ES2677149T3 - Péptido PnTx(19) sintético, composiciones farmacéuticas y uso - Google Patents

Abstract

Un péptido sintético caracterizado porque comprende la secuencia GERRQYFWIAWYKLANSKK (SEQ ID No. 1).

Description

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DESCRIPCION

Peptido PnTx(19) sintetico, composiciones farmaceuticas y uso

La presente invencion se relaciona con un polipeptido sintetico de 19 aminoacidos, denominado PnTx(19), constituido por la secuencia de la toxina nativa PnTx2-6 de la arana Phoneutria nigriventer. Tambien se relaciona con composiciones farmaceuticas que contienen dicho peptido y a su uso en el tratamiento de la disfuncion erectil y/o en la potenciacion de la funcion erectil.

El veneno de la arana Phoneutria nigriventer, conocida popularmente como "aranha-armadeira" ("arana armada") es rica en polipeptidos bioactivos con diferentes efectos farmacologicos, que actuan principalmente en canales y receptores ionicos. Los smtomas predominantes causados por su veneno son el resultado de la hiperexcitabilidad general. Los estudios han demostrado que la toxicidad del veneno proviene en gran medida de los efectos de la fraccion PhTx2 (para una revision ver: bRoGES, MH et. Al. In: Animal Toxin: State of the Art. Perspectives in Health and Biotecnology. Maria Elena de Lima, Adriano Monteiro de Castro Pimenta, Marie Francia Martin-Eauclaire, Russolina Benedeta Zingali y Herve Rochat (organizadores), Belo Horizonte-MG. Editora UFMG. 800p. 2009, GOMEZ, MV y otros, Cellular and Molecular Neurobiology, 22: 5/6, 2002). La toxina PnTx2-6 (MM 5.291.3 Da), publicada a partir de esta fraccion, reproduce los efectos sintomaticos de la fraccion total despues de la inyeccion intracerebral en ratones (LE SUEUR, L.P. et al. Acta Neuropathol. 105, 125-134, 2003). Su accion puede atribuirse a la demora en la corriente de inactivacion de los canales de sodio, teniendo tambien efecto sobre la activacion, en algunos subtipos de estos canales, desplazando la activacion a potenciales mas negativos (MATATEL, A. et al., Biochemistry. 48 (14), 3078-3088, 2009; CaSSOLI et al., com. pessoal 2012).

El efecto de PnTx2 sobre la funcion erectil de las ratas se describio anteriormente en la solicitud de patente PI0800596, titulada "Metodo para a potencializagao da fungao eretil atravees do uso das composigoes farmaceuticas de toxina Tx2-6 da aranha Phoneutria nigriventer" (Un metodo para potenciar la funcion erectil mediante el uso de las composiciones farmaceuticas de PnTx2-6 de la arana Phoneutria nigriventer), potencia la ereccion en ratas normotensas, restaura la funcion erectil en animales hipertensos (DOCA-sal), y tambien en ratones diabeticos o ratas de edad avanzada. (para revision, ver: NUNES, K.P et al. The Journal of Urology, 9 (10):2574-81, 2012). Estos efectos merecen ser mediados por la activacion de la enzima oxido mtrico sintasa (NOS) y la liberacion de acido mtrico (NO) (YONAMINE, C.M. et al. Toxicon 44, 169-172, 2004; NUNES et al., 2008, 2009) Ademas, se sugiere que algunos genes implicados en la via del acido mtrico tienen su expresion. Se mejoro el tejido erectil de los ratones despues del tratamiento con la toxina PnTx2-6 (VILLANOVA, F.E., et al. Toxicon 54(6), 793-801, 2009).

