CN105597097A - 抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法及其制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法及其制剂。采用基因工程或偶联法或常规方法将霉菌毒素、细菌外毒素和病原体制成抗原,分别对产蛋禽类进行免疫,制得抗霉菌毒素、抗细菌外毒素和抗病原体免疫蛋,然后制得不同类型的IgY粗提物;再进行提纯、纳米化、包被及复合,分别得到不同状态的抗霉菌毒素IgY、抗细菌外毒素IgY、抗病原体IgY以及抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY;将上述IgY或复合IgY按0.0001%以上的任意比例添加到食品、饲料、保健品或药品中,即得抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体IgY或复合IgY制剂。采用这种IgY或复合IgY及其制剂可有效降解饲料和食品以及粮食中的霉菌毒素,预防和治疗霉菌毒素和细菌外毒素中毒及混合感染疾病。
Description
技术领域
本发明涉及消除霉菌毒素污染及治疗毒素感染和混合感染疾病的新方法,更具体地说,涉及抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法及其制剂。
背景技术
霉菌毒素是由霉菌或真菌产生的有毒、有害物质。在土壤中,在植物中,包括谷物、饲草和青贮饲料均可发现霉菌毒素。它是一种存在饲料和原料中的抗营养因子,是毒素很强的霉菌次生代谢产物。在饲料的加工、运输和贮存过程中都会持续产生霉菌毒素,应该说世界上没有一个地方可以躲过霉菌毒素污染。近年来,世界各国对药物残留十分关注,殊不知由于药物残留多数会被排泄出体外或在体内被分解,而霉菌毒素却会长期积储在体内;因此,霉菌毒素造成的危害远超药物残留。
霉菌毒素进入动物体内会损害动物的肝脏组织,破坏肝脏功能,造成畜禽死亡率增加;同时,霉菌毒素高度毒性作用还会破坏动物机体的免疫系统,从而导致细菌外毒素以及多种病毒和致病菌混合感染,使畜禽的病毒性和细菌性感染疾病发生机率大幅度上升;而许多致病菌所释放出来的外毒素(Exotoxin)又进一步加剧了霉菌毒素对机体的损害,形成叠加效应。细菌外毒素具高传染力,只要接触就可以感染;而且其毒性非常强,有些细菌外毒素的毒性比氰化钾大1万倍。细菌外毒素与霉菌毒素一样无处不在,许多动物疾病百药不治,元凶就是细菌外毒素。外毒素也是许多细菌产生耐药性的主要因素,一种对绝大多数抗生素都耐药的超级细菌(MRSA)100%产生外毒素;同时,无论是过去还是现在,无论是在发达的工业化国家还是发展中国家,由细菌外毒素引起的食物中毒都常常发生;因此,细菌外毒素侵染也已成为制约全球养殖业发展和威胁人类健康的严重问题。
近年来,全国各地养殖场疫情频发,传染性疾病不断流行,最主要的诱因也是霉菌毒素污染和细菌外毒素侵染。许多奶牛场奶牛采食量减少、牛奶品质和产奶量降低、体细胞数增加等,许多猪场猪群生长速度缓慢、母猪假发情、仔猪腹泻发生率和死亡率高居不下等,许多养鸡场蛋鸡产蛋率下降等,其实都是霉菌毒素和细菌外毒素造成的,而现有的化学药物包括抗生素和化学抗病毒药对这些疾病基本没有疗效;因此,霉菌毒素和细菌外毒素被国际医学界称为难于对付的“万病之源”。
更严峻的现状是,霉菌毒素和细菌外毒素会在畜禽体内进而在畜禽产品中残留,再通过食物链进入人体内而危及人类健康。消费者食用被霉菌毒素和细菌外毒素污染的食品后会发生急、慢性中毒,甚至致畸、致癌、致突变,其中致癌是最突出的问题。而食品中的毒素不会因加工而灭活,普通的食物处理和烹饪方法也不会减少霉菌毒素的含量;同时,霉菌毒素和细菌外毒素具有对抗蛋白酶分解的特性,在消化道中不会被破坏。这些都给全球为消除霉菌毒素污染和减少其危害的努力增加了难度。更重要的是,虽然消费食用的食品中霉菌毒素和细菌外毒素残留是微量的;但是,这些毒素会在人体内逐渐累积而产生作用。因此,近年来,我国国民生活水平虽然不断提高,可是,大众对疾病的抵抗能力反而不断下降;同时,癌症的发病率也直线上升。这都是由于积蓄于体内的霉菌毒素和细菌外毒素日复一日地攻击机体免疫系统并诱发混合感染以及霉菌毒素和细菌外毒素固有的高致癌性酿成的。国内外科学研究证明,高血压、中风、肝硬化、癌肿、肝炎、糖尿病等多种疾病,都与体内器官、血液等受毒素污染有关。
目前,全球尚无对付细菌外毒素的有效方法,而对付霉菌毒素的方法主要有以下几种。
1、营养解毒法:可起到一定的解毒效果,但可能造成营养的不均衡,导致有些营养物质缺乏。
2、吸附法(活性炭法和硅酸盐法以及葡聚糖):活性炭法和硅酸盐法只对黄曲霉毒素有一定效果,对其他毒素无效;葡聚糖则对玉米赤霉烯酮有一些效果。但是,总体应用效果较差;最糟糕的是被吸附的毒素会在动物胃肠道中重新释放。另外,由于这种吸附并非特异性的,在吸附霉菌毒素的同时也吸附了大量的维生素和氨基酸,造成得不偿失。
3、碱处理法:处理后原料残留有大量氨,已逐渐被淘汰。
4、氧化处理法:处理效果不稳定,饲料中维生素等营养成分损失严重。
5、抗氧化剂:不能完全消除黄曲霉毒素中毒症,而且BHT等抗氧化剂浓度均超过常规使用量的30倍以上才显示较好的去毒效果;这样一来,必然会对动物产生毒害作用。
6、高温处理法:能耗高且对饲料中的营养成分破坏大,实际应用很少。
7、生物降解:这种吸附作用是可逆的,毒素分子并没有消失,随着培养时间的延长,部分毒素会重新释放到培养基质中。一些菌株在条件改变的情况下有可能产生毒素。
8、酶制剂:效果有限的降解过程是酶促反应,必须在有水的条件下才能发生反应。对部分霉菌毒素有作用的解毒酶的理想反应条件都是中性pH值、高水分的体外反应体系,适合植物油、酱油、啤酒、牛奶等,难以在低水分饲料和原料中直接应用。
从上面分析可以看到,以上方法都存在许多缺陷和不足,不但不能杜绝霉菌毒素污染,对霉菌毒素导致的细菌外毒素以及病毒和致病菌的混合感染更是无能为力,而被视为灵丹妙药的抗生素对霉菌毒素和细菌外毒素毫无效果,盲目使用则是无的放矢;因此,造成全球范围内霉菌毒素污染和细菌外毒素侵染的现象不但未能得到扼制,反而越来越严重。仅霉菌毒素污染一项,联合国粮农组织指出,世界各国生产的饲料中至少有25%污染了已知的霉菌毒素,而我国饲料和原料中霉菌毒素含量超标的比例更高达60%~70%以上。根据联合国粮农组织的测算,全世界仅仅由于霉菌毒素污染而产生的经济损失,每年达数千亿美元;除经济损失外,霉菌毒素和细菌外毒素对人类健康造成的危害更是难以统计。
因此,研究开发一种新技术和新方法,能更有效地真正解决霉菌毒素污染的问题并破解由此引发的细菌外毒素及病毒和致病菌混合感染的难题,对公共卫生、食品安全和饲料工业以及畜牧业生产和粮食储备领域来说,已是一个迫在眉睫的大课题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于,克服现有技术的缺陷和不足,特别是针对霉菌毒素会加剧细菌外毒素以及病毒和致病菌混合感染的技术难点,提供一种抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法。
本发明的另一目的在于,提供一种抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体单一IgY或复合IgY制剂,达到既可抑灭霉菌毒素又可杀灭细菌外毒素,同时又能杀灭多种病原体的三重目的,从粮食储藏、运输到饲料生产和动物养殖以及食品安全和公共卫生每个环节全方位消除霉菌毒素和细菌外毒素以及多种病原体的危害。
具体实施方案
下面结合具体实施方案,进一步阐述本发明。应当理解,以下实施方案仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明解决上述制备方法技术问题的技术方案是:设计一种抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法,其特征在于包括下述步骤:
