JP2015535808A - 合成ポリペプチドＰｎＴｘ（１９）、医薬組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＰｎＴｘ（１９）という１９アミノ酸の合成ペプチドに関し、当該ペプチドは、フォネウトリア・ニグリヴェンテル（Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ）クモ由来の毒素ＰｎＴｘ２−６の配列から構成される。また、本発明は、そのようなペプチドを含有する医薬組成物、及びその勃起機能不全を呈する対象の治療、及び／又は勃起機能の増強における使用にも関する。【選択図】図５

Description

本発明は、ＰｎＴｘ（１９）という１９アミノ酸の合成ペプチドに関し、当該ペプチドは、フォネウトリア・ニグリヴェンテル（Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ）クモ由来の毒素ＰｎＴｘ２−６の配列から構成される。また、本発明は、そのようなペプチドを含有する医薬組成物、及びその勃起機能不全を呈する対象の治療、及び／又は勃起機能の増強における使用にも関する。

「アランハ−アルマデイラ（ａｒａｎｈａ−ａｒｍａｄｅｉｒａ）」（「アームドスパイダー」）として一般に知られるフォネウトリア・ニグリヴェンテル（Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ）クモの毒素は、イオンチャンネル及び受容体に主に作用する様々な医薬的効果を有する生理活性ポリペプチドに富んでいる。この毒素により引き起こされる主症状は、一般的な過興奮（ｈｙｐｅｒ−ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ）に起因する。研究により、この毒素の毒性は、ＰｈＴｘ２画分の効果に大幅に基づいていることが実証されている（ＢＲＯＧＥＳ， Ｍ． Ｈ． ｅｔ． Ａｌ． Ｉｎ： Ａｎｉｍａｌ Ｔｏｘｉｎ： Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔ． Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ． Ｍａｒｉａ Ｅｌｅｎａ ｄｅ Ｌｉｍａ， Ａｄｒｉａｎｏ Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｐｉｍｅｎｔａ， Ｍａｒｉｅ Ｆｒａｎｃｅ Ｍａｒｔｉｎ−Ｅａｕｃｌａｉｒｅ， Ｒｕｓｓｏｌｉｎａ Ｂｅｎｅｄｅｔａ Ｚｉｎｇａｌｉ ｅ Ｈｅｒｖｅ Ｒｏｃｈａｔ （ｏｒｇａｎｉｚａｄｏｒｅｓ）， Ｂｅｌｏ Ｈｏｒｉｚｏｎｔｅ−ＭＧ． Ｅｄｉｔｏｒａ ＵＦＭＧ． ８００ｐ． ２００９， ＧＯＭＥＺ， Ｍ．Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２２： ５／６， ２００２）。この画分から精製されたＰｎＴｘ２−６（ＭＭ ５．２９１．３ Ｄａ）は、マウス大脳内への注入後に、全画分の症状的効果を再現した（ＬＥ ＳＵＥＵＲ， Ｌ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． １０５， １２５−１３４，２００３）。その作用は、ナトリウムチャンネルの不活性化の流れの遅延が原因であり、また、当該毒素は、これらのチャンネルの幾つかのサブタイプにおいて、その活性化をより負電位にずらす（ＭＡＴＡＴＥＬ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ４８ （１４）， ３０７８−３０８８， ２００９； ＣＡＳＳＯＬＩ ｅｔ ａｌ．， ｃｏｍ． ｐｅｓｓｏａｌ ２０１２）。

ラットの勃起機能に対するＰｎＴｘ２の効果は、特許出願ＰＩ０８００５９６“Ｍｅｔｏｄｏ ｐａｒａ ａ ｐｏｔｅｎｃｉａｌｉｚａｃａｏ ｄａ ｆｕｎｃａｏ ｅｒｅｔｉｌ ａｔｒａｖｅｅｓ ｄｏ ｕｓｏ ｄａｓ ｃｏｍｐｏｓｉｃｏｅｓ ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｓ ｄｅ ｔｏｘｉｎａ Ｔｘ２−６ ｄａ ａｒａｎｈａ Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ”（ フォネウトリア・ニグリヴェンテル（Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ）クモ由来ＰｎＴｘ２−６毒素の医薬組成物による勃起機能の強化方法）において記載されており、正常血圧ラットにおける勃起を促進し、高血圧動物（ＤＯＣＡ−ｓａｌ）、及び糖尿病マウス又は高齢ラットに対して勃起機能を回復させる（ＮＵＮＥＳ， Ｋ．Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，９（１０）：２５７４−８１， ２０１２）。これらの効果は、一酸化窒素シンターゼ酵素（ＮＯＳ）の活性化及び硝酸（ＮＯ）の放出により誘導されてもおかしくない（ＹＯＮＡＭＩＮＥ， Ｃ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｏｘｉｃｏｎ ４４， １６９-１７２， ２００４； ＮＵＮＥＳ ｅｔ ａｌ．， ２００８， ２００９）。それに加えて、硝酸の経路に関与する幾つかの遺伝子がそれらの発現を有することが示唆されている。ＰｎＴｘ２−６毒素による処理後に、マウスの勃起組織内で促進される（ＶＩＬＬＡＮＯＶＡ， Ｆ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｔｏｘｉｃｏｎ． ５４（６）， ７９３−８０１， ２００９）。