El oxido mtrico (NO), un producto de la hidrolisis de la L-arginina por la oxido mtrico sintasa (NOS), es un mediador esencial del proceso de ereccion [LEWIS, R.W. et al. A. Definitions, classification, and epidemiology of sexual dysfunction. In: Sexual Medicine. Sexual Disfuntion in Men and Women, Lue, T. F.; Basson, R.; Rosen, R.; Giuliano, F.; Khoury, S.; Montorsi, F., (Editores.) International for Sexual Medicine, Paris, p. 39-72, 2004]. Despues de su liberacion por los nervios no adrenergicos no colinergicos (NANC), nervios nitrergicos y celulas endoteliales, el NO se propaga a la vecindad trabecular y vascular del musculo liso del pene para estimular la actividad del guanilato ciclasa soluble (GCs), aumentando la concentracion de monofosfato de guanosina dclico (GMPc) (TODA, No. et. Pharmacol. Ther. 106 (2), 233-266, 2005; PRIETO, D. Int. J. Impot. Res (20(1), 17-29, 2008). La formacion de GMPc induce la disminucion de los niveles de calcio intracelular, lo que conduce a la relajacion de las celulas del musculo liso con una tumescencia posterior del pene (TOTA et al., 2005). La ereccion termina debido a la hidrolisis del GMPc por la enzima fosfodisesterasa tipo 5 ((IGnArRO, L.J. et al. Biochem Biophys Res Commun., 170, 843-50, 1990; RAJFER, J. et al. N. Engl. J. Med. 326(2), 90-94, 1992; LEE, M.R. J. Biol. Chem. 272, 5063-5068, 1997; BIVALACQUA, T.J.et al. Trends Pharmacol. Sci., 21 (12), 484-489, 2000).

En la actualidad, la principal farmacoterapia utilizada para la disfuncion erectil es inhibidores de PDE-5 tales como sildenafil (Viagra), taladafil (Cialis® y vardenafil (Levitra®) (MORELAND, R.B et al. Trends Endocrinol. Metab. 10(3), 97-104, 1999; PRIVIERO, F.B. et al Acta Pharmacol. Sin. 28(6), 751-755, 2007; LEITE, R. at al. Recent Pat. Cardiovasc. Drug Discov. 2(2), 119-132, 2007).

Sin embargo, los inhibidores de PDE-5 no son eficaces en el tratamiento de pacientes con enfermedades vasculares, donde la produccion de NO se ve afectada. Por lo tanto, dado que el efecto relajante del musculo liso del cuerpo cavernoso inducido por PnTx2-6 es independiente de la inhibicion de la enzima PDE-5, esta toxina permite la produccion de medicamentos efectivos para pacientes con disfuncion erectil que no pueden ser tratados por los medicamentos actualmente disponibles.

Otro efecto importante de PnTx2-6 se refiere a la estimulacion de la liberacion de glutamato de sinaptosoma cerebrocortical de rata [SILVA, 2012-com. Pessoal -SILVA, C.N. Analise da liberagao de L-glutamato de sinaptosomas de cortex cerebral de rato pela toxina PnTx2-6 da pegonha da aranha armadeira (Phoneutria nigriventer) (Analisis de la liberacion de L-glutamato de la corteza cerebral de ratas por la toxina PnTx2-6 del veneno de la arana armada (Phoneutria nigriventer). Evaluacion inicial de la actividad del peptido sintetico (PnTx-19) en la liberacion de glutamato y como potenciador de la funcion erectil. Tesis de maestna que se presentara en agosto 31, 2012, en el Biochemistry and Immunology of the Unviersidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, Minas Gerais, 120 p., 2012]]. Yonamine et al. (2005) encontraron que el PnTx2-6 yodado puede penetrar la barrera

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hematoencefalica y as^ podna ejercer algunos efectos directamente sobre el CNS, lo que fue confirmado por Nunes et al. 2010 (NUNES, K.P., et al. J. Sex Med, 7: 3879-88, 2010).

El glutamato (L-glutamato o L-glu) es el principal y mas abundante neurotransmisor excitador del CNS en mairnferos. Ejerce un papel crucial en los mecanismos que subyacen a la plasticidad sinaptica, que son parte de la base fisiologica de los procesos conductuales, como la cognicion y la memoria. L-glu tambien realiza funciones relevantes en el desarrollo del sistema nervioso como formacion, remodelacion, eliminacion de sinapsis, migracion, proliferacion, diferenciacion neuronal y muerte celular ((PRYBYLOWSKI, K. et al. J Biol Chem. 279, 9673-6, 1994; MCKINNEY, R.A.. Journal Physiology. 588 (1),107-116, 2010; MANENT, J.B., REPRESA, A. The Neuroscientist, 13(3), 268-279, 2007; SCHLETT, K. Current Topics Medicinal Chemistry. 6(10), 949-960, 2006; VECINO, E. et al. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 965-974, 2004). Ademas, el glutamato puede facilitar la ereccion del pene activando algunas areas cerebrales que estan involucradas en el control de la lmea de funcion erectil del nucleo paraventricular (PVN), el area ventral tegmentada (VTA), el hipocampo, entre otros (ARGIOLAS, A., MELIS, M.R.. Prog. Neurobiol. 47, 235-255, 1995; SONG, Y., RAJASEKARAN, M. Urology. 64(6), 1250-1254, 2004; MELIS M.R., ARGIOLAS A. Neuroscience and Biobehavioral. Reviews 35, 939-955, 2011; UcCU, S. et al. Neuropharmacology. 61(1-2), 181-188, 2011).

