JP2009057318A - S−ニトロソ基含有アルブミン及びその製造方法ならびに抗がん剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、アルブミンを構成するアミノ酸配列における少なくとも1つのリジンにS−ニトロソ基が導入されてなるS−ニトロソ基含有アルブミン及びS−ニトロソ基を有するアルブミンを含む抗がん剤である。
【選択図】図1
Description
また、NOは、周囲の環境に応じて酸化反応を受け、様々な反応性窒素酸化物を生じ、二面的な生理・病態生理活性を発揮すると考えられている。
NOは、有益な作用として抗酸化作用、抗アポトーシス作用を有するため、これまでに、虚血性疾患及び臓器移植時におけるNOの投与が検討され、治療効果が得られている。
一方、NOの有害な作用としてアポトーシス促進、細胞障害性等が知られており、最近、この性質を利用した癌化学療法への応用研究が活発に行われている。
さらに、in vivoでも癌モデル動物に対して癌治療効果が報告されている(非特許文献1)。
しかし、現在までにS−ニトロソアルブミンの癌に対する検討例は報告されていない。
Rigas B et al. Trends Mol Med. 2004, 10, 324-330 Hallstrom S et al. Circulation. 2002, 105, 3032-3038 Ishima Y et al. J Pharmacol Exp Ther. 2007, 320, 969-977
このS−ニトロソ基含有アルブミンは、さらに、前記アルブミンを構成するアミノ酸配列における少なくとも1つのシステインにS−ニトロソ基が導入されてなることが好ましい。
また、前記アルブミン1分子に、S−ニトロソ基が3個以上導入されてなることが好ましい。
さらに、前記アルブミンが、配列番号1に記載のアルブミン又は該アルブミンのアミノ酸配列中の410番目のアルギニンがシステインに置換されたものであることが好ましい。
この抗がん剤は、前記アルブミンが、配列番号1に示すアミノ酸配列中の410番目のアルギニンがシステインに置換されたものであることが好ましい。
また、前記S−ニトロソ基を有するアルブミンが、前記置換されたシステインのチオール基に置換されたS−ニトロソ基を有することが好ましい。
アルブミンを構成するアミノ酸配列における少なくとも1つのアミノ酸にチオール基を導入し、
該チオール基をニトロソ化反応に付す工程を含むことを特徴とする。
この方法では、チオール基を導入するアミノ酸が少なくとも1つのリジンであることが好ましい。
また、本発明の抗がん剤は、そもそも生体内に存在する内因性のアルブミンを基本とするため、副作用の潜在性が低い制がん剤を提供することが可能となる。
さらに、本発明のS−ニトロソ基含有アルブミンの製造方法は、反応条件等を適宜調整することにより、容易にS−ニトロソ基のアミノ酸への導入を可能とするとともに、S−ニトロソ基の導入個数を制御することができ、癌細胞に対する抑制効果と、副作用とのバランスを図ることが可能となる。
また、本発明の抗がん剤は、S−ニトロソ基を有するアルブミンを含んで構成される。
天然のアルブミンとは、ヒトの体内において血液及び細胞間液をはじめ幅広く分布しているタンパク質を意味する。また、ヒト以外の哺乳動物(例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等)由来のアルブミンであってもよい。さらに、血液及び細胞間液の血清アルブミンみならず、卵アルブミン、筋アルブミン(ミオゲン)等であってもよい。このような天然のアルブミンは、例えば、配列番号1に示すアミノ酸配列を有する。
特に、S−ニトロソ基の導入数を増加させるために、配列番号1に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸を別のアミノ酸に置換したタンパク質も包含される。このように、1以上のアミノ酸が別のアミノ酸に置換されているにもかかわらず、上述したような血流中で正常な浸透圧を維持し、血中の液体含量を維持する機能を有することが知られているアルブミンとしては、配列番号1に示すアミノ酸配列中の410番目のアルギニンをシステインに置換したアルブミンが挙げられる。
