 하에 37 ℃에서 유지시키고 모니터하였다. 분광형광계상에서 2460초 동안 형광 판독을 수행하였다. 효소 GDH(300 ㎕의 최종 부피에 대해 35 단위)를 상기 웰에 60초째에 가하고; 660초째에 상이한 웰중에 상이한 농도의 PnTx(19)("10^-5 M, 3x10^-5 M, 10^-6 M 및 3x10^-6 M") 및 KCl(33 mM)을 가하였다. 음성 대조용으로서, 상기 독소와 함께 처리되지 않은 시냅토솜을 함유하는 웰을 사용하였다. 상기 결과는 3회 중복하여 수행된, 2 개의 독립적인 실험의 평균 및 표준 오차를 나타낸다. ^*P<0.05는 상기 처리되지 않은 시냅토솜에 의해 나타내는 대조용과 비교된 분석들의 유의수준을 나타낸다.
도 5는 마우스의 해면체 조각들의 이완에 대한 독소 PnTx2-6 및 펩타이드 PnTx(19)(1x10^-6 M)의 효과를 나타낸 그래프이다. 상기 조각들을 페닐에프린(10^-5 M)으로 미리-수축시키고 아세틸콜린(10^-4 M)(대조용), PnTx2-6(5x10^-8 M) 및 PnTx(19)(x10^-6 M)(n=3)으로 이완시켰다.
도 6은 심장 나트륨 전류에서 펩타이드 PnTx(19) 및 독소 PnTx2-6의 효과를 나타낸 그래프이다. A는 나트륨 전류의 피크(검은색 화살표) 및 불활성화 전류(회색 화살표)에 대한 독소 PnTx2-6의 효과를 나타낸다. C는 나트륨 전류의 피크 및 불활성화 전류에 대한 펩타이드 PnTx(19)의 효과를 나타낸다. D는 PnTx(19) 및 PnTx2-6의 관류 동안, 상기 나트륨 전류의 피크의 시간 과정을 나타낸다. 각각의 검은색 원은 -20 mV의 막 전위에서 매 1초 마다 측정된 Ina의 진폭을 가리킨다. 회색 막대는 세포가 PnTx2-6 또는 PnTX(19)(펩타이드)에 노출된 순간을 가리킨다. 막대 그래프는 붕괴 상수(E) 및 나트륨 전류(F)의 감소에서 PnTx2-6 500 nM(n=7) 및 PnTx(19) 펩타이드 1 μM(n=12)의 효과를 요약한다. 막대는 평균±SEM을 가리키고, ^*p<0.05는 대조용에 관한 것이다.
도 7은 래트의 우측 (A) 및 (B) 심실압, 도함수 ±dP/dt(C 및 D) 및 심장 박동수(E)에서 펩타이드 PnTx(19) 및 독소 PnTx2-6의 반응 용량 곡선이다
도 8은 항체 역가의 분석한 그래프이다. A) 대조용: 항원보강제(알루미늄 하이드록사이드). B) 수일간 펩타이드 PnTx(19)(10 G)의 투여후 항체 역가.

본 발명은 고체 지지체 상에서 Fmoc/t-부틸 합성 전략을 사용함으로써 화학적으로 합성된 펩타이드 PnTx(19), NH3-GERRQYFWIAWYKLANSKK-COOH(서열번호 1)을 포함한다(MERRIFIELD, R. B. Solid-phase peptide synthesis. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. (32), 221-296, 1969). 상기 펩타이드는 19 개의 아미노산 잔기를 가지며, 선형이고, 생물정보학에 대한 분석 및 분자 모델링 연구 후에 제안된 상기 PnTx2-6의 가능한 3-차원 구조로부터 설계되었다. 상기는 소수성 "코어" 및 상기 영역을 둘러싸는 양으로 하전된 잔기를 포함하며, 상기 잔기는 분자 모델링 연구에 따르면 상기 독소와 나트륨 채널과의 상호작용을 맡고 있다(MATAVEL et al., 2009). 상기 분자 모델링 연구로부터 개발된 서열(불연속 에피토프)은 본 발명에서 발기 기능에 대한 그의 활성이 유지될 수 있도록 하는 중대한 변형을 겪었다. 즉 17번 위치의 아미노산 시스테인이 세린에 의해 치환되었으며, 상기 펩타이드는 그의 용해도를 증가시킬 목적으로 C-말단 부분에서 아미드화되고 N-말단 부분에서 아세틸화되었다.