Es probable que PnTx2-6 tenga accion sobre este sistema en el cerebro, ya que las primeras pruebas de toxicidad con esta toxina se realizaron mediante inyeccion intracerebral, y se descubrio que causaba la ereccion (para revision, vease: NUNES et al., 2009). Por otro lado, otras pruebas in vivo llevadas a cabo con la toxina con el objetivo de estudiar la potenciacion de la funcion erectil se realizaron con inyecciones subcutaneas o intravenosas, que dieron como resultado respuestas positivas (NUNES, 2008b, NUNES et al, 2008a). Ademas, Yonamine et al. encontraron que el PnTx2-6 yodado puede penetrar en la barrera hematoencefalica y asf ejercer algunos efectos directamente sobre el CNS. Nuestro grupo tambien mostro que PnTx-6 marcado por el tecnecio e inyectado perifericamente, aunque se concentra en el pene, tambien aparece en una pequena cantidad en el tejido nervioso, haciendo creer que al menos una parte del mismo cruza la barrera hematoencefalica (NUNES et al. al., 2010a). Los estudios sobre la accion de la toxina en la barrera hematoencefalica se encuentran en la fase inicial, con el objetivo de comprender la posible entrada de esta toxina en el CNS. Lo que se sabe es que la toxina PnTx2-6 inyectada por ambas vfas periferica y central es capaz de inducir la ereccion. Se deben verificar los mecanismos por los cuales se lleva a cabo esta accion.

El resultado concreto de la accion periferica de la toxina sobre la ereccion se refiere a la relajacion de las porciones del cuerpo cavernoso cuando la toxina se aplica directamente sobre esta preparacion in vitro (NUNES et al., 2010a, 2010b, 2012).

Matavel et al (2009), utilizando herramientas de modelado molecular, indicaron algunos aminoacidos del PnTx2-6, en epttopo desconocido, que supuestamente interactua con el canal de sodio. En este contexto, la smtesis qmmica de una secuencia peptfdica parcial del PnTx2-6 que abarca estos aminoacidos abre nuevas perspectivas para las caracterizaciones estructurales y farmacologicas de la interaccion de las moleculas con sus receptores. Ademas, la smtesis peptfdica, relativamente simple y con posibilidad de alto rendimiento, podna proporcionar el material necesario para el estudio farmacologico en diferentes tejidos, superando la limitacion observada con el material obtenido por purificacion del veneno o incluso por expresion heterologa, que es diffcil y costoso (MATAVEL, A. et al. Biochemistry 48(14), 3078-3088, 2009). Por lo tanto, en la presente tecnologfa se ha desarrollado el peptido sintetico modificado PnTx(19), que exhibe una cadena polipeptfdica corta de 19 aminoacidos, que permite obtenerla facilmente con fines comerciales, proporcionando el desarrollo de composiciones farmaceuticas para su uso en el tratamiento de la disfuncion erectil y/o en la potenciacion de la funcion erectil. Ademas, en la presente tecnologfa se demostro que este peptido induce la liberacion de glutamato en sinaptosomas cerebrocorticales de ratas, estimula la relajacion de cortes de cuerpos cavernosos de ratones y ratas, exhibe un menor efecto toxico con respecto a la toxina nativa de la cual se deriva, y ademas no muestra toxicidad cardfaca, a diferencia del Viagra presente en el mercado. Tambien es efectivo en animales hipertensos y exhibe baja inmunogenicidad.