例えば、チオール化試薬(例えば、2−イミノチオラン又はその塩等)を用いて、リジンのε−アミノ基に導入する方法が最も好適である。また、例えば、グルタミン酸のカルボン酸残基に、アミノリシス反応によって、アミノ基とチオール基とを有する化合物(例えば、2−アミノエタンチオール等)を導入する方法、リジンのε−アミノ基に、アミノリシス反応によって、カルボン酸とチオール基とを有する化合物(例えば、2−カルボキシエタンチオール等)を導入する方法等が挙げられる。
このチオール化反応は、例えば、アルブミンとチオール化試薬のモル比、反応時間、反応温度等を調整することにより、アルブミン中に存在するリジンのε−アミノ基に対して任意の数でチオール基を導入することができる。例えば、アルブミン:チオール化試薬のモル比としては、1:5〜1:200程度、1:10〜1:100程度が挙げられる。反応時間は、1分〜10時間程度、さらに10分〜2時間程度が適している。反応温度は、例えば、室温程度が適している。
なお、この反応を行う前には、チオール基を還元しておくことが好ましい。チオール基の還元は、例えば、1,4−ジチオスレイオール等を用いることにより行うことができる。
抗がん剤は、S−ニトロソ基を有するアルブミンをそのまま使用してもよいが、通常は、製剤学的、薬理学的に許容し得る製剤用添加剤、賦形剤等を用いて製剤化することが好ましい。
制がん剤の剤形は、上記経路での投与に適切な形態とすることができ、例えば、注射剤、パッチ剤、パップ剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、舌下錠、クリーム剤、ローション剤、粉剤等が挙げられる。また、生分解性のリポソーム、マイクロカプセル又はマイクロスフェア内に封入されていてもよいし、凍結乾燥形態で製剤化されていてもよい。
溶液又は懸濁液とする場合には、例えば、日本薬局方で規定される溶液であればどのようなものでも用いることができ、主に水(注射用水)、生理食塩水及び各種緩衝液(例えば、リン酸緩衝液)等を用いることができる。
また、1単位形態あたりのS−ニトロソ基を有するアルブミンは、特に限定されないが、例えば、1〜1000mg程度、好ましくは10〜100mg程度含有する注射剤として調製することが適している。
実施例1
以下の手順で本発明の抗がん剤を製造した。
25%(w/v)の遺伝子組換えヒト血清アルブミン(配列番号1、株式会社バイファ社提供)の生理食塩水溶液20mLを、濃度が0.5mMとなるように、ジエチレントリアミン五酢酸を添加した0.1Mリン酸カリウム溶液(pH7.8)480mL中に混合した。これに2−イミノチオラン塩酸塩を206.45mg添加し、室温で1時間反応させた。
その後、亜硝酸イソペンチルを1mL添加し、3時間反応された。反応液の濃縮を行い、溶媒を生理食塩液に置換した。
タンパク質定量及びNOの定量を行ったところ、アルブミン一分子あたりのS−ニトロソ基の導入数は、約6個(N=3)であった。
次に、アルブミンの濃度1mMの生理食塩水溶液を調整し、滅菌濾過を行うことにより、本発明の抗がん剤を製造した。
下記の実験例1〜3において、本発明の抗がん剤と比較として、遺伝子組換えヒト血清アルブミン(配列番号1、株式会社バイファ社提供)の生理食塩水溶液(100μM)を調製した。
下記の実験例1のために、本発明の本発明の抗がん剤の比較として、生理食塩水を調製した。
下記の実験例3のために、本発明の本発明の抗がん剤の比較として、リン酸緩衝液を調製した。
マウス結腸癌由来癌細胞のC26細胞(東北大学加齢医学研究所提供)をBalb/cマウスの背部皮下に106個移植し、癌モデルマウスを作製した。
癌細胞移植3日後にS−ニトロソ基を有するアルブミンの溶液(実施例1)を10μmol/kgの投与量で10日間連続で静脈内投与を行った。
対照として遺伝子組換えヒト血清アルブミン溶液(比較例1)及び生理食塩液(比較例2)を同様に静脈内投与した。
癌細胞移植後の経過時間と癌容積の変化を図1のグラフに示す。
なお、癌容積は癌の長径(a)及び短径(b)をノギスを用いて測定し、0.4×a×b2で算出した。
図1の結果から明らかなように、本発明のS−ニトロソ基を有するアルブミンは、生理食塩液投与群及びアルブミン投与群に比べて有意に癌の増殖が抑制されていた。