상기 활성화에 대한 시험은 PNTx(19)가 꼭 PnTx2-6처럼 래트의 대뇌피질 시냅토솜에서 글루타메이트 작용성 시스템을 간섭함을 입증하였다. 상이한 농도의 상기 펩타이드가 사용되었으며, 3x10^-5 M의 용량에서 PnTx(19)는 래트의 대뇌피질 시냅토솜에서 글루타메이트의 방출의 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 4).

발기에 있어서 상기 펩타이드의 작용은 마우스로부터 단리된 해면체의 조각을 사용하여 입증되었다. 1 μM PnTx(19)는 마우스의 해면체 조각의 현저한, 대략 80%의 이완(도 5)을 제공하였으며, 이는 50 nM의 PnTx2-6 및 100 μM의 아세틸콜린에 의해 발생한 작용과 유사하다. 추정상, 상기 해면체의 이완은, 발기 경로에서 후속 사건들을 촉발하는 상기 선형 펩타이드와 해면체 중 나트륨 채널과의 연결에 기인한다.

상기 합성 펩타이드 PnTx(19)의 개발은 천연 독소 PnTx2-6에 대한 독성 효과를 감소시킬 가능성과 함께 최대량의 활성 분자를 수득할 수 있게 하며, 이는 발기 부전의 치료 및/또는 발기 기능의 강화를 위한 약학 조성물의 개발을 제공한다.

상기와 같은 약학 조성물은 합성 펩타이드 및 부형제 또는 약학적으로 허용 가능한 부형제들의 혼합물을 포함함을 특징으로 하며, 여기에서 상기 펩타이드는 조절된 방출 시스템 없이 또는 상기 시스템에 결합하여 존재할 수 있다. 상기 조절된 방출 시스템은 리포솜, 사이클로덱스트린, 생분해성 중합체, 캡슐, 마이크로- 및 나노-캡슐, 마이크로- 및 나노-입자, 일시주사 제제, 삼투 펌프, 확산 장치, 리오스페어, 경피 투여 시스템 및/또는 온도 변화가 가해졌을 때 동일 반응계에서 고체 또는 젤을 형성하는 액체를 포함할 수 있다. 이렇게 하여, 상기 약학 조성물을 경구, 국소, 근육내, 정맥내, 피하, 흡입 경로에 의해, 또는 이식 장치에 의해 투여할 수 있다.

본 발명을 하기의 실시예들을 참조하여 보다 잘 이해할 수 있으며, 이들 실시예는 기술의 제한이 없다.

[실시예]

실시예 1. 펩타이드 PnTx(19)의 화학적 고상 합성 및 정제

PnTx(19)라 칭하는 합성 펩타이드(NH3-GlyGluArgArgGInTyrPheTrplleAlaTrpTyrLysLeuAlaAsnSerLysLys-COOH)를 생물정보학 프로그램 PEPOP를 사용하여 부분적으로 설계하였다. 이렇게 하여, 독소 PnTx2-6에 대한 19 개 아미노산 함유 불연속 에피토프를 제안하였다(FLEURY, Cecile, Bioinformatics tools dedicated to the study of the structure-function-antigenicity relationship in animal peptide toxins. Doctoral thesis, Department of Biochemistry and Immunology of the Unviersidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, 180 p., 2009). 상기 펩타이드의 용해도를 증가시킬 목적으로, 본 발명의 기술에서 N-말단 부분(아세틸화) 및 C-말단 부분(아미드화)의 변형을 갖는 PnTx(19)를 합성하였다. 상기 아세틸화되고 아미드화된 펩타이드 PnTx(19)는 수용성인 것으로 입증되었다.

상기 펩타이드 PnTx(19)를 역상 크로마토그래피(HPLC AKTA Explorer 10)에 의해 정제시켰다. 도 1에 제공된 크로마토그래피 프로파일은 합성 부산물 및 PnTx(19)라 칭하는 분획(29% 완충제 B에 의해 용리된다)의 존재를 입증한다. 정제 후에, 질량 분광학(MALDI-TOF)에 의한 분석은 상기 스펙트럼 중 단지 분자 종의 그룹만을 나타내었으며, 그의 분자 질량은 2484.970 Da이었고(도 2), 이는 펩타이드 PnTx(19)에 대해 예상된 질량과 양립성이었다.