En la tecnica anterior, existen nuevas formulaciones a base de polipeptidos derivados del veneno de arana, como se divulga en la solicitud WO2009083808, titulada "COMPOSITINS AND METHODS FOR TREATING ERECTILE DYSFUNCTION", que describe composiciones que comprenden un polipeptido aislado del veneno de la arana viuda negra (Latrodectus mactans) y fragmentos biologicamente activos de los mismos. Sin embargo, no se encontro ningun peptido similar al de la presente invencion para el tratamiento de la disfuncion erectil.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Cromatograffa de fase inversa en sistema de HPLC de los productos de la smtesis del peptido PnTx(19). Columna preparatoria Sphasil peptido C8 5|j ST 4,6/100, equilibrado con agua Milli-Q 0,1 % TFA (en volumen) elrndo con un gradiente de 0 a 25 % de solucion B (0,1 % TFA/acetonitrilo v/v) en 3 minutos, 25 a 35 % de B en 30 minutos y 35 a 100 % de la solucion B en 5 minutos, a una rata de flujo de 2,0 ml/minuto.

Figura 2: Espectrometna de masas de la fraccion que contiene el peptido sintetico PnTx(19). La masa molecular del PnTx(19) de 2484.9 Da fue determinada por MALDI-TOF.

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Figura 3: Viabilidad sinaptosomal: verificada por la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa, que oxida el NADH a NAD+. Este ultimo determina una reduccion en la lectura (339nm), que permite calificar la actividad enzimatica. La mezcla de reaccion se incubo durante 60 minutos con PnTx(19) (10-5 M; 3x10-5 M; 10-6 M; 3x10-6 M) y el porcentaje de actividad evaluado con respecto a la lisis provocada por Triton X-100, considerado= 100 % de lisis. La actividad de esta enzima es proporcional a la rotura de los sinaptosomas, ya que se trata de una enzima del compartimento intracelular.

Figura 4: Efecto de diferentes concentraciones del PnTx(19) en la liberacion de L-glutamato - Placa ELISA que contiene 300 pl/pozo de la mezcla de sinaptosoma (10 % del volumen final) y NADP+ (concentracion final de 1 mM) en KRH con calcio (2 mM), se monitorizo y se mantuvo a 37 °C bajo agitacion constante. Se llevo a cabo la lectura de la fluorescencia en el espectrofluonmetro durante 2.460 segundos. La enzima GDH (35 unidades para el volumen final de 300 pl) se anadio a los pozos a los 60 segundos; a los 660 segundos, en diferentes pozos, se agregaron diferentes concentraciones de PnTx(19) ("10-5M, 3x10-5 M, 10-6 M y 3x10-6 M") y el KCI (33 mM). Como controles negativos, se usaron pozos que contienen sinaptosomas sin tratar con la toxina. Los resultados exhiben el promedio y el error estandar de dos experimentos independientes, llevados a cabo por triplicado. * P<0,05 representan los niveles de significancia de los ensayos en comparacion con el control, representado por los sinaptosomas no tratados.

Figura 5: Efectos de la toxina PnTx2-6 y del peptido PnTx(19) (1x10-6M) sobre la relajacion de las tiras de los elementos cavernosos de los ratones. Las tiras se precontrajeron con fenilefrina (10-5 M) y se relajaron con acetilcolina (10-4M) control, PnTx2-6 (5x10-8M) y PnTx(19) (x10-6 M) (n=3).

Figura 6: Efectos del peptido PnTx-19 y de la toxina PnTx2-6 en la corriente cardfaca de sodio. A: Efecto de la toxina PnTx2-6 en el pico de corriente de sodio (flecha negra) y en la corriente de inactivacion (flecha gris). C: efecto del peptido PnTx-19 en el pico de la corriente de sodio y en la corriente de inactivacion. D: Curso de tiempo de pico en la corriente de sodio, durante la perfusion de PnTx-19 y PnTx-26. Cada cfrculo negro indica la amplitud del Ina, medida cada 1 segundo en un potencial de membrana de -20 mV. Las barras grises indican el momento en que la celula se expuso a PnTx2-6 o PnTX-19 (peptido). Los graficos de barras resumen los efectos de PnTx2-6 500 nM (n=7) y del peptido PnTx-19 (peptido) 1 pM (n=12) en la constante de descomposicion (E) y la reduccion de la corriente de sodio (F). Las barras indican promedio ± SEM, * p<0,05 con respecto a los controles.

Figura 7: Curva de dosis de respuesta del peptido PnTx-19 y de la toxina PnTx2-6 en la presion ventricular derecha (A) y (B), derivada ±dP/dt (C y D) y frecuencia cardfaca (E) de las ratas.

