CN108486201B - 一种白果生物活性多肽的提取方法 - Google Patents

一种白果生物活性多肽的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于白果产品加工技术领域，具体涉及一种白果生物活性多肽的提取方法。该方法将白果仁干燥后粉碎，得到白果粉；白果粉依次经液氮研磨、脂肪酶‑蛋白酶酶解、灭酶后得到灭酶溶液；灭酶溶液经4000～5000r/min离心分离收集得到上清液A，上清液A中加入絮凝剂絮凝，10000～12000r/min离心分离收集得到上清液B；上清液B经浓缩干燥，得到白果生物活性多肽。本发明通过液氮研磨的方式使白果粉细胞破碎，迫使细胞中的蛋白质溶出，然后在脂肪酶和蛋白酶的共同作用下，同时酶解白果粉中的脂肪和蛋白质，在产生小分子生物活性多肽的同时，降低脂肪对多肽纯度的干扰，缩短了酶解时间，反应条件温和。

Description

一种白果生物活性多肽的提取方法
技术领域
本发明属于白果产品加工技术领域，具体涉及一种白果生物活性多肽的提取方法。
背景技术
生物活性多肽是对细胞功能或生命有机体的代谢活动具有优化功能的短肽类化合分子，其相对分子量一般小于6000Da。生物活性多肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用。生物活性多肽按照原料来划分包括：乳肽、大豆肽、玉米肽、鱼贝类蛋白、胶原蛋白多肽等；按照功能来分包括免疫活性肽、神经活性肽、降血压肽和抗菌多肽等。这些活性多肽已作为保健食品和药物实现了工业化生产，并取得巨大的经济效益。近些年来随着人们保健美容意识及消费能力的提高，具有良好生物活性的多肽类产品已经走入平常百姓生活中，具有非常广泛的市场和应用前景。但是我国对活性多肽的研究起步较晚，产品种类少，市场开发不足。
我国生物物种丰富，蛋白质资源充足，利用生物技术开发多肽活性物质是提升作物经济价值和开发活性多肽新品种的重要途径。白果是银杏的种仁，一般称椭圆形，长1.5～2.5cm，宽1～2cm，厚约1cm，表面呈黄白色或者淡黄棕色，平滑坚硬。白果果仁中含有淀粉、蛋白质、脂肪、多糖、维生素C、核黄素、胡萝卜素、银杏酸、白果酚、多种有益人体健康的微量元素，因此，白果为药食同源，使用白果可养生延年。提取白果生物活性多肽不仅可以提高白果仁消费面，而且可以为生物活性多肽新品种的开发提供新途径。
传统植物中生物活性多肽的提取一般采用化学法，化学法即利用酸或碱进行蛋白质的消化处理，该方法速度快，成本低，但是会对多肽造成一定的损伤，多肽结构的控制不太容易，不仅破坏多肽的生理活性，产生毒副产品，而且会产生酸碱等化学污染。因此，为了使提取的白果生物活性多肽达到安全食用目的，需要开发一种安全无毒副作用的提取方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种白果生物活性多肽的提取方法，解决了化学提取法对多肽造成的损伤，导致的多肽结构不稳定，破坏多肽生理活性，产生毒副产品，产生酸碱等化学污染的问题。
本发明提供的一种白果生物活性多肽的提取方法，包括以下步骤：
S1，将白果仁干燥后粉碎，得到白果粉；
S2，将S1中的白果粉置于液氮中研磨3～5min，然后加入缓冲液溶解粉末，混匀，调节pH至6.8～7.0，加入脂肪酶和蛋白酶，在60℃下搅拌酶解40～60min，得到酶解液，然后将酶解液经高温灭酶，得到灭酶溶液；其中，所述缓冲液为氯化钠-氯化钾混合液；其中，脂肪酶、蛋白酶和白果粉的质量比例为0.1～0.5：0.1～2.0：100；
S3，将所述灭酶溶液4000～5000r/min离心分离10～15min，收集得到上清液A；
S4，向S3的上清液A中加入絮凝剂，60～80℃水浴絮凝0.5～1h，10000～12000r/min离心分离10～15min，收集得到上清液B；
S5，将S4中得到的上清液B经浓缩干燥，得到白果生物活性多肽。
优选的，上述白果生物活性多肽的提取方法，S2中，1L氯化钠-氯化钾混合液按照以下方法配制：9g氯化钠、0.1g氯化钾，蒸馏水定容至1L。