실시예 2. 시냅토솜 생육력에 대한 시험

다자란 래트(240-300 g)를 참수시키고 뇌를 신속히 제거하여 균질화 용액(슈크로스 0.32 M, EDTA 1 Mm 및 다이티오트레이톨(DTT) 0.25 mM, pH = 7.4)에 담그고 얼음 중에서 유지시켰으며, 이어서 이를 앞서 문헌[Dunkley et al 1988, DUNKLEY, P.R.; Brain Research, 441, 59-71, 1988]에 개시된 바와 같이 시냅토솜의 제조에 사용하였다.

상기 시냅토솜의 생육력의 대조용으로서 및 또한 상기 펩타이드의 가능한 용해 활성을 입증하기 위해서, 문헌[Kubowistz, Ott, 1943, KUBOWISTZ, F., OTT, C. Biochem Z. 319, 94-117, 1943]에 따라, 효소 락테이트 데하이드로게나제의 활성에 대한 시험을 수행하였다.

LDH 활성을 대조용 조건에서, 1% 트리톤 X-100(100%의 용해)의 존재하에서 및 하기 농도 10^-5 M; 3x10^-5 M; 10^-6 M; 3.x10^-6 M의 PnTx(19)의 존재하에서 평가하였다.

도 3의 결과는 획득된 값들이 대조용(상기 펩타이드의 부재)에 필적하는 값들인, 10^-5 M 농도의 경우 3.4%의 용해; 3x10^-5 M 농도의 경우 2%의 용해; 10^-6 M 농도의 경우 6%의 용해; 3x10^-6 M 농도의 경우 9%의 용해였으므로, 상기 펩타이드가 시냅토솜 생육력 및/또는 토세포 기구에 영향을 미치지 않음을 입증한다.

실시예 3. 마우스의 해면체 조각에 대한 독소 PnTx2 -6 및 펩타이드 PnTx (19)의 효과

마우스를 참수에 의해 죽이고, 그의 음경을 외과적으로 제거하여 크렙스(Krebs) 링거 바이카보네이트 - (NaCl, 118.1; KCl, 4.7; KH₂PO₄, 1.0; MgSO₄, 1.0: NaHCO₃, 25.0; CaCl₂, 2.55; 및 글루코스, 11.1 mM)를 함유하는 페트리 디쉬 상에 놓고, 95% O₂ 및 5% CO₂의 혼합물을 발포시켰다. 상기 샘, 해면체 및 요도를 제거하고 해면체를 정소의 제거와 함께 건조시키고 이들 사이의 섬유성 격막을 절단함으로써 분리시켰다. 약 1x1x7 ㎜ 크기의 상기 해면체의 조각을 챔버 중에 별도로 올려놓고, 한쪽 단부는 전극에 고정시키고 다른 단부는 변환기에 연결시켰다. 상기 챔버는 37℃에서 크렙스(pH 7.4)를 함유하였으며, 나머지는 95% O₂ 및 5% CO₂이었다.

상기 조직을 2.0 mN의 수동적인 힘에 의해 신장시키고 60 분간 안정시켰으며, 상기 용액을 매 15 분마다 교체하였다. 등척 수축력의 변화를 소프트웨어 WinDaq 데이터 획득(데이다(Dada)(등록상표) 인스트루먼츠, 미국 소재)을 사용하여, 증폭기(TBM-4 모델; 월드 프리시젼 인스트루먼츠 인코포레이티드(World Precision Instruments, Inc.), 미국 소재)에 연결된 등척 수축력 변환기(월드 프리시젼 인스트루먼츠 인코포레이티드, 미국 플로리다주 사라소타 소재)를 사용하여 기록하였다. 상기 제제의 수축 능력을 평가하기 위해서, KCl 용액(120 mM)을 상기 해면체의 조각에 가하고, 이어서 상기 제제를 크렙스로 3 회 세척하였다.

상기 해면체의 조각을 페닐프린(100-5 M)으로 미리-수축시키고, 아세틸콜린 10^-4 M(대조용), PntX2-6(5x10^-6 M) 및 펩타이드 PnTx(19)(1x10^-6 M)에 의해 이완을 일으켰다.