Figura 8: Analisis del tftulo de anticuerpos. A) Control: adyuvante (hidroxido de aluminio). B) tftulo de anticuerpos despues de la administracion del peptido PnTx-19 (10 pG) en dfas diferentes.

Descripcion detallada de la tecnologia

La presente invencion comprende el peptido PnTx(19), NH3-GERRQYFWIAWYKLANSKK-COOH (SEQ ID No.1), sintetizado qmmicamente utilizando la estrategia de smtesis Fmoc/t-butilo sobre soporte solido (MERRIFIELD, R. B. Solid-phase peptide synthesis. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. (32), 221-296, 1969). El peptido tiene 19 residuos de aminoacidos, es lineal y se diseno a partir de la probable estructura tridimensional del PnTx2-6 propuesto despues del analisis para estudios de bioinformatica y modelado molecular. Esto abarca el "nucleo" hidrofobo y los residuos positivamente graficados que rodean esta region, los cuales, de acuerdo con los estudios de modelado molecular, son responsables de la interaccion de la toxina con el canal de sodio (MATAVEL et al., 2009). La secuencia (epftopo discontinuo) desarrollada a partir de estos estudios de modelado molecular experimento modificaciones cruciales en la presente invencion, de modo que se pudo mantener su actividad en la funcion erectil: el aminoacido cistema, en la posicion 17, se reemplazo por serina, y el peptido se sometio a amidacion en la porcion terminal C y fue acetilada en la porcion terminal N, con la vision de aumentar la solubilidad de la misma.

Las pruebas de actividad demostraron que PNTx(19), al igual que PnTx2-6, interfiere con el sistema glutamatergico en los sinaptosomas cerebrocorticales de ratas.

Se usaron diferentes concentraciones del peptido, y se encontro que, en la dosis de 3x10-5M, PnTx(19) indujo un aumento en la liberacion de glutamato en sinaptosomas cerebrocorticales de ratas (Figura 4).

La accion del peptido en la ereccion se verifico mediante el uso de tiras de cuerpos cavernosos aislados de ratones. PnTx(19) 1 pM proporciono una relajacion significativa de latira del cuerpo cavernoso de ratones, aproximadamente 80 % (Figura 5), una accion similar a la provocada por 50 nM de PnTx2-6 y 100 pM de acetilcolina. Probablemente, la relajacion del cuerpo cavernoso se debe a la conexion del peptido lineal a los canales de sodio en el cuerpo cavernoso, desencadenando los sucesos posteriores en la ruta de ereccion.

El desarrollo del peptido sintetico PnTx(19) permite obtener las mayores cantidades de la molecula activa con la posibilidad de disminuir los efectos toxicos con respecto a la toxina nativa PnTx2-6, que proporciona el desarrollo de composiciones farmaceuticas para el tratamiento de disfuncion erectil y/o en la potenciacion de la funcion erectil.

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Tales composiciones farmaceuticas se caracterizan por comprender un peptido sintetico y un excipiente o una mezcla de excipientes farmaceuticamente aceptables, en los que el peptido puede estar presente en forma libre o acoplado a sistemas de liberacion controlada. Los sistemas de liberacion controlada pueden incluir liposomas, ciclodextrinas, poUmeros biodegradables, capsulas, micro y nanocapsulas, microparticulas y nanopartfculas, preparaciones en bolo, bombas osmoticas, dispositivos de difusion, lipoesferas, sistemas de administracion transdermica y/o lfquidos que, cuando son sometidos a cambios en temperatura, forman un solido o un gel in situ. De esta manera, las composiciones farmaceuticas pueden administrarse por via oral, topica, intramuscular, intravenosa, subcutanea, por inhalacion, o mediante dispositivos implantables.

La presente invencion se puede entender mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no son limitativos de la tecnologfa.

Ejemplo 1: sintesis quimica en fase solida y purificacion del peptido PnTx(19)

El peptido sintetico llamado PnTx(19) (NH3-GlyGluArgArgGlnTyrPheTrpIleAlaTrpTyrLysLeuAlaAsnSerLysLys- OOOH) se diseno parcialmente mediante el uso del programa bioinformatico PEPOP. De esta manera, se propuso un epftopo discontinuo que contiene 19 aminoacidos para la toxina PnTx2-6 (FLEURY, Cecile, Bioinformatics tools dedicated to the study of the structure-function-antigenicity relationship in animal peptide toxins. Tesis doctoral, Departamento de Bioqmmica e Inmunologfa de la Universidad Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, 180 p., 2009).