一、制备抗原
(一)制备有代表性霉菌毒素抗原
1.选定最常出现的、有代表性的霉菌毒素根据有关部门对2013年全年饲料和原料样本霉菌毒素检测结果,黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)的阳性检出率分别为97.35%、99.72%和100%;由此可见,黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)是最有代表性的三种霉菌毒素。另外,赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素等五种也在大多数饲料和原料样本中被检出;因此,本发明选择黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素等8种霉菌毒素作为有代表性的抗原。
实际应用时,可针对不同饲料残留的霉菌毒素不同、不同动物敏感的霉菌毒素不同、不同粮食以及不同的贮存条件等情况减少或增加或者变换霉菌毒素抗原种类。
2.培养有代表性霉菌毒素
(1)培养黄曲霉素
向美国ATCC购买黄曲霉菌标准株(编号3.4409),将菌株点植接种于PDA斜面培养基,25-30℃培养2-3天,用灭菌生理盐水清洗培养2-3天的黄曲霉菌菌落孢子,稀释,吸取稀释液点在培养容器内的培养基中,再置于培养箱中培养。培养基可选用大米培养基、察氏培养基(CA)、APA培养基、PCD培养基、PGAN培养基、SM培养基、氯硝胺15-20%甘油培养基(DG18)、高盐察氏培养基(SCDA)、马铃薯琼脂培养基(PDA)、改良的孟加拉红培养基(M-RB)、YES培养基、孟加拉红培养基(RB)、氯硝胺孟加拉红琼脂(DRBC)等。30-35℃,80-100%湿度条件下,在培养箱培养15-17天;然后,取出培养容器,在培养容器中加入甲醇水(体积比1∶1)并加以搅拌,超声萃取,抽滤收集滤液,在40-50℃下将滤液旋转蒸发,最后3-8℃高速离心10-18min,取上清,即获得黄曲霉毒素B1溶液。
(2)培养玉米赤霉烯酮
向美国ATCC购买玉米赤霉菌D4-21,将菌株点植接种于PDA斜面培养基,25-30℃培养2-3天,用灭菌生理盐水清洗培养2-3天的黄曲霉菌菌落孢子,稀释,吸取稀释液点在培养容器内的培养基中,再置于培养箱中培养。培养基可选用大米培养基、小麦培养基、玉米培养基、马铃薯琼脂培养基(PDA)、改良的孟加拉红培养基(M-RB)、YES培养基、孟加拉红培养基(RB)、氯硝胺孟加拉红琼脂(DRBC)等。在20-30℃,80-100%湿度条件下培养12-16天,3-6℃低温处理5-10天;然后,取出培养容器,在培养容器中加入甲醇水(体积比1∶1)并加以搅拌,超声萃取,抽滤收集滤液,在45℃下将滤液旋转蒸发,最后4℃高速离心15min,取上清,即获得玉米赤霉烯酮溶液。
(3)培养呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)
向美国ATCC购买禾谷镰刀菌标准株(编号16),将菌株点植接种于PDA斜面培养基,20-32℃培养2-3天,用灭菌生理盐水清洗培养2-3天的禾谷镰刀菌菌落孢子,稀释。吸取稀释液点在培养容器内的振荡培养基中,振荡培养基可选用5%绿豆汁或其它液体培养基;将培养容器置于摇床进行振荡培养,于28℃培养3-7天,转速100-250rpm。然后,将培养物置于培养箱于28℃静置培养14天,静置培养基可选用添加1%蛋白胨的蔡氏培养基或其他培养基。培养结束,取出培养物,在培养容器中加入甲醇水(体积比1∶1)并加以搅拌,超声萃取,抽滤收集滤液,在40-50℃下将滤液旋转蒸发,最后3-7℃高速离心10-20min,取上清,即获得呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)溶液。
以上用最常见的三种霉菌毒素中的每一种霉菌毒素之其中一种培养方法来进行说明,实际应用不限于所列的这些方法。其他赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素等五种霉菌毒素以及之外的其他霉菌毒素也都可以采用各自常规的培养方法进行培养,这里就不赘述。
3.将霉菌毒素改造为完全抗原
由于霉菌毒素分子量都很小,是小分子物质,都是只有反应原性而无免疫原性的半抗原,不能直接刺激动物产生抗体;因此,本发明采用两种不同方法,解决这个问题。具体做法如下:
(1)基因工程重组霉菌毒素多肽蛋白抗原
用RT-PCR方法分别从黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素等8种霉菌毒素中之一种的RNA克隆基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T载体。测序证明所获得的基因序列正确后,用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶消化,电泳回收目的片段,与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。挑取阳性克隆,提质粒,酶切鉴定正确后,电转化毕氏酵母菌(Pichiapastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆,然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中,在20-30℃摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时,将培养基换成含甲醇的培养基,继续培养24-48小时。可根据需要重复以上培养程序,以获得免疫所需的抗原量。离心去除细胞沉淀,上清中即含大量表达产物。经50%硫酸铵沉淀、截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时、以及Sephacry1S-200和Sephacry1S-100柱层析后,即获得纯化的黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素等8种霉菌毒素之一种的重组霉菌毒素多肽蛋白抗原。
(2)霉菌毒素与载体蛋白偶联抗原
选择蛋白质类、多肽聚合物、大分子聚合物等作为偶联载体,选择如小分子肽类、双功能的亚氨酸酯等作为偶联试剂。连接方法有很多种,如碳化二亚胺法、戊二醛法、混和酸酐法、过碘酸氧化法、琥珀酸酐法、羧甲基羟胺法、重氮化的对氨基苯甲酸法、一氯醋酸钠法、活性酯法和酸酐法等,优选的为活性酯法和酸酐法。
首先将活性基团引入霉菌毒素中,然后以活性基团作为“桥梁”将霉菌毒素与载体蛋白连接起来。本发明以其中一种方法说明,但不限于这种方法。具体做法如下:
将根据免疫所需的抗原量培养好的有代表性8种霉菌毒素中之一种溶于毗陡(催化剂)、甲醇、水混合液中,再加入氨氧基乙酸半盐酸,然后回流,室温条件下放静置过夜;次日取出抽真空干燥,将所得沉淀物以少量甲醇或氯仿溶解,再以氯仿、甲醇混合液为展开剂,进行薄层层析展开,收集组份,必要时可进行第二次薄层层析。
将引入活性基团的有代表性8种霉菌毒素中之一种和等摩尔数量的“N、N′-二环已基碳酰亚胺”与“N-羟基唬珀酰亚胺”溶于无水四氢呋喃,在30℃温度下振荡60min,再以3000-5000r/min离心10-20min,用无水四氢吠喃洗涤沉淀2-3次,合并上清液;待上清中四氢呋喃挥发后,残留物溶于二甲基甲酰胺,将此溶液滴加于8-15%牛血清白蛋白溶液中,缓慢摇匀25-35min,用0.1mol/L的NaHCO3溶液透析72h,去除没有结合的霉菌毒素,冷冻干燥后即为获得采用8种霉菌毒素中之一种与牛血清白蛋白(BSA)连接而组成的大分子抗原。