도 4는 독소 PnTx2-6(5x10^-8 M) 및 펩타이드 PnTx(19)(10^-6 M)가 83%의 이완을 유도하는 반면 아세틸콜린(10^-4 M)을 갖는 대조군은 페닐프린(10^-5 M)에 의해 미리-수축된 마우스의 해면체 조각상에서 81.6%의 이완을 유도했음을 보인다. 상기 결과는 상기 독소 PnTx2-6 및 펩타이드 PnTx(19)가 모두 마우스의 해면체 조각을 이완시킴에 있어서 활성임을 가리킨다.

실시예 4. L- 글루타메이트의 방출에 있어서 합성 펩타이드 PnTx (19)의 효과

L-글루타메이트의 방출을 문헌[Nicholls et al. 1987, NICHOLLS, D. et al. J. Neurochem. 49, 5057, 1987]의 제안에 따라 분석하였다. 상기 펩타이드가 꼭 천연 독소처럼 래트의 대뇌피질 시냅토솜에서 L-글루타메이트의 방출을 유도할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해서, 하기 농도로 그의 효과를 분석하였다: 10^-5 M, 3x10^-5 M, 10^-6 M, 및 2x10^-6 M, 도 5.

상기 결과로부터 상기 실험 조건에서 오직 3x10^-5 M의 농도에서만 상기 펩타이드가, 대조용(PnTx(19) 부재)에 비해 L-글루타메이트의 현저한 방출을 유도할 수 있음이 관찰된다.

실시예 5. 나트륨 전류에 대한 심장 영향에 대한 펩타이드 PnTx (19)의 효과

패치-클램프 실험을 심장 근육세포 중에 존재하는 나트륨 채널 Nav1.5에 대한 독소 PnTx2-6 및 펩타이드 PnTx(19)의 효과를 분석할 목적으로 수행하였다. 기록은 상기 독소 PnTx2-6이 나트륨 전류 피크의 감소를 유발하여, 불활성화 전류를 지연시킴을 입증하였다. 이러한 효과는 PnTx(19)의 경우 관찰되지 않았다(도 6A 및 C). 도 6B에서, PnTx2-6이 상기 나트륨 전류의 밀도의 감소를 촉진한 것으로 관찰되며, 이러한 현상은 상기 펩타이드의 존재 하에서는 관찰되지 않았다(도 6D).

심실압, 심장 박동수 및 도함수 ±dP/dt에 대한 효과

상기 래트를 물과 먹이에 대해 자유롭게 접근시키면서 안정한 온도에서 12h 명암의 조절된 주기 하에 유지시켰다. 상기 래트를 헤파린(200 IU)의 복강내 주사후 10 내지 15분째에 참수시켰다. 흉부를 열고, 심장을 조심스럽게 건조시키고 NaCl(118.4), KCl(4.7), KH₂PO₄(1.2), MgSO₄.7H₂O(1.2), CaCl₂.2H₂O(1.25), 글루코스(11.7) 및 NaHCO₃(26.5)(mmol/L 기준)을 함유하는 크렙스-링거액(KRS)으로 대동맥 팁을 통해 관류시켰다. 상기 관류 흐름을 37 ℃ 및 일정한 산소 공급(5% CO₂ 및 95% O₂) 하에서 일정하게(10 ㎖/분) 유지시켰다. 압력 변환기에 연결된 풍선을 우심실에 삽입하고, 심실압, 심장 박동수 및 도함수 ±dP/dt를 모니터하였다(도 7). 상기 풍선 부피를 약 10 ㎜Hg의 최종 확장압으로 조절하였다. 균형에 도달하는 기간(30 내지 40 분) 후에, 100 μmol/L 담체(대조용), 관류 완충제 중의 37.8 nmol/L 내지 37.8 μmol/L 농도의 독소 또는 37.8 nmol/L 내지 37.8 μmol/L 농도의 펩타이드를 주사하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 독소는 상기 농도에 따라 최종 우심실 수축기압(RFVSP/PVSFD) 및 +dP/dt 및 -dp/dt 증가를 각각 기껏해야 66.7±13.55% 및 61.6±9.89%까지 유도하였다(도 7A; C 및 D). 그러나, 상기 독소는 최종 확장기압 및 심장 박동수는 변경시키지 않았다. 대조적으로, 상기 펩타이드는 심지어 높은 농도에서조차 이들 매개변수 중 어느 것도 변경시키지 않았다(도 7B 및 E).