Con la vision de aumentar la solubilidad del peptido, en la presente tecnologfa se ha sintetizado el PnTx(19) con modificaciones en la porcion terminal N (acetilacion) y la porcion terminal C (amidacion). El peptido PtTx(19) acetilado y amidado demostro ser soluble en agua.

El peptido PnTx(19) se purifico por cromatograffa de fase inversa (HPLC AKTA Explorer 10). El perfil cromatografico presentado en la Figura 1 demuestra la presencia de subproductos de sintesis y la fraccion referida al PnTx(19), que eluye con regulador B al 29 %. Despues de la purificacion, el analisis por espectrometna de masas (MALDI-TOF) mostro solo un grupo de especies moleculares en el espectro, cuya masa molecular era de 2484,970 Da (Figura 2), compatible con la masa esperada para el peptido PnTx(19).

Ejemplo 2: Prueba de viabilidad sinoptosomal

Se decapitaron ratas adultas (240-300 g), los cerebros se extrajeron rapidamente, se sumergieron en solucion de homogeneizacion (sacarosa 0,32 M, EDTA 1Mm y ditiotreitol (DTT) 0,25 mM, pH=7,4) y se guardaron en hielo, luego se usaron para preparar los sinaptosomas, como se describio previamente por Dunkley et al 1988 (DUNKLEY, PR, Brain Research, 441, 59-71, 1988).

Como control de la viabilidad de los sinaptosomas y tambien para verificar una posible actividad lttica del peptido, se llevaron a cabo pruebas de actividad de la enzima lactato deshidrogenasa, de acuerdo con Kubowistz, Ott, 1943 (KUBOWISTZ, F., OTT, C. Biochem Z. 319, 94-117, 1943).

La actividad de LDH se evaluo en condiciones de control, en presencia de Triton X-100 al 1 % (100 % de lisis) y en presencia de PnTx(19) en las siguientes concentraciones 10-5 M; 3x10-5 M; 10-6 M; 3.x10-6 M.

Los resultados de la Figura 3 demuestran que el peptido no afecta la viabilidad sinaptosomica y/o la maquinaria exodtica, ya que los valores obtenidos fueron del 3,4 % de lisis para la concentracion de 10-5 M; 2 % de lisis para la concentracion 3x10-5 M; 6 % de lisis para la concentracion 10-6 M; 9 % de lisis para la concentracion de 3x10-6 M, valores comparables con el control (ausencia del peptido).

Ejemplo 3: Efectos de la toxina PnTx2-6 y del peptido PnTx(19) sobre tiras de cuerpos cavernosos de ratones

Los ratones fueron sacrificados por decapitacion, su pene fue removido quirurgicamente y colocado en una placa de Petri que contiene bicarbonato Krebs Ringer (NaCl, 118,1; KCl, 4,7; KH2PO4, 1,0; MgSo4, 1,0: NaHCO3, 25,0; CaCl2, 2,55; y Glucosa, 11,1mM), burbujeado con una mezcla de O2 al 95 % y CO2 al 5 %. La glandula, el cuerpo esponjoso y la uretra se eliminaron y los cuerpos cavernosos se disecaron con la eliminacion de la tunica albuginea y se separaron cortando el tabique fibroso entre ellos. Las tiras de cuerpos cavernosos que miden aproximadamente 1x1x7 mm se montaron por separado en una camara, un extremo del mismo se aseguro a un electrodo y el otro se unio a un transductor.

Las camaras conteman Krebs (pH 7,4) a 37 °C, equilibrado con O2 al 95 % y CO2 al 5 %.

El tejido se estiro con una fuerza pasiva de 2,0 mN y se estabilizo durante 60 minutos, reemplazandose la solucion cada 15 minutos. Los cambios en la fuerza isometrica se registraron utilizando un transductor de fuerza isometrica (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, Estados Unidos), conectado a un amplificador (modelo TBM-4, World Precision Instruments, Inc., Estados Unidos), utilizando software Adquisicion de datos WinDaq (Dada®

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Instruments, Estados Unidos). Para evaluar la capacidad contractil de las preparaciones, se anadio una solucion de KCI (120 mM) a los cortes de cuerpos cavernosos y luego la preparacion se lavo con Krebs tres veces.