一酸化窒素（ＮＯ）は、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）によりＬ−アルギニンが加水分解されて生産され、勃起プロセスの必須の媒介因子である［ＬＥＷＩＳ， Ｒ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ａ． Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ， ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｅｘｕａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｉｎ： Ｓｅｘｕａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ｓｅｘｕａｌ Ｄｉｓｆｕｎｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｎ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ， Ｌｕｅ， Ｔ． Ｆ．； Ｂａｓｓｏｎ， Ｒ．； Ｒｏｓｅｎ， Ｒ．； Ｇｉｕｌｉａｎｏ， Ｆ．； Ｋｈｏｕｒｙ， Ｓ．； Ｍｏｎｔｏｒｓｉ， Ｆ．， （Ｅｄｉｔｏｒｅｓ．） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｆｏｒ Ｓｅｘｕａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｐａｒｉｓ， ｐ． ３９−７２， ２００４］。非アドレナリン作用性非コリン作用性神経（ＮＡＮＣ）、一酸化窒素含有神経、及び内皮細胞によるＮＯの放出の後、ＮＯは、陰茎の平滑筋の小柱及び血管近傍に拡散して、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ＧＣＳ）の活性を刺激し、環状グアノシン一リン酸（ＧＭＰｃ）の濃度を増大させる（ＴＯＤＡ， Ｎｏ． ｅｔ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． １０６ （２）， ２３３−２６６， ２００５； ＰＲＩＥＴＯ， Ｄ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｐｏｔ． Ｒｅｓ （２０（１）， １７−２９， ２００８）。ＧＭＰｃの形成は、細胞内のカルシウムレベル減少を誘導して、平滑筋細胞の弛緩とその後の陰茎の勃起を引き起こす（ＴＯＴＡ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。勃起は、ホスホジエステラーゼ５型によるＧＭＰｃの加水分解により終了する（（ＩＧＮＡＲＲＯ， Ｌ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．， １７０， ８４３−５０， １９９０； ＲＡＪＦＥＲ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２６（２）， ９０−９４， １９９２； ＬＥＥ， Ｍ．Ｒ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ５０６３−５０６８， １９９７； ＢＩＶＡＬＡＣＱＵＡ， Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， ２１ （１２）， ４８４−４８９， ２０００）。

現在、勃起機能不全に使用される主な薬物治療は、シルデナフィル（バイアグラ）、タラダフィル（Ｃｉａｌｉｓ（登録商標））及びヴァルデナフィル（Ｌｅｖｉｔｒａ（登録商標））等の、ＰＤＥ−５阻害剤である（ＭＯＲＥＬＡＮＤ， Ｒ．Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． １０（３）， ９７−１０４， １９９９； ＰＲＩＶＩＥＲＯ， Ｆ．Ｂ． ｅｔ ａｌ Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｉｎ． ２８（６）， ７５１−７５５， ２００７； ＬＥＩＴＥ， Ｒ． ａｔ ａｌ． Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２（２）， １１９−１３２， ２００７）。しかしながら、ＰＤＥ−５阻害剤は、血管の疾患でＮＯの生産が阻害されている患者の治療には有効ではない。従って、ＰｎＴｘ２−６により誘導される海綿体の平滑筋の弛緩効果がＰＤＥ−５酵素の阻害とは独立しているため、当該毒素は、現在利用可能な医薬により治療し得ない勃起機能不全の患者に対して有効な医薬の生産を可能とする。