提高小分子量的霉菌毒素的抗原性的方法还有多种,本发明以上用其中两种方法说明,但不限于这两种方法。
4.制备免疫用复合抗原
(1)四合一复合抗原
将上述制备的黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A等四种基因工程重组霉菌毒素多肽蛋白抗原按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)的比例混合均匀,制成多肽蛋白混合液A4I;再将上述制备的桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素等四种基因工程重组霉菌毒素多肽蛋白抗原也按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)的比例混合均匀,制成多肽蛋白混合液A4II。
也可将上述制备的黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A等四种霉菌毒素与牛血清白蛋白(BSA)连接而组成的大分子抗原按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)的比例或其他任意比例混合均匀,制成霉菌毒素加牛血清白蛋白(BSA)的大分子抗原混合液B4I。再将上述制备的桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素等四种霉菌毒素与牛血清白蛋白(BSA)连接而组成的大分子抗原按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)的比例混合均匀,制成霉菌毒素加牛血清白蛋白(BSA)的大分子抗原混合液B4II。
然后,把多肽蛋白抗原混合液A4I和A4II或霉菌毒素加牛血清白蛋白(BSA)的大分子抗原混合液B4I和B4II中的任意一种按(10-1)∶(1-10)的比例加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得各含有四种霉菌毒素成份的复合抗原A4I和A4II以及B4I和B4II。
实际应用时,可针对不同饲料残留的霉菌毒素不同、不同动物敏感的霉菌毒素不同、不同粮食以及不同的贮存条件等情况减少或增加或者变换四合一复合抗原的组成,也可另外组合不同的三合一或二合一复合抗原和五合一、六合一和七合一复合抗原以及其他任意组合的抗原。
(2)八合一复合抗原
将上述制备的八种基因工程重组霉菌毒素多肽蛋白抗原按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)∶(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)的比例混合均匀,制成多肽蛋白混合液A8;或者将上述制备的八种霉菌毒素与牛血清白蛋白连接组成的大分子抗原按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)∶(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)的比例混合均匀,制成霉菌毒素加牛血清白蛋白(BSA)的大分子抗原混合液B8。
然后,把多肽蛋白抗原混合液A8或霉菌毒素加牛血清白蛋白(BSA)的大分子抗原混合液B8中的任意一种按(10-1)∶(1-10)的比例加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得各含有八种霉菌毒素成份的复合抗原A8和B8。
(3)单一抗原
将上述制备的八种基因工程重组霉菌毒素多肽蛋白抗原中任意一种或霉菌毒素加牛血清白蛋白(BSA)的大分子抗原中任意一种按(10-1)∶(1-10)的比例加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得八种霉菌毒素中任意一种多肽蛋白抗原A1或霉菌毒素加牛血清白蛋白(BSA)的大分子抗原B1。
(二)制备主要细菌外毒素抗原
1.选定危害最大的、有代表性的细菌外毒素作为抗原成份:
(1)大肠杆菌肠毒素(LT、ST):是肠毒性大肠杆菌在生长繁殖过程中释放的外毒素,可引起胃、肠道中毒反应。
(2)金黄色葡萄球菌肠毒素(SE):金黄色葡萄球菌分泌的外毒素之一,可引起胃、肠道中毒反应。
(3)金黄色葡萄球菌α-毒素(α-toxin或α-hemoly-sin):是一种穿孔毒素,能在细胞膜上形成孔道导致细胞破裂,在化脓性感染中起重要作用。
(4)金黄色葡萄球菌PVL-杀白细胞素(panton-valen-tineleukocidin):会裂解嗜中性粒细胞,破坏机体的天然免疫屏障;与霉菌毒素一样是属于会影响免疫力的一种毒素。
因此,选择大肠杆菌肠毒素(LT、ST)以及金黄色葡萄球菌三种外毒素作为有代表性的细菌外毒素抗原。
实际应用中,不限于这四种细菌外毒素,可根据情况选用其它细菌外毒素作为抗原成份。
2.提取並纯化细菌外毒素
使用牛肉膏蛋白胨培养基采用常规方法培养肠毒性大肠杆菌,另外,分别使用牛肉膏蛋白胨培养基和改良的CCY培养基及TSB培养基或其他适合的培养基采用常规方法培养金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)和α-毒素以及PVL-杀白细胞素;然后分别将细菌培养液高速离心,取上清液。再将饱和硫酸铵滴入上清液,搅拌均匀,4℃低温静罝12-24h后高速离心,弃上清液,取沉淀溶于pH7.8的盐酸缓冲液中,采用透析管进行多次透析;再将透析液置于4℃、30%的PEG6000中浓缩;最后,经Sephadex-75凝胶层析,即分别获得纯化的大肠杆菌肠毒素(LT、ST)和金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)和α-毒素以及PVL-杀白细胞素。
由于是作为免疫用的抗原成份,可不必经过亲和层析将其分离出不同型号外毒素。
由于细菌外毒素的抗原性普遍较差,在提取得到纯化的细菌外毒素后,最好参照前述有关“制备霉菌毒素抗原”同样方法和步骤做,即将大肠杆菌肠毒素(LT、ST)、金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)、金黄色葡萄球菌α-毒素、金黄色葡萄球菌PVL-杀白细胞素分别与载体蛋白连接起来制成载体蛋白偶联抗原,以提高其抗原性。同样可选择蛋白质类、多肽聚合物、大分子聚合物等作为偶联载体,选择如小分子肽类、双功能的亚氨酸酯等作为偶联试剂。从而,分别制成大肠杆菌肠毒素(LT、ST)载体蛋白偶联抗原、金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)载体蛋白偶联抗原、α-毒素载体蛋白偶联抗原、PVL-杀白细胞素载体蛋白偶联抗原。除此之外,也可采取基因工程重组细菌外毒素多肽蛋白抗原。具体操作过程如前所述,这里就不赘述。
3.制备细菌外毒素单一抗原
将所提取的大肠杆菌肠毒素(LT、ST)或大肠杆菌肠毒素(LT、ST)载体蛋白偶联抗原、金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)或金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)载体蛋白偶联抗原、α-毒素或α-毒素载体蛋白偶联抗原、PVL-杀白细胞素或PVL-杀白细胞素载体蛋白偶联抗原中其中一种按(10-1)∶(1-10)的比例加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得大肠杆菌肠毒素(LT、ST)单一抗原或金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)、α-毒素以及PVL-杀白细胞素单一抗原。如果采取基因工程重组细菌外毒素多肽蛋白抗原,以上单一抗原成份就更换为基因工程重组细菌外毒素多肽蛋白。