Los cortes de cuerpo cavernoso se precontrajeron con fenilefrina (100-5 M) y la relajacion fue provocada por acetilcolina 10-4M (control), PntX2-6 (5x10-6M) y el peptido PnTx(19) (1x10-6M).

La Figura 4 muestra que la toxina PnTx2-6 (5x10-8 M) y el peptido PnTx(19) (10-6 M) inducen relajacion del 83 %, mientras que el control con acetilcolina (10-4 M) indujo 81,6 % de relajacion en tiras de cuerpos cavernosos de ratones precontrafdos por fenilefrina (10-5M). Estos resultados indican que tanto la toxina PnTx2-6 como el peptido PnTx(19) son activos en lostrozos relajados de los cuerpos cavernosos de los ratones.

Ejemplo 4: Efecto del peptido sintetico PnTx(19) en la liberacion de L-glutamato

La liberacion de L-glutamato se analizo de acuerdo con la propuesta de Nicholls et al. 1987 (NICHOLLS, D. et al. J. Neurochem. 49, 5057, 1987). Con el fin de evaluar si el peptido era capaz de inducir la liberacion de L-glutamato en sinoptosomas cerebrocorticales de ratas, al igual que la toxina nativa, se analizo su efecto en las siguientes concentraciones: 10-5M, 3x10-5M, 10-6M, y 2x10-6 M, Figura 5.

A partir de estos resultados, se observa que, en las condiciones experimentales, solo a la concentracion de 3x10-5M el peptido era capaz de inducir una liberacion significativa de L-glutamato, en comparacion con el control (ausencia de PnTx19).

Ejemplo 5: Efectos del peptido PnTx-19 en el corazon Efecto en la corriente de sodio

Se llevaron a cabo experimentos de pinza con parche con la vision de analizar los efectos de la toxina PnTx2-6 y del peptido PnTx-19 en los canales de Nav1.5 de sodio, presente en cardiomiocitos. Los registros evidenciaron que la toxina PnTx2-6 causa una disminucion en el pico de corriente de sodio, retrasando la corriente de inactivacion. Estos efectos no se observaron para PnTx-19 (Figura 6A y C). En la Figura 6B, se observa que PnTx2-6 promovio una reduccion de la densidad de la corriente de sodio, y este fenomeno no se observo en presencia del peptido (Figura 6 D).

Efecto sobre la presion ventricular, la frecuencia cardiaca y la derivada ±dP/dt

Las ratas se mantuvieron bajo un ciclo controlado de 12 horas de luz/oscuridad a una temperatura estable con acceso libre a agua y alimento. Fueron decapitados de 10 a 15 minutos despues de la inyeccion intraperitoneal de heparina (200 UI). Se abrio el torax, se diseco y perfundio cuidadosamente el corazon a traves de una punta aortica con solucion de Krebs-Ringer (KRS) que contema (en mmol/l) NaCl (118,4), KCI (4,7), KH2PO4 (1,2), MgSo4.7H2O (1,2), CaCl2.2H2O (1,25), glucosa (11,7) y NaHCO3 (26,5). El flujo de perfusion se mantuvo constante (10 ml/min) a 37 °C y bajo oxigenacion constante (CO2 al 5 % y O2 al 95 %). Se inserto un globo conectado a un transductor de presion en el ventnculo derecho, y se monitorizo la presion ventricular, la frecuencia cardfaca y la derivada ±dP/dt (Figura 7). El volumen del globo se ajusto a una presion diastolica final de aproximadamente 10 mm de Hg. Despues de un penodo para alcanzar el equilibrio (30 a 40 minutos), se inyectaron 100 pmol/l de portador (control), toxina a concentraciones de 37,8 nmol/l-3,78 pmol/l o un peptido a concentraciones de 37,8 nmol/l-37,8 pmol/l en regulador de perfusion.