グルタミン酸塩（Ｌ−グルタミン酸塩又はＬ−ｇｌｕ）は、最も主要かつありふれた哺乳類におけるＣＮＳの興奮性神経伝達物質である。この物質は、認識及び記憶等の行動プロセスの生理学的基礎の一部であるシナプス可塑性を支持するメカニズムにおいて重要な役割を果たす。Ｌ−ｇｌｕは、神経系の発達、例えばシナプスの形成、リモデリング、除去、移動、増殖、神経分化、及び細胞死においても重要な機能を有する（（ＰＲＹＢＹＬＯＷＳＫＩ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７９， ９６７３−６， １９９４； ＭＣＫＩＮＮＥＹ， Ｒ．Ａ．． Ｊｏｕｒｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． ５８８ （１），１０７−１１６， ２０１０； ＭＡＮＥＮＴ， Ｊ．Ｂ．， ＲＥＰＲＥＳＡ， Ａ． Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，１３ （３）， ２６８−２７９， ２００７； ＳＣＨＬＥＴＴ， Ｋ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ６（１０）， ９４９−９６０， ２００６； ＶＥＣＩＮＯ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ４８ （８−９）， ９６５−９７４， ２００４）。グルタミン酸塩は、視床下部傍室核（ＰＶＮ）、腹側被蓋野（ＶＴＡ）、海馬等の勃起機能の調整に関与する幾つかの脳の領域を活性化することにより陰茎の勃起を促進出来る（ＡＲＧＩＯＬＡＳ， Ａ．， ＭＥＬＩＳ， Ｍ．Ｒ．． Ｐｒｏｇ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ４７， ２３５−２５５， １９９５； ＳＯＮＧ， Ｙ．， ＲＡＪＡＳＥＫＡＲＡＮ， Ｍ． Ｕｒｏｌｏｇｙ． ６４（６）， １２５０−１２５４， ２００４； ＭＥＬＩＳ Ｍ．Ｒ．， ＡＲＧＩＯＬＡＳ Ａ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｂｅｈａｖｉｏｒａｌ． Ｒｅｖｉｅｗｓ ３５， ９３９−９５５， ２０１１； ＵＣＣＵ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． ６１（１−２）， １８１−１８８， ２０１１）。

ＰｎＴｘ２−６の最初の毒性の試験は脳内注射により行われ、勃起を引き起こした（ＮＵＮＥＳ ｅｔ ａｌ．， ２００９）ことから、この毒素は、脳におけるこのシステムに対して作用すると考えられる。一方、皮下又は静脈内注射による勃起機能の強化の試験を目的としたこの毒素の他のインビボ試験が実施され、正の応答が認められた（ＮＵＮＥＳ， ２００８ｂ， ＮＵＮＥＳ ｅｔ ａｌ， ２００８ａ）。Ｙｏｎａｍｉｎｅらは、ヨウ素化ＰｎＴｘ２−６が、血管脳関門を透過し、ＣＮＳに直接効果を及ぼすことを見出した。発明者らは、テクネチウムでマークしたＰｎＴｘ−６を腹腔内投与しても陰茎には影響が無かったが、神経組織に少量投与すると影響があったことを示したことから、少なくともそれらの一部は血管脳関門を通過すると考えられる（ＮＵＮＥＳ ｅｔ ａｌ．， ２０１０ａ）。血管脳関門に対する前記毒素の研究は、初期段階では、この毒素がＣＮＳ内に侵入する可能性を理解することを目的としていた。知られていることは、末梢及び中枢経路の両方により注射されたＰｎＴｘ２−６毒素が、勃起を誘導出来ることである。この作用が起こることにより、そのメカニズムを評価出来る。勃起に対する前記毒物の末梢作用の具体的な結果は、斯かる毒素がこのインビトロ調製に直接適用されるとき、海綿体のスライスが弛緩することを示す（ＮＵＮＥＳ ｅｔ ａｌ． ２０１０ａ； ２０１０ｂ； ２０１２）。

Ｍａｔａｖｅｌら（２００９）は、分子モデリングツールを使用して、公知のエピトープにおけるＰｎＴｘ２−６の幾つかのアミノ酸が、ナトリウムチャンネルと相互作用することを示唆した。この報告において、これらのアミノ酸を含むＰｎＴｘ２−６の部分的ペプチド配列の化学合成が、当該分子とそれらの受容体との相互作用の構造的及び薬理学的特徴における新しい見通しが開かれる。ペプチド合成という比較的単純で高収量が見込める方法は、様々な組織に対する薬理学的研究に必須な材料を提供し、困難でコストのかかる毒素の精製又は組換え発現により取得される材料を用いた場合の制限を克服できる（ＭＡＴＡＶＥＬ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８（１４）， ３０７８−３０８８， ２００９）。従って、本発明において、１９アミノ酸の短いポリペプチド鎖を呈する改変合成ペプチドＰｎＴｘ（１９）が開発されたことにより、商業目的でそれを容易に取得し、勃起機能不全の治療及び／又は勃起機能の強化に使用される医薬組成物の開発を提供することが出来る。加えて、本発明において、このペプチドが、ラットの大脳皮質シナプトソームにおけるグルタミン酸塩の放出を誘導し、マウス及びラットの海綿体のスライスの弛緩を刺激し、それが由来する元の毒素に対する毒性効果の低下を呈し、更に、市場に存在するバイアグラと異なり、心臓への毒性を呈さないことが示された。また、高血圧の動物にも効果的で、免疫原性が低いことも示された。