4.制备细菌外毒素复合抗原
将所提取的大肠杆菌肠毒素(LT、ST)或大肠杆菌肠毒素(LT、ST)载体蛋白偶联抗原、金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)或金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)载体蛋白偶联抗原、α-毒素或α-毒素载体蛋白偶联抗原、PVL-杀白细胞素或PVL-杀白细胞素载体蛋白偶联抗原按按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(10-1)的比例混合均匀,制成细菌外毒素混合物,再将这种细菌外毒素混合物按(10-1)∶(1-10)的比例加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得细菌外毒素复合抗原。
本发明以上制备步骤采用其中一种方法说明,但不限于这种方法。
(三)制备人和动物主要病原体复合抗原
1.根据流行病学调查,选定几种最常出现的、有代表性的人和动物混合感染病原体并按常规方法培养以下病毒和致病菌:
(1)猪常见混合感染病原体:
猪肠毒性大肠埃希氏菌(k88、k99、987p)、流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、口蹄疫病毒(增加腹泻死亡率)、猪伪狂犬病毒(增加腹泻死亡率)、轮状病毒轮状病毒(hV)。
(2)禽常见混合感染病原体:
禽大肠埃希氏菌菌、禽流感H5N1和禽流感H9N2、新城疫病毒、支原体、传染性法氏囊病毒。
(3)牛常见混合感染病原体:
牛肠毒性大肠埃希氏菌、B型魏氏梭菌、牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)、牛流行性腹泻病毒(PEDV)、牛轮状病毒(hV)。
(4)水产常见混合感染病原体
柱状嗜纤维菌、嗜水气单胞菌、水霉菌、绵霉菌、呼肠孤病毒、鱼疱疹病毒。
以上所举动物常见混合感染病原体在实际应用时,可针对不同动物、不同地区、不同养殖环境和疫情变化等情况选择不同病原体并且根据需要减少或增加病原体种类数。
(5)人类常见肠道病原体:
肠毒性大肠杆菌、空肠弯曲菌、轮状病毒、柯萨奇病毒、诺瓦克病毒。实际应用中,可根据情况选用其它人类常见病原体作为抗原成份。
2.制备人和动物病原体复合抗原
(1)制备猪病原体复合抗原:
将培养好的猪肠毒性大肠埃希氏菌(k88、k99、987p)、流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、口蹄疫病毒(增加腹泻死亡率)、猪伪狂犬病毒(增加腹泻死亡率)、轮状病毒轮状病毒(hV)按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)∶(10-1)∶(10-1)的比例混合均匀,制成猪病毒和致病菌混合物,再将这种猪病毒与致病菌混合物按(10-1)∶(1-10)的比例中加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得猪病原体复合抗原。
(2)制备禽病原体复合抗原:
将培养好的禽大肠埃希氏菌菌、禽流感H5N1和禽流感H9N2、新城疫病毒、支原体、传染性法氏囊病毒按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)∶(10-1)∶(10-1)的比例混合均匀,制成禽病毒和致病菌混合物,再将这种禽病毒和致病菌混合物按(10-1)∶(1-10)的比例中加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得禽病原体复合抗原。
(3)制备牛病原体复合抗原:
将培养好的牛肠毒性大肠埃希氏菌、B型魏氏梭菌、牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)、牛流行性腹泻病毒(PEDV)、牛轮状病毒(hV)按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)∶(10-1)的比例混合均匀,制成牛病毒和致病菌混合物,再将这种牛病毒和致病菌混合物按(10-1)∶(1-10)的比例加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得牛病原体复合抗原。
(4)制备水产病原体复合抗原:
将培养好的状嗜纤维菌、嗜水气单胞菌、水霉菌、绵霉菌、呼肠孤病毒、鱼疱疹病毒按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)∶(10-1)∶(10-1)的比例混合均匀,制成水产病毒和致病菌混合物,再将这种水产病毒和致病菌混合物按(10-1)∶(1-10)的比例中加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得水产病原体复合抗原。
以上所举动物常见混合感染病原体复合抗原的制备方法,在实际应用时,可针对不同动物、不同地区、不同养殖环境和疫情变化等情况选择不同动物并且根据需要减少或增加病原体种类数或者改变病原体种类以及进行不同的组合和按不同的比例配比。
(5)人类常见肠道病原体复合抗原:
将培养好的人肠毒性大肠杆菌、空肠弯曲菌、人轮状病毒、柯萨奇病毒、诺瓦克病毒按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)∶(10-1)∶(10-1)的比例混合均匀,制成人肠道病毒和致病菌混合物,再将这种人肠道病毒和致病菌混合物按(10-1)∶(1-10)的比例中加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得人肠道病原体复合抗原。
本发明以福氏佐剂抗原为例说明,实际应用时不限于这一方法。
二、制备IgY免疫蛋
(一)制备抗霉菌毒素IgY免疫蛋
将采用上述方法制备的霉菌毒素四合一复合抗原A4I和A4II以及B4I和B4II或者霉菌毒素八合一复合抗原A8和B8中之任意一种,或八种霉菌毒素中任意一种多肽蛋白抗原A1或霉菌毒素加牛血清白蛋白(BSA)的大分子抗原B1,或者猪病原体复合抗原和禽病原体复合抗原以及牛病原体复合抗原和水产病原体复合抗原中任意一种,分别对产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、鸵鸟等)进行免疫;每隔二周再强化注射一次,计免疫三次;第一次免疫20天后,分别检取产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、鸵鸟等)所产免疫蛋,并进行编码标记。即可分别制得相对应的抗霉菌毒素IgY免疫蛋。
(二)制备抗细菌外毒素IgY免疫蛋
将采用上述方法制备的细菌外毒素四种单一抗原或细菌外毒素复合抗原对产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、鸵鸟等)进行免疫;每隔二周再强化注射一次,计免疫三次;第一次免疫20天后,分别检取免疫的禽类所产免疫蛋,并进行编码标记。即制得五种抗细菌外毒素IgY免疫蛋。
(三)制备抗动物混合感染病原体IgY免疫蛋
将采用上述方法制备的猪病原体复合抗原和禽病原体复合抗原以及牛病原体复合抗原和水产病原体复合抗原中任意一种,分别对产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、鸵鸟等)进行免疫;每隔二周再强化注射一次,计免疫三次;第一次免疫20天后,分别检取免疫的禽类所产免疫蛋,并进行编码标记。即可分别制得相对应的抗动物混合感染病原体IgY免疫蛋。