Como se muestra en la Figura 7, la toxina indujo un aumento dependiente de la concentracion, bajo la presion sistolica final del ventnculo derecho (RFVSP/PVsFd) y en +dP/dt, Y -dp/dt, como maximo en 66,7 ± 13,55 %, y 61,6 ± 9,89 %, respectivamente (Figura 7 A; C y D). Sin embargo, la toxina no altero la presion diastolica final y la frecuencia cardfaca. Por el contrario, el peptido no altero ninguno de estos parametros, incluso a altas concentraciones (Figura 7B y E).

Los resultados son el promedio ± SEM. Los analisis de la varianza unidireccional (ANOVA), seguidos de la prueba posterior de Newman-Keuks, se usaron para analizar los parametros en corazones aislados. Para analisis estadfsticos se considero p <0,05.

Ejemplo 6: Inmunogenicidad del peptido PnTx-19

Ratones suizos, machos, de 20-23 gramos se dividieron en 2 grupos (Control-Adyuvante: hidroxido de aluminio Figura 8A y PnTx-19 -10|iG Figura 8B), conteniendo cada grupo 4 animales. Los ratones fueron inmunizados por via subcutanea. 21, 35 y 49 dfas desde la primera inoculacion, los ratones recibieron un refuerzo de las preparaciones mencionadas anteriormente. Para verificar la presencia de anticuerpos contra el PnTx-19, el suero recogido de las colas del raton se evaluo 15, 30, 40 y 60 dfas despues de la primera inoculacion mediante el ensayo inmunoenzimatico indirecto (ELISA), como se describe para otras preparaciones (DEL PINO, F.A.B., BRANDELLI, A., GONZALES, J.C., HEnRiQUeS, J.A.P., DEWES, H., Effect of antibodies against -N-acetylglucosaminidase on reproductive efficiency of the bovine tick Boophilus microplus. Vet. Parasitol. 79, 247-255, 1998).

La inmunogenicidad de PnTx19 se evaluo despues de la inyeccion subcutanea de 10 |jg de la misma (Figura 8B). No se observaron reacciones de hipersensibilidad o muerte de los animales durante los ensayos. Uno encontro un aumento menor en el tftulo de los anticuerpos en el grupo 2 (PnTx-19, 10 jg) 60 dfas despues de la primera inoculacion del peptido (Figura 8B). Es importante senalar que la dosis de peptido de 10 jg es aproximadamente 5 12,5 veces mayor que la DL50 estimada para la toxina PnTx2-6 (0,79 pg/raton) (CORDEIRO M.N., DINIZ C.R.,

VALENTIM A.C., VON EICKSTEDT, GILROY J., RICHARDSON M. The purification and amino acid sequences of four Tx2 neurotoxins from the venom of the Brasilian 'armed' spider Phoneutria nigriventer (Keys). FEBS Lett. 310, 153-156, 1992).

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un peptido sintetico caracterizado porque comprende la secuencia GERRQYFWIAWYKLANSKK (SEQ ID No. 1).
2. 2. El peptido sintetico de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque exhibe modificaciones en la porcion 5 terminal N por acetilacion y porcion C terminal por amidacion.
3. 3. El peptido sintetico de acuerdo con la reivindicacion 1, para su uso como medicamento para el tratamiento de sujetos afectados por la disfuncion erectil y/o para potenciar la funcion erectil.
4. 4. Una composicion farmaceutica caracterizada porque comprende el peptido sintetico representado por la secuencia SEQ ID No.1, y un excipiente o una mezcla de excipientes farmaceuticamente aceptables.

   10 5. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizada porque el peptido esta presente

   de forma libre o acoplado a un sistema de liberacion controlada, seleccionado del grupo que comprende liposomas, ciclodextrinas, polfmeros biodegradables, capsulas, micro y nanocapsulas, micro y nanopartfculas, preparacion de bolo, bombas osmoticas, dispositivos de difusion, lipoesferas, sistemas de administracion transdermica y/o lfquidos que, cuando se someten a cambios de temperatura, forman un solido o un gel in situ.

   15 6. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 4 para su uso como un medicamento para

   administrar por via oral, topica, intramuscular, intravenosa, subcutanea y por inhalacion, o mediante un dispositivo implantable.
5. 7. La composicion farmaceutica de acuerdo con las reivindicaciones 4 y 5 para su uso como medicamento para el tratamiento de individuos afectados por la disfuncion erectil y/o para potenciar la funcion erectil.

   20 8. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6 para el tratamiento de personas

   afectadas por la disfuncion erectil y/o para potenciar la funcion erectil.