상기 결과는 평균±SEM이다. 일원 변량분석(ANOVA)의 분석에 이은 뉴만-쿨스 후-시험을 사용하여 단리된 심장에 대한 상기 매개변수들을 분석하였다. 통계학적 분석에 대해서 p<0.05인 것으로 간주되었다.

실시예 6. 펩타이드 PnTx(19)의 면역원성

스위스, 수컷, 20-23 그램의 마우스를 2 개의 그룹(대조군 - 항원보강제: 알루미늄 하이드록사이드 - 도 8A 및 PnTx(19) - 10 μG - 도 8B)으로 분할하였으며, 각 그룹은 4 마리의 동물을 함유하였다. 상기 마우스를 피하 경로에 의해 면역시켰다. 첫 번째 접종으로부터 21, 35 및 49일째에, 상기 마우스를 상기 언급한 제제로 보강하였다. 상기 PnTx(19)에 대한 항체의 존재를 입증하기 위해서, 상기 마우스 꼬리로부터 수거한 혈청을, 다른 제제들에 대해 개시된 바와 같이(DEL PINO, F.A.B., BRANDELLI, A., GONZALES, J.C., HENRIQUES, J.A.P., DEWES, H., Effect of antibodies against β-N-acetylglucosaminidase on reproductive efficiency of the bovine tick Boophilus microplus. Vet. Parasitol. 79, 247-255, 1998), 간접 면역효소 분석(ELISA)을 통해 상기 첫 번째 접종 후 15, 30, 40 및 60일째에 평가하였다.

PnTx(19)의 면역원성을 상기 PnTx(19) 10 ㎍의 피하 주사 후 평가하였다(도 8B). 상기 분석 도중 상기 동물의 과민반응 또는 사망 반응은 관찰되지 않았다. 상기 펩타이드의 첫 번째 접종 후 60일째에 그룹 2(PnTx(19) - 10 ㎍)에서 항체 역가의 약간의 증가가 발견되었다(도 8B). 10 ㎍의 펩타이드 용량이 독소 PnTx2-6(0.79 pg/생쥐)에 대해 평가된 DL50보다 약 12.5 배 정도로 높다는 것을 지적하는 것은 중요하다(CORDEIRO M.N., DINIZ C.R., VALENTIM A.C., VON EICKSTEDT, GILROY J., RICHARDSON M. The purification and amino acid sequences of four Tx2 neurotoxins from the venom of the Brasilian 'armed' spider Phoneutria nigriventer (Keys). FEBS Lett. 310, 153-156, 1992).

<110> Universidade Federal de Minas Gerais <120> SYNTHETIC PnTx(19) PEPTIDE, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND USE <130> INC9420 <140> 10-2015-7006585 <141> 2015-03-13 <150> BR102012020800-8 <151> 2012-08-20 <150> BR102013020574-5 <151> 2013-08-13 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PnTx(19) <400> 1 Gly Glu Arg Arg Gln Tyr Phe Trp Ile Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn 1 5 10 15 Ser Lys Lys

Claims

서열 GERRQYFWIAWYKLANSKK(서열번호 1)로 표시되고, 발기 부전의 치료 효과 또는 발기 기능의 강화 효과를 가지는 합성 펩타이드.
제1항에 있어서,
N-말단 부분에 아세틸화 및 C-말단 부분에 아미드화의 변형을 나타냄을 특징으로 하는 합성 펩타이드.
삭제
서열번호 1로 표시되는 합성 펩타이드 및 부형제 또는 약학적으로 허용 가능한 부형제들의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는, 발기 부전을 앓고 있는 환자의 치료 또는 발기 기능의 강화를 위한 약학 조성물.
제4항에 있어서,
펩타이드가, 리포솜, 사이클로덱스트린, 생분해성 중합체, 캡슐, 마이크로- 및 나노-캡슐, 마이크로- 및 나노-입자, 일시주사 제제, 삼투 펌프, 확산 장치, 리오스페어, 경피 투여 시스템 및 온도 변화가 가해졌을 때 동일 반응계에서 고체 또는 젤을 형성하는 액체를 포함하는 그룹 중에서 선택된 조절된 방출 시스템 없이 또는 상기 시스템에 결합하여 존재함을 특징으로 하는 약학 조성물.
제4항에 있어서,
경구, 국소, 근육내, 정맥내, 피하 및 흡입 경로 중 하나에 의해, 또는 이식 장치에 의해 투여됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
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