(四)制备抗人混合感染病原体IgY免疫蛋
将采用上述方法制备的人肠道病原体复合抗原对产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、鸵鸟等)进行免疫;每隔二周再强化注射一次,计免疫三次;第一次免疫20天后,分别检取免疫的禽类所产免疫蛋,并进行编码标记。即制得抗人混合感染病原体IgY免疫蛋。
以上第(一)至(四)项所叙免疫方法和注射频率可根据不同抗原以及不同禽类的免疫应答情况作适当调整和变化。
三、制备IgY粗提物
本发明以纯水提取法为例说明,实际应用时不限于这一方法,可采用氯仿萃取法与冷乙醇沉淀法以及硫酸铵沉淀法等。
(一)制备抗霉菌毒素IgY粗提物
首先把根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同而分类标记编码的抗霉菌毒素IgY免疫蛋,用流动水洗净,酒精擦洗消毒,再用打蛋机打碎免疫蛋,采用蛋黄筛筛滤去蛋清,留下蛋黄,搅拌均匀;再按蛋黄液体积的3-8倍加入蒸馏水,进行稀释并混合均匀,用1.0mol/LHCI溶液调pH至5.5-6.5。
将调整好pH值的蛋黄稀释液进一步充分搅拌均匀,然后将其冷却至2-15℃,静置12-24小时;将稀释液于10,000rpm下离心20分钟;取分离所得的上清液置于超滤器中进行超滤浓缩10-20倍;继而加入2.0%海藻酸钠液,至终浓度为0.1%,搅拌至出现浑浊;再加入2.0%CaCl2液,至终浓度为0.1%,搅拌均匀,静置8-12小时;8,000rpm下离心20分钟,取上清液;0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌;UltiporVFTMDV50除病毒过滤器除去病毒;冷冻干燥,即分别制得以下几种抗霉菌毒素IgY粗提物:
1.抗黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A等四种霉菌毒素的四合一抗霉菌毒素A4I-IgY粗提物和四合一抗霉菌毒素B4I-IgY粗提物;
2.抗桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素四种霉菌毒素的四合一抗霉菌毒素A4II-IgY粗提物和四合一抗霉菌毒素B4II-IgY粗提物;
3.抗黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素8种霉菌毒素的八合一抗霉菌毒素A8-IgY粗提物和八合一抗霉菌毒素B8-IgY粗提物;
4.抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物、抗玉米赤霉烯酮-IgY粗提物、抗呕吐毒素-IgY粗提物、抗赭曲霉毒素A-IgY粗提物、抗桔青霉素-IgY粗提物、抗伏马毒素B1-IgY粗提物、抗青霉酸-IgY粗提物、抗T-2毒素-IgY粗提物。
最后,将所制备的对应不同抗原的抗霉菌毒素IgY粗提物进行编码标记。
当针对不同饲料残留的霉菌毒素不同、不同动物敏感的霉菌毒素不同、不同粮食以及不同的贮存条件等情况,减少或增加或者变换复合抗原的组成和组合时,所制得的抗霉菌毒素IgY粗提物也将随之变更。
(二)制备抗细菌外毒素IgY粗提物
把五种抗细菌外毒素IgY免疫蛋用流动水洗净,酒精擦洗消毒,再用打蛋机打碎免疫蛋,采用蛋黄筛筛滤去蛋清,留下蛋黄,搅拌均匀;再按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水,进行稀释并混合均匀,用1.0mol/LHCl溶液调pH至5.5-6.0。
将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀,然后将其冷却至2-6℃,静置12-24小时;将稀释液于10,000rpm下离心20分钟,取分离所得的上清液置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍;继而加入2.0%海藻酸钠液,至终浓度为0.1%,搅拌至出现浑浊;再加入2.0%CaCl2液,至终浓度为0.1%,搅拌均匀,3-4℃静置8-12小时;8,000rpm离心20分钟,取上清;0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌;UltiporVFTMDV50除病毒过滤器除去病毒;冷冻干燥,即制得五种抗细菌外毒素IgY粗提物:
1.抗大肠杆菌肠毒素(LT、ST)IgY粗提物;
2.抗金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)IgY粗提物;
3.抗金黄色葡萄球菌α-毒素IgY粗提物;
4.抗金黄色葡萄球菌PVL-杀白细胞素IgY粗提物;
5.抗细菌外毒素复合IgY粗提物。
(三)制备抗人和动物病原体IgY粗提物
首先把根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同而分类标记编码的抗动物病原体IgY免疫蛋以及抗人混合感染病原体IgY免疫蛋,用流动水洗净,酒精擦洗消毒,再分别用打蛋机打碎免疫蛋,采用蛋黄筛筛滤去蛋清,留下蛋黄,搅拌均匀;再按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水,进行稀释并混合均匀,用1.0mol/LHCI溶液调pH至5.5-6.0。
将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀,然后将其冷却至2-6℃,静置12小时-24小时;将稀释液于10,000rpm下离心20分钟;取分离所得的上清液置于超滤器中进行超滤浓缩10-20倍;继而加入2.0%海藻酸钠液,至终浓度为0.1%,搅拌至出现浑浊;再加入2.0%CaCl2液,至终浓度为0.1%,搅拌均匀,3-4℃静置8-12小时;8,000rpm下离心20分钟,取上清液;0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌;UltiporVFTMDV50除病毒过滤器除去病毒;冷冻干燥,即分别制得以下几种抗人和动物病原体IgY粗提物:
1.抗猪病原体IgY粗提物;
2.抗禽病原体IgY粗提物;
3.抗牛病原体IgY粗提物;
4.抗水产病原体IgY粗提物;
5.抗人混合感染病原体IgY粗提物。
四、制备IgY纯干粉
(一)制备抗霉菌毒素IgY纯干粉
分别将以上任意一种抗霉菌毒素IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01mol/LPB(磷酸盐缓冲液)液中,再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析,冷冻干燥,即分别制得以下几种抗霉菌毒素IgY纯干粉:
1.抗黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A四种霉菌毒素的四合一抗霉菌毒素A4I-IgY纯干粉和四合一抗霉菌毒素B4I-IgY纯干粉;
2.抗桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素四种霉菌毒素的四合一抗霉菌毒素A4II-IgY纯干粉和四合一抗霉菌毒素B4II-IgY纯干粉;
3.抗黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素8种霉菌毒素的八合一抗霉菌毒素A8-IgY纯干粉和八合一抗霉菌毒素B8-IgY纯干粉;
4.抗黄曲霉毒AFB1-IgY纯干粉、抗玉米赤霉烯酮-IgY纯干粉、抗呕吐毒素-IgY纯干粉、抗赭曲霉毒素A-IgY纯干粉、抗桔青霉素-IgY纯干粉、抗伏马毒素B1-IgY纯干粉、抗青霉酸-IgY纯干粉、抗T-2毒素-IgY纯干粉。