优选的，上述白果生物活性多肽的提取方法，S2中，所述蛋白酶为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、风味蛋白酶或者菠萝蛋白酶中的一种。
优选的，上述白果生物活性多肽的提取方法，S4中，所述絮凝剂为壳聚糖或者食用明胶。
优选的，上述白果生物活性多肽的提取方法，S4中，所述絮凝剂与所述上清液A的质量比例为0.1～0.3：100。
与现有技术相比，本发明提供的白果生物活性多肽的提取方法，具有以下有益效果：
本发明通过液氮研磨的方式使白果粉细胞破碎，迫使细胞中的蛋白质溶出，然后在脂肪酶和蛋白酶的共同作用下，同时酶解白果粉中的脂肪和蛋白质，在产生小分子生物活性多肽的同时，降低脂肪对多肽纯度的干扰，缩短了酶解时间，反应条件温和。通过酶解的方式提取生物活性多肽，可以有效提高蛋白的提取率至65.8～70.3％，1000Da小分子活性多肽含量高达90.1％，有利于人体吸收，发挥其生理活性作用，也可为人体增加多肽影营养，并且该生物活性多肽安全无毒副作用。
研究发现，不同缓冲液对生物活性多肽的总提取率具有显著影响，氯化钠-氯化钾混合液作为缓冲液效果最佳。我们采用两步法的离心分离方式，逐级去除溶液中的沉淀物，以提高生物活性多肽在缓冲液中的保留率。为白果生物活性多肽的提取提供了一种新的途径。
具体实施方式
下面对发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。此外，本发明下述实施例中采用的各种酶均为市售。
本发明提供了一种白果生物活性多肽的提取方法，包括以下步骤：
S1，将白果仁干燥后粉碎，得到白果粉；
S2，将S1中的白果粉置于液氮中研磨3～5min，然后加入缓冲液溶解粉末，混匀，调节pH至6.8～7.0，加入脂肪酶和蛋白酶，在60℃下搅拌酶解40～60min，得到酶解液，然后将酶解液经高温灭酶，得到灭酶溶液；其中，所述缓冲液为氯化钠-氯化钾混合液；其中，脂肪酶、蛋白酶和白果粉(液氮研磨之前称取的白果粉的质量)的质量比例为0.1～0.5：0.1～2.0：100；
S3，将所述灭酶溶液4000～5000r/min离心分离10～15min，收集得到上清液A；
S4，向S3的上清液A中加入絮凝剂，60～80℃水浴絮凝0.5～1h，10000～12000r/min离心分离10～15min，收集得到上清液B；
S5，将S4中得到的上清液B经浓缩干燥，得到白果生物活性多肽。
优选的，本发明一种白果生物活性多肽的提取方法，包括以下实施例。
实施例1
一种白果生物活性多肽的提取方法，包括以下步骤：
S1，将白果仁干燥后粉碎过100目筛，得到白果粉；
S2，将S1中的白果粉置于液氮中研磨3min，置于室温条件下，待沉淀物表面液氮挥发干后，然后加入缓冲液溶解粉末，混匀，调节pH至7.0，加入脂肪酶和中性蛋白酶，在60℃下搅拌酶解60min，得到酶解液，然后将酶解液经100℃高温灭酶10min，得到灭酶溶液；其中，脂肪酶、中性蛋白酶和白果粉(液氮研磨之前称取的白果粉的质量)的质量比例为0.1：0.1：100；其中，所述缓冲液为氯化钠-氯化钾混合液，且1L氯化钠-氯化钾混合液按照以下方法配制：9g氯化钠、0.1g氯化钾，蒸馏水定容至1L；
S3，将所述灭酶溶液5000r/min离心分离10min，收集得到上清液A；
S4，向S3的上清液A中加入絮凝剂食用明胶，80℃水浴絮凝1h，12000r/min离心分离10min，收集得到上清液B；其中，食用明胶与上清液A的质量比例为0.1：100；
S5，将S4中得到的上清液B经旋转蒸发浓缩10倍体积，然后40℃真空干燥，得到白果生物活性多肽。
经分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽总量的90.1％，生物活性多肽的总提取率大约为70.3％。
实施例2
一种白果生物活性多肽的提取方法，包括以下步骤：
S1，将白果仁干燥后粉碎过200目筛，得到白果粉；