従来技術において、ＷＯ２００９０８３８０８の“ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＥＲＥＣＴＩＬＥ ＤＹＳＦＵＮＣＴＩＯＮ”に記載されているように、クモ毒素由来のポリペプチドを基礎とした新しい製剤が存在し、当該文献は、クロゴケグモ（ラトロデクツス・マクタンス（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｍａｃｔａｎｓ））の毒素から単離されたポリペプチド及びその生物学的に活性な断片を含有する組成物を記載している。しかしながら、勃起機能不全の治療のための本発明に類似のペプチドは、当該文献には何ら記載されていない。

本発明は、ペプチドＰｎＴｘ（１９）、ＮＨ３−ＧＥＲＲＱＹＦＷＩＡＷＹＫＬＡＮＳＫＫ−ＣＯＯＨ（配列番号１）を含み、当該ペプチドは、固相担体上での合成のＦｍｏｃ／ｔ−ブチル戦略を使用して化学的に合成される（ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ， Ｒ． Ｂ． Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｒｅｌａｔ． Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （３２）， ２２１−２９６， １９６９）。当該ペプチドは１９残基のアミノ酸を有し、直鎖で、バイオインフォマティクスのための解析及び分子モデリングの研究の後に提示されたＰｎＴｘ２−６の予想三次元構造から設計された。このペプチドは疎水性の「コア」を有し、この領域を陽性に荷電した残基が囲み、分子モデリング研究によると、この構造は、前記毒素とナトリウムチャンネルとの相互作用に関与する（ＭＡＴＡＶＥＬ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。これらの分子モデリング研究から発達した配列（不連続エピトープ）は、その勃起機能における活性は維持されつつ、本発明において重要な改変を受け：１７位のアミノ酸システインがセリンに置き換えられ、当該ペプチドは、Ｃ末端部分がアミド化され、Ｎ末端部分がアセチル化され、その可溶性を増大させた。

活性の試験により、ＰｎＴｘ（１９）は、ＰｎＴｘ２−６と同様に、ラットの大脳皮質シナプトソームにおけるグルタミン酸作動性のシステムに干渉することが実証された。様々な濃度のペプチドが使用され、３ｘ１０^−５Ｍの用量で、ＰｎＴｘ（１９）は、ラットの大脳皮質シナプトソームにおけるグルタミン酸塩の放出の増大を誘導することが見出された（図４）。

勃起における前記ペプチドの作用は、マウスから単離された海綿体の切片を使用して評価された。１μＭのＰｎＴｘ（１９）は、５０ｎＭのＰｎＴｘ２−６及び１００μＭのアセチルコリンにより引き起こされるのと同様の約８０％のマウスの海綿体切片の顕著な弛緩を呈した。恐らく、海綿体の弛緩は、海綿体におけるナトリウムのチャンネルに対する前記直鎖ペプチドの結合によるもので、これがその後の勃起経路におけるイベントを引き起こす。

ＰｎＴｘ（１９）合成ペプチドの開発は、元の毒素ＰｎＴｘ２−６における毒性効果を低下させつつ十分な量の活性分子の取得を可能とし、当該技術は、勃起機能不全の治療及び／又は勃起機能の強化のための医薬組成物の開発を可能とする。

そのような医薬組成物は、合成ペプチド及び１つの賦形剤又は複数の医薬として許容される賦形剤の混合物を含有し、当該ペプチドが、調整放出系と組み合わせて、又は組み合わせずに存在し得ることを特徴とする。当該調整放出系は、リポソーム、シクロデキストリン、生分解性ポリマー、カプセル、マイクロカプセル、ナノカプセル、マイクロ粒子、ナノ粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、分散デバイス、脂肪球、経皮投与系、及び／又は温度変化に応じて体内で固体又はゲルを形成する液体を含み得る。このようにして、前記医薬組成物は、経口、局所、筋肉内、静脈内、皮下、吸入経路により、又は移植デバイスにより投与され得る。

図１は、ペプチドＰｎＴｘ（１９）の合成の産物のＨＰＬＣ系における逆相クロマトグラフィーを示す。調製カラムＳｐｈａｓｉｌペプチドＣ８ ５μ ＳＴ ４．６／１００、水Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ０．１％ ＴＦＡ （体積）でバランスをとり、０〜２５％溶液Ｂ（０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリルｖ／ｖ）勾配で３分以内、２５〜３５％のＢで３０分以内、そして３５〜１００％の溶液Ｂで５分以内に、流速２．０ｍｌ／分で溶出する。

図２は、合成ペプチドＰｎＴｘ（１９）を含有する画分の質量分析を示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、ＰｎＴｘ（１９）の分子量が２４８４．９Ｄａと判定された。