当针对不同饲料残留的霉菌毒素不同、不同动物敏感的霉菌毒素不同、不同粮食以及不同的贮存条件等情况,减少或增加或者变换复合抗原的组成和组合时,所制得的抗霉菌毒素IgY纯干粉也将随之变更。
(二)制备抗细菌外毒素IgY纯干粉
分别将以上制备的五种抗细菌外毒素IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB(磷酸盐缓冲液)液中,再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析,冷冻干燥,即分别制得五种抗细菌外毒素IgY纯干粉。
(三)制备抗人病原体IgY和抗动物病原体IgY纯干粉
分别将以上制备的抗人混合感染病原体IgY粗提物以及任意一种抗动物病原体IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB(磷酸盐缓冲液)液中,再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析,冷冻干燥,即分别制得以下几种抗动物病原体IgY纯干粉:
1.抗猪病原体IgY纯干粉;
2.抗禽病原体IgY纯干粉;
3.抗牛病原体IgY纯干粉;
4.抗水产病原体IgY纯干粉;
5.抗人混合感染病原体IgY纯干粉。
五、制备IgY纳米粉
取所制得的任意一种复合的或单一的抗霉菌毒素IgY纯干粉和复合的或单一的抗细菌外毒素IgY以及抗人混合感染病原体IgY或者任意一种抗动物病原体IgY,加入超微粉碎机中碾磨粉碎,加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子,制得相应的任意一种组合的或单一的抗霉菌毒素IgY纳米粉和复合的或单一的抗细菌外毒素IgY纳米粉以及抗人混合感染病原体IgY纳米粉或者任意一种抗动物病原体IgY纳米粉。
六、制备IgY纳米脂质体液晶微囊
把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中,再将任意一种组合的或单一的抗霉菌毒素IgY纳米粉和抗细菌外毒素IgY纳米粉以及抗人混合感染病原体IgY纳米粉或者任意一种抗动物病原体IgY纳米粉加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY纳米溶液,超声处理2min(每次处理0.5min,间歇0.5min)后,立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状,漩涡振荡使凝胶转相,再继续蒸发除尽乙醚,进而超高速离心(35000r/min,30min)分离除去未包入的IgY纳米粉,沉淀物用水洗二次,离心,得沉淀,用10mmol/LPBS稀释,即制得相应的任意一种复合的或单一的抗霉菌毒素IgY纳米脂质体液晶微囊和复合的或单一的抗细菌外毒素IgY纳米脂质体液晶微囊以及抗人混合感染病原体IgY纳米脂质体液晶微囊或者任意一种抗动物病原体IgY纳米脂质体液晶微囊。
以上以IgY纳米脂质体液晶微囊为例说明IgY的一种包被形式,实际应用时,也可制成常规微囊,也可采用常规脂质体包被或其他包被技术包被。
七、制备IgY组合物
选取上述步骤中制备的IgY粗提物进行组合,也可分别选用IgY纯干粉或IgY纳米粉或IgY纳米脂质体液晶微囊其中的一种进行组合,即可分别获得IgY粗提物组合物、IgY纯干粉组合物、IgY纳米粉组合物和IgY纳米脂质体液晶微囊组合物。
现以IgY粗提物组合方法进行说明:取所制得的任意一种组合的或单一的抗霉菌毒素IgY粗提物与复合的或单一的抗细菌外毒素IgY粗提物中一种按(10-1)∶(1-10)的比例混合,在混合机中充分搅拌均匀,就制得抗霉菌毒素与细菌外毒素IgY粗提物组合物。
将抗霉菌毒素与细菌外毒素IgY粗提物组合物分别与抗人混合感染病原体IgY粗提物或者任意一种抗动物病原体IgY粗提物按(10-1)∶(1-10)的比例混合,在混合机中充分搅拌均匀,就可分别制得专供人用的抗霉菌毒素与细菌外毒素及人病原体IgY粗提物组合物、专供猪用的抗霉菌毒素与细菌外毒素及猪病原体IgY粗提物组合物、专供禽用的抗霉菌毒素与细菌外毒素及禽病原体IgY粗提物组合物、专供牛用的抗霉菌毒素与细菌外毒素及牛病原体IgY粗提物组合物、专供水产用的抗霉菌毒素与细菌外毒素及水产病原体IgY粗提物组合物。
还可只将多种抗霉菌毒素IgY粗提物和五种抗细菌外毒素IgY粗提物其中一种分别与抗人混合感染病原体IgY粗提物或者任意一种抗动物病原体IgY粗提物按(10-1)∶(1-10)的比例混合,在混合机中充分搅拌均匀,就可分别制得专供人用的抗霉菌毒素(或细菌外毒素)与人病原体IgY粗提物组合物、专供猪用的抗霉菌毒素(或细菌外毒素)与猪病原体IgY粗提物组合物、专供禽用的抗霉菌毒素(或细菌外毒素)与禽病原体IgY粗提物组合物、专供牛用抗霉菌毒素(或细菌外毒素)与牛病原体IgY粗提物组合物、专供水产用的抗霉菌毒素(或细菌外毒素)与水产病原体IgY粗提物组合物。具体地说,若仅为了对付细菌外毒素引起的顽固性腹泻或深部化脓性炎症等疾病(对这类疾病抗生素基本无效),则只需使用单一的抗细菌外毒素IgY粗提物中一种与抗人或动物病原体IgY粗提物组合物(顽固性腹泻可只用抗大肠杆菌肠毒素IgY粗提物和抗金黄色葡萄球菌肠毒素IgY粗提物与抗人或动物病原体IgY粗提物组合物,而溃疡性炎症(如重度胃溃疡)和深部化脓性炎症(如奶牛乳房炎)则可只用抗金黄色葡萄球菌α-毒素IgY粗提物和抗金黄色葡萄球菌PVL-杀白细胞素IgY粗提物与抗人或动物病原体IgY粗提物组合物);反之,仅为了对付霉菌毒素感染疾病,则只需使用以抗霉菌毒素IgY粗提物与抗人或动物病原体IgY粗提物组合物。
所述IgY纯干粉或IgY纳米粉或IgY纳米脂质体液晶微囊也参照IgY粗提物组合方法分别进行组合,可以得到不同类型、不同功效的IgY组合物。
进一步地,本发明提供一种抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,包含由上述抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法所得的抗霉菌毒素IgY或抗细菌外毒素IgY或抗病原体IgY或抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY。所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体IgY或复合IgY制剂,其特征在于,所述抗霉菌毒素IgY或抗细菌外毒素IgY或抗病原体IgY或抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY为粗提物、纯干粉、纳米粉或纳米脂质体液晶微囊。
所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体的单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,所述抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体的单一IgY或复合IgY制剂还包括辅料或基料;选用所述抗霉菌毒素IgY或抗细菌外毒素IgY或抗病原体IgY或抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY以重量含量0.0001%以上任意比例与辅料或基料制成各种片剂、泡腾片、丸剂、胶囊剂、喷雾剂、粉剂、纳米微囊液、口服液剂、果冻或胶囊和微胶囊以及注射用粉针剂和水针剂、水产浸浴液、水剂,或者以重量含量0.0001%以上任意比例与化学药品、中药等配成复方组合制剂。