S2，将S1中的白果粉置于液氮中研磨5min，置于室温条件下，待沉淀物表面液氮挥发干后，然后加入缓冲液溶解粉末，混匀，用0.1mol/L盐酸溶液调节pH至6.8，加入脂肪酶和酸性蛋白酶，在60℃下搅拌酶解40min，得到酶解液，然后将酶解液经100℃高温灭酶10min，得到灭酶溶液；其中，脂肪酶、酸性蛋白酶和白果粉(液氮研磨之前称取的白果粉的质量)的质量比例为0.5：0.2：100；其中，所述缓冲液为氯化钠-氯化钾混合液，且1L氯化钠-氯化钾混合液按照以下方法配制：9g氯化钠、0.1g氯化钾，蒸馏水定容至1L；
S3，将所述灭酶溶液4000r/min离心分离15min，收集得到上清液A；
S4，向S3的上清液A中加入絮凝剂壳聚糖，60℃水浴絮凝0.5h，10000r/min离心分离15min，收集得到上清液B；其中，壳聚糖与上清液A的质量比例为0.3：100；
S5，将S4中得到的上清液B经旋转蒸发浓缩10倍体积，然后40℃真空干燥，得到白果生物活性多肽。
经分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽总量的89.3％，生物活性多肽的总提取率大约为66.7％。
实施例3
一种白果生物活性多肽的提取方法，包括以下步骤：
S1，将白果仁干燥后粉碎过100目筛，得到白果粉；
S2，将S1中的白果粉置于液氮中研磨4min，置于室温条件下，待沉淀物表面液氮挥发干后，然后加入缓冲液溶解粉末，混匀，调节pH至7.0，加入脂肪酶和木瓜蛋白酶，在60℃下搅拌酶解50min，得到酶解液，然后将酶解液经100℃高温灭酶5min，得到灭酶溶液；其中，脂肪酶、木瓜蛋白酶和白果粉(液氮研磨之前称取的白果粉的质量)的质量比例为0.3：1.0：100；其中，所述缓冲液为氯化钠-氯化钾混合液，且1L氯化钠-氯化钾混合液按照以下方法配制：9g氯化钠、0.1g氯化钾，蒸馏水定容至1L；
S3，将所述灭酶溶液5000r/min离心分离12min，收集得到上清液A；
S4，向S3的上清液A中加入絮凝剂食用明胶，75℃水浴絮凝40min，12000r/min离心分离12min，收集得到上清液B；其中，食用明胶与上清液A的质量比例为0.2：100；
S5，将S4中得到的上清液B经旋转蒸发浓缩10倍体积，然后40℃真空干燥，得到白果生物活性多肽。
经分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽总量的88.0％，生物活性多肽的总提取率大约为65.8％。
实施例4
一种白果生物活性多肽的提取方法，包括以下步骤：
S1，将白果仁干燥后粉碎过200目筛，得到白果粉；
S2，将S1中的白果粉置于液氮中研磨3min，置于室温条件下，待沉淀物表面液氮挥发干后，然后加入缓冲液溶解粉末，混匀，用0.1mol/L盐酸溶液调节pH至6.8，加入脂肪酶和胰酶，在60℃下搅拌酶解60min，得到酶解液，然后将酶解液经100℃高温灭酶5min，得到灭酶溶液；其中，脂肪酶、胰酶和白果粉(液氮研磨之前称取的白果粉的质量)的质量比例为0.3：0.9：100；其中，所述缓冲液为氯化钠-氯化钾混合液，且1L氯化钠-氯化钾混合液按照以下方法配制：9g氯化钠、0.1g氯化钾，蒸馏水定容至1L；
S3，将所述灭酶溶液5000r/min离心分离10min，收集得到上清液A；
S4，向S3的上清液A中加入絮凝剂食用明胶，65℃水浴絮凝0.5h，12000r/min离心分离10min，收集得到上清液B；其中，食用明胶与上清液A的质量比例为0.1：100；
S5，将S4中得到的上清液B经旋转蒸发浓缩10倍体积，然后40℃真空干燥，得到白果生物活性多肽。
经分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽总量的88.4％，生物活性多肽的总提取率大约为67.5％。
实施例5
一种白果生物活性多肽的提取方法，将S2中的中性蛋白酶替换为风味蛋白酶，其余条件同实施例1。经分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽总量的88.1％，生物活性多肽的总提取率大约为68.5％。