C26細胞に対する本発明のS−ニトロソ基を有するアルブミンの増殖抑制を評価した。具体的には、C26細胞懸濁液(1×105個/ml RPMI−1640培地(10%FCS))を調整した後、この細胞懸濁液を96ウェルプレートに播種し(1×104細胞/ウェル)、CO2インキュベーター内で32時間培養した。さらに、S−ニトロソ基を有するアルブミンを添加した。ここで、S−ニトロソ基を有するアルブミンは、25、50及び100μMの3種類の濃度で添加した。対照として、遺伝子組換えヒト血清アルブミン(比較例1)を用いた。
48時間培養後、Cell Counting Kit−8溶液(WST−8)を添加し、37℃で2時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
その結果を図2に示す。
図2の結果から明らかなように、本発明の抗がん剤は、遺伝子組換えヒト血清アルブミン溶液(比較例1)と比較して、濃度依存的にC26細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。
本発明のS−ニトロソ基を有するアルブミンのアポトーシス誘導作用につい評価した。具体的には、C26細胞懸濁液(1×105個/ml RPMI−1640培地(10%FCS))を調整した後、この細胞懸濁液を96ウェルプレートにを播種し(1×106細胞/ウェル)、CO2インキュベーター内で12時間培養した。さらに、S−ニトロソ基を有するアルブミンを添加した。ここで、S−ニトロソ基を有するアルブミンは、25、50及び100μMの3種類の濃度で添加した。対照として、遺伝子組換えヒト血清アルブミン(比較例1)及びリン酸緩衝液(比較例3)を用いた。
24時間培養後にトリプシン処理を行い、細胞を回収した後、4000rpm、5分間遠心し、上清を取り除いた。細胞のペレットに200μLのPBSを加え、再浮遊させ、4000rpm、10分間遠心し、上清を取り除いた。細胞を20μLの細胞溶解緩衝液を加え攪拌後、4℃で10分間放置し、15000 rpmで5分間遠心した。上清を回収し、これに1μLのRNase A溶液を加え、50℃で30分間インキュベートし、さらに1μLのproteinase Kを加え、50℃で1時間インキュベートした。抽出されたDNAは2%アガロースゲルで電気泳動を行った。
図3の結果から明らかなように、本発明のS−ニトロソ基を有するアルブミン(実施例1)は高濃度の時、C26細胞に対し、DNAの断片化を引き起こすことが明らかとなった。従って、本発明のS−ニトロソ基を有するアルブミンは癌細胞に対し、アポトーシスを誘導することで抗がん効果を発揮することが示唆された。
Claims (9)
- アルブミンを構成するアミノ酸配列における少なくとも1つのリジンにS−ニトロソ基が導入されてなるS−ニトロソ基含有アルブミン。
- さらに、前記アルブミンを構成するアミノ酸配列における少なくとも1つのシステインにS−ニトロソ基が導入されてなる請求項1に記載のS−ニトロソ基含有アルブミン。
- 前記アルブミン1分子に、S−ニトロソ基が3個以上導入されてなる請求項1に記載のS−ニトロソ基含有アルブミン。
- 前記アルブミンが、配列番号1に記載のアルブミン又は該アルブミンのアミノ酸配列中の410番目のアルギニンがシステインに置換されたものである請求項1に記載のS−ニトロソ基含有アルブミン。
- S−ニトロソ基を有するアルブミンを含む抗がん剤。
- 前記アルブミンは、配列番号1に示すアミノ酸配列中の410番目のアルギニンがシステインに置換されたものである請求項5に記載の抗がん剤。
- 前記S−ニトロソ基を有するアルブミンが、前記置換されたシステインのチオール基に置換されたS−ニトロソ基を有する請求項5又は6に記載の抗がん剤。
- アルブミンを構成するアミノ酸配列における少なくとも1つのアミノ酸にチオール基を導入し、
該チオール基をニトロソ化反応に付す工程を含むS−ニトロソ基含有アルブミンの製造方法。 - チオール基を導入するアミノ酸が少なくとも1つのリジンである請求項8に記載の方法。
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