シナプトソームの生存率は、ＮＡＤＨを酸化してＮＡＤ＋にする乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性により評価された。ＮＡＤ＋は測定箇所（３３９ｎｍ）の数値の減少を判定し、酵素活性の定量を可能とする。前記反応混合物をＰｎＴｘ（１９）（１０^−５Ｍ； ３ｘ１０^−５Ｍ； １０^−６Ｍ； ３ｘ１０^−６Ｍ）と６０分間インキュベートし、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により起こる溶解（溶解１００％）と比較して活性パーセントが評価された。この酵素が細胞内成分であることを考慮すれば、この酵素の活性は、シナプトソームの破壊と比例する。

Ｌ−グルタミン酸塩放出における様々な濃度のＰｎＴｘ（１９）の効果を示す。カルシウムを含むＫＲＨ中の３００μｌ／ウェルのシナプトソーム混合物（最終体積の１０％）及びＮＡＤＰ＋（最終濃度１ｍＭ）を充填したＥＬＩＳＡプレートを定常撹拌下３７℃で維持してモニタリングした。分光光度計で２４６０秒間経口の読み取りを実施した。６０秒時点で酵素ＧＤＨ（最終体積３００μｌに３５単位）をウェルに添加し；６６０秒時点で、様々なウェルにおいて、様々な濃度のＰｎＴｘ（１９）（１０^−５Ｍ； ３ｘ１０^−５Ｍ； １０^−６Ｍ； ３ｘ１０^−６Ｍ）、及びＫＣｌ（３３ｍＭ）を添加した。陰性対照として、前記毒素で処理していないシナプトソームを含むウェルを使用した。結果は、３回実施された２つの独立した試験の平均及び標準誤差を示す。＊Ｐ＜０．０５は、対照（未処理シナプトソーム）と比較したアッセイの有意性のレベルを表す。

マウスの海綿体切片の弛緩に対する毒素ＰｎＴｘ２−６及びペプチドＰｎＴｘ（１９）（１ｘ１０^−６Ｍ）の効果を示す。当該切片はフェニルエフリン（１０^−５Ｍ）で予め収縮させており、アセチルコリン（１０^−４Ｍ）対照、ＰｎＴｘ２−６（５ｘ１０^−８Ｍ）及びＰｎＴｘ（１９）（ｘ１０^−６Ｍ）で弛緩させた（ｎ＝３）。

心臓ナトリウム電流におけるペプチドＰｎＴｘ−１９及び毒素ＰｎＴｘ２−６の効果を示す。Ａ−ナトリウム電流のピーク（黒矢印）及び不活性化電流（灰色矢印）に対する毒素ＰｎＴｘ２−６の効果を示す。Ｃ−ナトリウム電流のピーク及び不活性化電流におけるＰｎＴｘ−１９ペプチドの効果を示す。Ｄ−ＰｎＴｘ−１９及びＰｎＴｘ−２６のかん流中のナトリウム電流のピークのタイムコースを示す。各黒色の円は、Ｉｎａの振幅を示し、膜電位−２０ｍＶにおいて１秒ごとに測定されている。灰色のバーは、細胞がＰｎＴｘ２−６又はＰｎＴＸ−１９（ペプチド）に曝された瞬間を示す。棒グラフは、５００ｎＭのＰｎＴｘ２−６（ｎ＝７）及び１μＭのペプチドＰｎＴｘ−１９（ペプチド）（ｎ＝１２）の壊変定数（Ｅ）及びナトリウム電流（Ｆ）の減少に対する効果を要約したものである。バーは平均±ＳＥＭを示し、対照に対して＊ｐ＜０．０５である。

ラットの右心室圧（Ａ及びＢ）並びに誘導±ｄＰ／ｄｔ（Ｃ）における、ペプチドＰｎＴｘ−１９及び毒素ＰｎＴｘ２−６の応答用量曲線を示す。 ラットの誘導±ｄＰ／ｄｔ（Ｄ）及び心拍数（Ｅ）における、ペプチドＰｎＴｘ−１９及び毒素ＰｎＴｘ２−６の応答用量曲線を示す。