实施例6
一种白果生物活性多肽的提取方法，将S2中的中性蛋白酶替换为菠萝蛋白酶，其余条件同实施例1。经分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽总量的88.7％，生物活性多肽的总提取率大约为69.6％。
本发明通过液氮研磨的方式使白果粉细胞破碎，迫使细胞中的蛋白质溶出，然后在脂肪酶和蛋白酶的共同作用下，同时酶解白果粉中的脂肪和蛋白质，在产生小分子生物活性多肽的同时，降低脂肪对多肽纯度的干扰，缩短了酶解时间。研究发现，不同缓冲液对生物活性多肽的总提取率具有显著影响，以蒸馏水或者0.05mol/L、pH7.0的PBS缓冲液作为缓冲液，替换掉实施例1的S2中的氯化钠-氯化钾混合液，其余步骤同实施例1，该蒸馏水的处理方式作为对照组A，0.05mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的处理方式作为对照组B，结果显示，对照组A和对照组B中生物活性多肽的总提取率分别为40.3％和45.7％。
另外，我们采用两步法的离心分离方式，逐级去除溶液中的沉淀物，以提高生物活性多肽在缓冲液中的保留率，我们以一步离心分离法为对照组C，即将实施例1中S3～S4的步骤去掉，直接替换为“将所述灭酶溶液12000r/min离心分离25min”，结果显示，生物活性多肽的总提取率仅为48.9％，且分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽总量的79.6％，小分子多肽损失量较大。
我们将实施例1中S4的步骤替换为膜透析分析步骤，即上清液A经截留分子量1500Da的透析袋透析36h，收集分子量小于1500Da的透过液，然后经旋转蒸发浓缩10倍体积，然后40℃真空干燥，得到白果生物活性多肽，结果显示分子量小于1500Da的生物活性多肽的提取率为64.1％，结果显示，本发明采用食用明胶或者壳聚糖作为絮凝剂絮凝的方法可提高生物活性多肽在缓冲液中的保留率，接近于膜透析操作。另外，食用明胶或者壳聚糖本是食品中常用的添加剂，安全无毒。
需要说明的是，本发明中涉及到数值范围时，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (3)

1.一种白果生物活性多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将白果仁干燥后粉碎，得到白果粉；
S2，将S1中的白果粉置于液氮中研磨3～5min，然后加入缓冲液溶解粉末，混匀，调节pH至6.8～7.0，加入脂肪酶和蛋白酶，在60℃下搅拌酶解40～60min，得到酶解液，然后将酶解液经高温灭酶，得到灭酶溶液；其中，所述缓冲液为氯化钠-氯化钾混合液；其中，脂肪酶、蛋白酶和白果粉的质量比例为0.1～0.5：0.1～2.0：100；
其中，1L氯化钠-氯化钾混合液按照以下方法配制：9g氯化钠、0.1g氯化钾，蒸馏水定容至1L；
S3，将所述灭酶溶液4000～5000r/min离心分离10～15min，收集得到上清液A；
S4，向S3的上清液A中加入絮凝剂，所述絮凝剂为壳聚糖或者食用明胶，60～80℃水浴絮凝0.5～1h，10000～12000r/min离心分离10～15min，收集得到上清液B；
S5，将S4中得到的上清液B经浓缩干燥，得到白果生物活性多肽。
2.根据权利要求1所述的白果生物活性多肽的提取方法，其特征在于，S2中，所述蛋白酶为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、风味蛋白酶或者菠萝蛋白酶中的一种。
3.根据权利要求1所述的白果生物活性多肽的提取方法，其特征在于，S4中，所述絮凝剂与所述上清液A的质量比例为0.1～0.3：100。
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