所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体的单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,所述制剂还包括赋形剂、填充剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种,胶囊辅料包括软胶囊和硬胶囊辅料。
所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体的单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,所述抗霉菌毒素IgY或抗细菌外毒素IgY或抗病原体IgY或抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY以重量含量0.0001%以上的任意比例添加到小麦、稻谷、大米、玉米、大豆等粮食和粮食中间加工产品或者玉米粕、豆粕及麸皮等饲料原料中,也可按重量含量0.0001%以上的任意比例添加到各种食品、副食品和食用油、调味剂中,如米制品、面制品、奶粉和液体奶等奶制品以及各种油产品和制品。
所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体的单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,所述抗霉菌毒素IgY或抗细菌外毒素IgY或抗病原体IgY或抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY直接作为饲料或配以玉米蛋白粉或小麦粉或氨基酸粉或工业葡萄糖等载体成份或辅料或溶剂,制成各种畜、禽用及水生动物用饲料抗霉剂或者饲料添加剂和预配料以及水剂。八、应用实施例
1.作为粮食和粮食中间加工产品以及食品、副食品和饲料原料抗霉剂:
将抗霉菌毒素IgY制剂中的任意一种或多种和抗细菌外毒素IgY制剂中的任意一种或多种按重量含量0.0001%以上的任意比例添加到小麦、稻谷、大米、玉米、大豆等粮食和粮食中间加工产品或者玉米粕、豆粕及麸皮等饲料原料中,也可按重量含量0.0001%以上的任意比例添加到各种食品、副食品和食用油、调味剂中,如米制品、面制品、奶粉和液体奶等奶制品以及各种油产品和制品。IgY制剂作为一种新的抗霉剂加入,可以有效清除粮食和粮食中间加工产品以及食品和饲料原料中残留的霉菌毒素和细菌外毒素,也可以有效阻止粮食和粮食中间加工产品以及食品、副食品和饲料原料中滋生霉菌毒素和细菌外毒素。可以在粮食和粮食中间加工产品以及食品、副食品和饲料原料生产加工的工序中添加,也可以在储存前拌料添加。如前强调的:“食品中的毒素不会因加工而灭活,普通的食物处理和烹饪方法也不会减少黄曲霉毒素的含量;同时,霉菌毒素和细菌外毒素具有对抗蛋白酶分解的特性,在消化道中不会被破坏”;因此,在粮食储存前和粮食中间加工以及食品、副食品和饲料原料生产加工前或中间,添加本发明的IgY制剂就显得非常十分必要。
由于IgY作为一种特异性抗体,抗霉菌毒素IgY和抗细菌外毒素IgY能特异性地与霉菌毒素和细菌外毒素特异性结合而将其完全中和变成一种无害又有营养价值的复合蛋白质。鉴于IgY无任何毒副作用,无臭无味,对粮食和粮食中间加工产品以及食品和饲料原料中的其他营养成份不会产生任何影响和干扰,也无任何异味和药物残留问题(而目前最普及的“吸附法”则存在矿物质味等有别于粮食和食品的异味以及有不同程度的残留),对粮食和粮食中间加工产品以及食品、副食品和饲料原料包括周围环境也毫无污染,是一种最理想的绿色、环保、安全的食品级抗霉产品。
据统计,全世界每年平均有2%的谷物由于霉变不能食用。按2011年全球谷物年产量23亿吨计,每年就有4600万吨左右的谷物因霉变而报废,仅谷物一项造成的经济损失已是令人震惊的天文数字。本发明能有效的解决这一问题,将给我国和世界各国带来巨大的经济效益。
2.作为饲料原料和饲料添加剂以及兽药:
将抗霉菌毒素IgY中的任意一种或多种与抗细菌外毒素IgY中的任意一种或多种,以及与抗猪病原体IgY中的任意一种或多种或抗禽病原体IgY中的任意一种或多种或抗牛病原体IgY中的任意一种或多种、抗水产病原体IgY中的任意一种或多种混合,相应的分别制得不同类型、不同功效、不同作用对象的IgY制剂;所述制得的不同类型、不同功效、不同作用对象的IgY及其制剂可以直接作为饲料,也可配以玉米蛋白粉或小麦粉或氨基酸粉或工业葡萄糖等载体成份或辅料或溶剂,制成各种畜禽用及水生动物用饲料抗霉剂或者饲料添加剂和预配料以及饮水剂。作为饲料成份时,IgY的重量含量配比在0.0001%以上,制成制剂时,所含IgY的重量含量比例也在0.0001%以上。也可添加适合的辅料或基料将IgY制成各种片剂、泡腾片、丸剂、胶囊剂、喷雾剂、粉剂、纳米微囊液、口服液剂、果涷或胶囊和微胶囊以及注射用粉针剂和水针剂、水产浸浴液、水剂,还可将这些IgY及其制剂以任意比例与化学药品、中药等配成复方组合制剂。这些制剂和复方组合制剂所含IgY的比例在0.0001%以上。
这些制剂和复方组合制剂所含抗霉菌毒素IgY和抗细菌外毒素IgY、抗各种动物常见病原体的IgY以及复合IgY可用于预防和治疗各种畜禽及水生动物霉菌毒素和细菌外毒素感染。动物食用这些饲料抗霉剂、饲料添加剂和预配料、饮水剂以及各种IgY制剂后,其中所含抗霉菌毒素IgY和抗细菌外毒素IgY、抗各种动物常见病原体的IgY以及复合IgY就会直接特异性的与相对应的霉菌毒素和细菌外毒素以及各种动物常见病原体结合,将其中和并抑灭;既根除了霉菌毒素这个导致混合感染的诱因,又消灭了细菌外毒素以及病毒和细菌等造成感染的病原体。从而,一方面消除霉菌毒素和细菌外毒素污染或感染,一方面有效预防和治疗霉菌毒素和细菌外毒素感染甚至中毒的疾病,特别是还可以有效预防和治疗由于霉菌毒素和细菌外毒素感染诱发的混合感染疾病,以多管齐下的方式达到彻底消除霉菌毒素和细菌外毒素危害的目的。
3.作为人用预防和治疗霉菌毒素和细菌毒素感染的保健食品和药品:
将抗霉菌毒素IgY中的任意一种或多种与抗细菌外毒素IgY中的任意一种或多种,以及与抗人混合感染病原体IgY中的一种或多种混合,添加氨基酸粉或工业葡萄糖等载体成份或辅料或溶剂和口服液,可制成各种保健食品;也可添加适合的辅料或基料制成各种片剂、泡腾片、丸剂、胶囊剂、喷雾剂、粉剂、纳米微囊液、口服液剂、果涷或胶囊和微胶囊以及注射用粉针剂和水针剂、水剂,还可将这些IgY及其制剂以任意比例与化学药品、中药等配成复方组合制剂。这些制剂和复方组合制含IgY的重量含量比例在0.0001%以上。这些含抗霉菌毒素IgY或者抗霉菌毒素和细菌外毒素及人混合感染病原体IgY组合物的保健食品和药品可用于预防和治疗霉菌毒素和细菌外毒素感染和中毒的疾病以及混合感染疾病。
与动物用药一样,人服用这些保健食品和药品后,这些保健食品和药品中所含的抗霉菌毒素IgY或者抗霉菌毒素IgY和细菌外毒素及人混合感染病原体复合IgY,既可直接在消化道抑灭霉菌毒素和细菌外毒素以及病原体,还可通过IgY特有的提升免疫细胞吞噬霉菌毒素和细菌外毒素的能力而把体内残留的霉菌毒素和细菌外毒素迅速清除掉;同时,其中一部分又可形成带抗体活性的小分子片段进入体内包括肝脏,直接中和并抑灭其中残留的霉菌毒素和细菌外毒素。如果在配方中采用这些单一或复合IgY纳米粉或IgY纳米脂质体液晶微囊,这种IgY纳米粉或IgY纳米脂质体液晶微囊对粘膜具有很强的渗透能力,可通过粘膜进入体内发生作用。
在以上所有制剂中还包括赋形剂、填充剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种,胶囊辅料包括软胶囊和硬胶囊辅料。
另外,由于IgY具有无任何毒副作用,又无臭无味,也无任何药物残留,特别是不会诱发细菌耐菌性,也不会象抗生素和化学药那样会破坏菌群生态平衡。这些特点也是其它抗霉剂和防霉剂以及化学药所没有的;因此,这是一种十分理想的绿色、环保、安全的抗霉菌毒素、细菌外毒素和人混合感染病原体的保健食品和药品。