抗体力価の解析を示す。Ａ）対照：アジュバント（水酸化アルミニウム）。Ｂ）異なる日におけるペプチドＰｎＴｘ−１９（１０μＧ）の投与後の抗体力価。

本発明は、当該技術を限定するものではない下記実施例を参照して、更に良く理解され得る。

実施例１−ペプチドＰｎＴｘ（１９）の固相での化学合成及び精製
ＰｎＴｘ（１９）と呼ばれる合成ペプチド （ＮＨ３−ＧｌｙＧｌｕＡｒｇＡｒｇＧＩｎＴｙｒＰｈｅＴｒｐｌｌｅＡｌａＴｒｐＴｙｒＬｙｓＬｅｕＡｌａＡｓｎＳｅｒＬｙｓＬｙｓ−ＣＯＯＨ）は、バイオインフォマティクスプログラムＰＥＰＯＰを使用して部分的に設計された。この方法において、毒素ＰｎＴｘ２−６の１９アミノ酸を含む不連続エピトープが提案された（ＦＬＥＵＲＹ， Ｃｅｃｉｌｅ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｔｏｏｌｓ ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｏｘｉｎｓ． Ｄｏｃｔｏｒａｌ ｔｈｅｓｉｓ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｖｉｅｒｓｉｄａｄｅ Ｆｅｄｅｒａｌ ｄｅ Ｍｉｎａｓ Ｇｅｒａｉｓ， Ｂｅｌｏ Ｈｏｒｉｚｏｎｔｅ， ＭＧ， １８０ ｐ．， ２００９）。

ペプチドの溶解度を増大させるために、本発明において、Ｎ末端部分（アセチル化）及びＣ末端部分（アミド化）を修飾した合成ＰｎＴｘ（１９）を作製した。当該アセチル化及びアミド化ペプチドＰｎＴｘ（１９）は、水溶性であることが示された。

ペプチドＰｎＴｘ（１９）は、逆相クロマトグラフィーにより精製された（ＨＰＬＣ ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０）。図１で示すクロマトグラフィープロフィールは、副産物が合成されることと、ＰｎＴｘ（１９）を含む画分が２９％緩衝剤Ｂで溶出することを示す。精製後の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）による解析は、スペクトル中に一群の分子種のみ存在することを示し、その質量はペプチドＰｎＴｘ（１９）の予想値に相当した。

実施例２−シナプトソームの生存
成体ラット（２４０〜３００ｇ）を断頭し、迅速に脳を取り出し、ホモジネート溶液（スクロース０．３２Ｍ、ＥＤＴＡ１Ｍ及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）０．２５ｍＭ、ｐＨ＝７．４）に浸し、氷中で維持し、それらを、Ｄｕｎｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ １９８８ （ＤＵＮＫＬＥＹ， Ｐ．Ｒ．； Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４４１， ５９−７１， １９８８）に記載されているように、シナプトソーム調製に使用した。

シナプトソームの生存の対照として、そしてペプチドの溶解活性の評価のために、Ｋｕｂｏｗｉｓｔｚ， Ｏｔｔ， １９４３ （ＫＵＢＯＷＩＳＴＺ， Ｆ．， ＯＴＴ， Ｃ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｚ． ３１９， ９４−１１７， １９４３）に従い、乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性の試験を実施した。

ＬＤＨ活性は、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１００％溶解）の対照条件下、及び１０^−５Ｍ；３ｘ１０^−５Ｍ；１０^−６Ｍ；３ｘ１０^−６Ｍの濃度のＰｎＴｘ（１９）の存在下で評価された。

図３の結果は、取得された数値が、１０^−５Ｍ濃度で３．４％溶解；３ｘ１０^−５Ｍ濃度で２％溶解；１０^−６Ｍ濃度で６％溶解；３ｘ１０^−６Ｍ濃度で９％溶解で、対照（ペプチド無し）と同程度であったことから、前記ペプチドが、シナプトソーム生存及び／又は開口分泌機構に影響しないことを示す。

毒素ＰｎＴｘ２−６及びペプチドＰｎＴｘ（１９）の、マウス海綿体切片に対する効果
マウスを断頭により殺し、陰茎を外科的に切り取り、Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸塩溶液（ＮａＣｌ， １１８．１； ＫＣｌ， ４．７； ＫＨ２ＰＯ４， １．０； ＭｇＳｏ４， １．０： ＮａＨＣＯ３， ２５．０； ＣａＣｌ２， ２．５５；及びＧｌｕｃｏｓｅ， １１．１ｍＭ）を含むペトリ皿に置き、９５％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２の混合物で瀑気した。腺、海綿体及び尿道を除去し、海綿体を白膜を取り除いて乾燥させ（ｄｅｓｉｃｃａｔｅ）、それらの間の線維性中隔を切ることにより分離した。測定用の海綿体切片１ｘ１ｘ７ｍｍをチャンバー中に個別に盛り、その一端を電極に固定し、もう一端を変換器に繋げた。当該チャンバーはＫｒｅｂｓ（ｐＨ７．４）を含み、３７℃で、９５％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２で保たれた。

前記組織を２．０ｍＮの受動力（ｐａｓｓｉｖｅ ｆｏｒｃｅ）で伸展し、６０分間安定化し、溶液を１５分毎に交換した。等尺力（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ ｆｏｒｃｅ）の変化を、ＷｉｎＤａｑ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ （Ｄａｄａ（登録商標） Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＵＳＡ）ソフトウエアを使用して、増幅器（ＴＢＭ−４ ｍｏｄｅｌ； Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）に接続した、等尺力変換器（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｒａｓｏｔａ， ＦＬ， ＵＳＡ）を使用して記録した。調製物の収縮能力を評価するために、海綿体切片にＫＣｌ溶液（１２０ｍＭ）を添加し、当該調製物を、Ｋｒｅｂｓで３回洗浄した。

前記海綿体切片を、フェニルフリン（１０^−５Ｍ）で予め収縮させ、アセチルコリン１０^−４Ｍ（対照）、Ｐｎｔｘ２−６（５ｘ１０^−６Ｍ）及びペプチドＰｎＴｘ（１９）（１ｘ１０^−６Ｍ）により、収縮を引き起こさせた。

図４は、フェニルフリン（１０^−５Ｍ）により予め収縮させたマウスの海綿体切片において、毒素ＰｎＴｘ２−６（５ｘ１０^−８Ｍ）及びペプチドＰｎＴｘ（１９）（１０^−６Ｍ）が、８３％の弛緩を誘導するのに対し、アセチルコリンの対照（１０^−４Ｍ）は、８１％の弛緩を誘導することを示す。これらの結果は、毒素ＰｎＴｘ２−６及びペプチドＰｎＴｘ（１９）のいずれも、マウスの海綿体の切片の弛緩に作用することを示唆する。

実施例４−Ｌ−グルタミン酸塩の放出における合成ペプチドＰｎＴｘ（１９）の効果
Ｌ−グルタミン酸塩の放出は、Ｎｉｃｈｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ． １９８７ （ＮＩＣＨＯＬＬＳ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ４９， ５０５７， １９８７）の示唆に従い解析された。前記ペプチドが、元の毒素と同様に、ラット大脳皮質シナプトソームにおいてＬ−グルタミン酸塩の放出を誘導出来るか否かを評価するため、以下の濃度：１０^−５Ｍ； ３ｘ１０^−５Ｍ； １０^−６Ｍ； ３ｘ１０^−６Ｍでのその効果を解析した（実施例５）。

これらの結果から、実験条件において、３ｘ１０^−５Ｍの濃度においてのみ、前記ペプチドが、対照（ＰｎＴｘ１９無し）と比較して有意なＬ−グルタミン酸塩の放出を誘導することが観察された。

実施例５−心臓に対するペプチドＰｎＴｘ−１９の作用
ナトリウム電流に対する作用
心筋に存在するナトリウムチャンネルＮａｖ１．５に対する毒素ＰｎＴｘ２−６及びペプチドＰｎＴｘ−１９の効果を解析するために、パッチクランプ試験を実施した。記録されたデータから、毒素ＰｎＴｘ２−６はナトリウム電流のピークの低下を引き起こし、不活性化電流を遅延させることが示された。これらの効果は、ＰｎＴｘ−１９においては認められなかった（図６Ａ及びＣ）。図６Ｂにおいて、ＰｎＴｘ２−６がナトリウム電流の密度の低下を促進することが観察されたのに対して、斯かる現象は、前記ペプチドの存在下では確認されなかった（図６Ｄ）。

心室圧、心拍数及び誘導±ｄＰ／ｄｔに対する作用
ラットを、１２時間照明／暗黒の調製された周期下、一定温度、水及び餌を自由に摂取できる条件下で維持した。それらを、ヘパリン（２００ＩＵ）の腹腔内注射後１０〜１５分以内に殺した。胸部を開き、心臓を注意深く乾燥させ、ＮａＣｌ （１１８．４）， ＫＣｌ （４．７）， ＫＨ２ＰＯ４ （１．２）， ＭｇＳｏ４．７Ｈ２Ｏ （１．２）， ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ （１．２５）， グルコース （１１．７）及び ＮａＨＣＯ３ （２６．５）（ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有するＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ溶液（ＫＲＳ）を用いて大動脈の切り口からかん流した。かん流の流れは、３７℃、一定速度（１０ｍＬ／分）で、一定の酸素化（５％ＣＯ２及び９５％Ｏ２）下で維持された。圧力変換器に接続した風船を右心室に挿入し、心室圧、心拍数及び誘導±ｄＰ／ｄｔをモニタリングした（図７）。風船の体積は、最終的な拡張期血圧が約１０ｍｍＨｇとなるように調整された。均衡に達するまでの時間（３０〜４０分）の経過後、１００μｍｏｌ／Ｌの担体（対照）、かん流緩衝剤中の３７．８ｎｍｏｌ／Ｌ〜３．７８μｍｏｌ／Ｌの濃度の毒素、又は７．８ｎｍｏｌ／Ｌ〜３．７８μｍｏｌ／Ｌの濃度のペプチドを注入した。

図７に示すように、前記毒素は、最終的な右心室収縮期血圧（ＲＦＶＳＰ／ＰＶＳＦＤ）を濃度依存的に増大させ、＋ｄＰ／ｄｔ及び-ｄｐ／ｄｔは、それぞれ最大で６６．７±１３．５５％及び６１．６±９．８９％であった。（図７Ａ、Ｃ及びＤ）。しかしながら、この毒素は、最終的な拡張期血圧及び心拍数を変化させなかった。対照的に、前記ペプチドは、高濃度においても上記パラメーターを変化させなかった（図７Ｂ及びＥ）。

結果は平均±ＳＥＭで示す。一元配置分散（ｏｎｅ−ｗａｙ ｖａｒｉａｎｃｅ）（ＡＮＯＶＡ）の分析、続いてＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｋｓ事後テストを使用して、単離された心臓において上記パラメーターを分析した。統計分析においてｐ＜０・０５が考慮された。

実施例６−ペプチドＰｎＴｘ−１９の免疫原性
２０〜２３ｇの雄のＳｗｉｓｓマウスを２つの群に分け（対照−アジュバント：水酸化アルミニウム−図８Ａ及びＰｎＴｘ−１９−１０μＧ−図８Ｂ）、各群は４頭の動物を含む。マウスを皮下経路により免疫化した。最初の導入から２１、３５及び４９日後、マウスは上記調製物の補強を受けた。ＰｎＴｘ−１９に対する抗体の存在を評価するために、マウスの尾から回収した血清を、最初の導入から１５、３０、４０及び６０日後に、間接的免疫酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。アッセイは他の文献の記載と同様に実施された（ＤＥＬ ＰＩＮＯ， Ｆ．Ａ．Ｂ．， ＢＲＡＮＤＥＬＬＩ， Ａ．， ＧＯＮＺＡＬＥＳ， Ｊ．Ｃ．， ＨＥＮＲＩＱＵＥＳ， Ｊ．Ａ．Ｐ．， ＤＥＷＥＳ， Ｈ．， Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＿−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ｏｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｔｉｃｋ Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ． Ｖｅｔ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ７９， ２４７−２５５， １９９８）。

ＰｎＴｘ１９の免疫原性を、１０μｇの皮下注射後に評価した（図８Ｂ）。動物の過感受性又は死亡は、アッセイ中に認められなかった。ペプチドの最初の接種の６０日後、群２（ＰｎＴｘ−１９−１０μｇ）において、抗体の力価の僅かな増大が見られた。１０μｇのペプチドの用量は、毒素ＰｎＴｘ２−６において推定されるＤＬ５０（０．７９ｐｇ／マウス）の約１２．５倍に相当することに留意されたい（ＣＯＲＤＥＩＲＯ Ｍ．Ｎ．， ＤＩＮＩＺ Ｃ．Ｒ．， ＶＡＬＥＮＴＩＭ Ａ．Ｃ．， ＶＯＮ ＥＩＣＫＳＴＥＤＴ， ＧＩＬＲＯＹ Ｊ．， ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ Ｍ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ Ｔｘ２ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｎｏｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒａｓｉｌｉａｎ ’ａｒｍｅｄ’ ｓｐｉｄｅｒ Ｐｈｏｎｅｕｔｒｉａ ｎｉｇｒｉｖｅｎｔｅｒ （Ｋｅｙｓ）． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３１０， １５３−１５６， １９９２）。

Claims (7)

1. 配列ＧＥＲＲＱＹＦＷＩＡＷＹＫＬＡＮＳＫＫ（配列番号１）を有することを特徴とする合成ペプチド。
2. Ｎ末端部分にアセチル化、及びＣ末端にアミド化の修飾を呈することを特徴とする請求項１に記載の合成ペプチド。
3. 勃起機能不全を呈する対象の治療、及び／又は勃起機能の増強のための医薬の製造のためであることを特徴とする、請求項１に記載の合成ペプチドの使用。
4. 配列番号１で表される合成ペプチド、及び１つの賦形剤、又は医薬として許容される複数の賦形剤の混合物を含有することを特徴とする医薬組成物。
5. 前記ペプチドが、リポソーム、シクロデキストリン、生分解性ポリマー、カプセル、マイクロカプセル、ナノカプセル、マイクロ粒子、ナノ粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、分散デバイス、脂肪球、経皮投与系、及び／又は温度変化に応じて体内で固体又はゲルを形成する液体からなる群から選択される調整放出系と組み合わせて、又は組み合わせずに存在することを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 経口、局所、筋肉内、静脈内、皮下及び吸入経路のいずれかにより、又は移植デバイスにより投与されることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
7. 勃起機能不全を呈する対象の治療、及び／又は勃起機能の増強のための医薬の製造に使用されることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。