以下结合具体试验例和实施例对本发明实用效果进行详细说明。
试验例一
抗霉菌毒素IgY对常见霉菌毒素的抗体结合效价检测
用“ELISA”方法(酶联免疫法),检测四合一抗霉菌毒素B4I-IgY纯干粉对黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A4种抗原的抗体结合效价,以及四合一抗霉菌毒素B4II-IgY纯干粉对桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素等4种抗原的抗体结合效价。结果如表1所示。
表1抗霉菌毒素IgY纯干粉对常见霉菌毒素的抗体结合效价
注:测试样本中的四合一抗霉菌毒素B4I-IgY和四合一抗霉菌毒素B4II-IgY溶液浓度均为1mg/mL。
从以上检测结果可看出,所制备的抗多种霉菌毒素IgY对所对应的抗原都有很高的抗体结合效价。由于所测试的样本已稀释了1000倍;试验结果的抗体效价数据显示,即使将四合一抗霉菌毒素B4I-IgY纯干粉和四合一抗霉菌毒素B4I-IgYI纯干粉稀释400万倍仍具有抑制霉毒素的生物活性。而实际应用时只稀释1-10万倍以下,根据免疫学常识,只要效价(P/N)≥2.1,就具有结合抗原的活性;因此,本发明的抗多种霉菌毒素IgY在实际应用时,可以对霉菌毒素产生相高强的抑灭作用。按此推算,本发明的IgY作为粮食和食品除霉剂以及作为饲料成份或添加剂,每公斤粮食和食品以及每公斤饲料所增加成本都只有五分钱左右;由此可见,本发明具有很好的实用性。
试验例二
抗细菌外毒素IgY对大肠杆菌肠毒素(LT、ST)以及金黄色葡萄球菌三种外毒素的抗体结合效价检测
用“ELISA”方法(酶联免疫法),检测抗细菌外毒素IgY对大肠杆菌肠毒素(LT、ST)以及金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)和α-毒素、PVL-杀白细胞素的抗体结合效价。结果如下表所示。
表2抗细菌外毒素IgY对细菌外毒素的抗体结合效价
注:测试样本中的抗细菌外毒素复合IgY溶液浓度均为1mg/mL。
从以上检测结果可看出,所制备的抗细菌外毒素复合IgY对所对应的抗原都有很高的抗体结合效价。由于所测试的样本已稀释了1000倍;试验结果的抗体效价数据显示,即使将抗细菌外毒素复合纯IgY纯干粉稀释800万倍仍具有抑制细菌外毒素的生物活性。而实际应用时只稀释1-10万倍以下,根据免疫学常识,只要效价(P/N)≥2.1,就具有结合抗原的活性;因此,本发明的抗细菌外毒素复合IgY在实际应用时,可以对细菌外毒素产生相高强的抑灭作用。按此推算,本发明的IgY作为饲料成份或添加剂,每公斤饲料所增加成本不到五分钱。作为药品成份所增加成本更是微乎其微的。从这方面也可看到,本发明具有很好的实用性。
试验例三
抗多种霉菌毒素IgY降解常见霉菌毒素的效果试验
1.材料
(1)八合一抗霉菌毒素B8-IgY纳米粉。
(2)标准霉菌毒素工作液(pH5.0)。
黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素8种霉菌毒素标准品,分别购自新加坡Pribo实验室。用pH5.0磷酸盐缓冲液配制霉菌毒素工作液。工作液中霉菌毒素的含量是根据饲料中霉菌毒素国家限量标准及实际生产情况而设定。
(3)仪器和试剂盒
THZ-82型恒温水浴振荡器;Bio-RadiMarkTM酶标仪;SK-1快速混匀器;Kubota2420型高速离心机;黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素酶联免疫定量试剂盒(荷兰,EURO-PROXIMA公司)。
2.试验方法
称取1.0mg八合一抗霉菌毒素B8-IgY纳米粉置于试管中,分别加入10mLpH5.0的8种霉菌毒素工作液中之一种。空白对照只加入10mLpH5.0的8种霉菌毒素工作液中之一种,而不添加八合一抗霉菌毒素B8-IgY纳米粉。将试验组和空白对照组试管都放在37℃恒温振荡器上,震荡1h。反应结束后于3500r/min离心10min,分别取上清液,分别采用ELISA法检测上清液中的霉菌毒素含量。
3.数理处理
根据检测到的毒素含量,按下列公式计算降解率。
Y=100×(A-B)/A
上式中:Y表示抗霉菌毒素IgY纳米粉对霉菌毒素的降解率;A表示空白对照组(即霉菌毒素工作液中不加抗霉菌毒素IgY纳米粉)霉菌毒素含量;B表示降解试验中上清液中霉菌毒素的含量。
表3抗霉菌毒素IgY纳米粉对霉菌毒素的降解情况
从检测结果可看出,本发明所制备的八合一抗霉菌毒素IgY对黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素8种霉菌毒素的降解率都达到100%,效果非常好。
试验例四
含0.01%八合一抗霉菌毒素IgY粗提物的猪饲料阻断常见霉菌毒素感染的效果试验
1.材料
(1)含0.01%八合一抗霉菌毒素A8-IgY粗提物的猪饲料。
(2)普通猪饲料。
(3)标准霉菌毒素工作液(pH5.0)
黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素8种霉菌毒素标准品,分别购自新加坡Pribo实验室;用pH5.0磷酸盐缓冲液配制霉菌毒素工作液,工作液中霉菌毒素的含量是根据饲料中霉菌毒素国家限量标准及实际生产情况而设定。
(3)主要仪器和试剂盒
实验室用小型超声波搅拌器;Bio-RadiMarkTM酶标仪;黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素酶联免疫定量试剂盒(荷兰,EURO-PROXIMA公司)。
2.试验方法
(1)配制饲料混悬液
称取10.0mg普通猪饲料,置入实验室用小型超声波搅拌器中,加入一定量去离子水采用超声波搅拌60min,配制成重量含量比例为0.01%的混悬液共100ml,置于试管A中。
称取10.0mg含0.01%八合一抗霉菌毒素A8-IgY粗提物的猪饲料,置入实验室用小型超声波搅拌器中,加入一定量去离子水采用超声波搅拌60min,配制成浓度为0.01%的混悬液共100ml,置于试管B中。
(2)加入霉菌毒素工作液
在A、B两个试管中都加入100μLpH5.0的8种霉菌毒素工作液中之一种,稍加摇匀。
(3)搅拌后取上清液检测
分别将A、B两个试管中的溶液置入实验室用小型超声波搅拌器中,超声搅拌30min。结束后分别于3500r/min离心10min,取上清液,分别采用ELISA法测定上清液中的霉菌毒素含量。
检测结果显示,含0.01%八合一抗霉菌毒素A8-IgY粗提物的猪饲料在强制加入黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素8种霉菌毒素的情况下,仍检测不到霉菌毒素;而普通饲料当加入黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素等8种霉菌毒素后,都能检测到高含量的霉菌毒素。说明本发明所制备的抗霉菌毒素IgY对常见的霉菌毒素具有确切的抑灭效果。
试验例五
抗霉菌毒素IgY禽饲料添加剂与霉菌毒素吸附剂对常见的四种霉菌毒素的作用效果对比试验
1.材料
(1)含80%四合一抗霉菌毒素B4I-IgY粗提物的禽饲料添加剂。
(2)兽药店采购的一种霉菌毒素吸附剂。
(3)普通猪饲料。
(4)标准霉菌毒素工作液(pH5.0)
黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A等4种霉菌毒素标准品,分别购自新加坡Pribo实验室;用pH5.0磷酸盐缓冲液配制霉菌毒素工作液,工作液中霉菌毒素的含量是根据饲料中霉菌毒素国家限量标准及生产实际情况而设定。
(5)主要仪器和试剂盒:
实验室用小型超声波搅拌器;Bio-RadiMarkTM酶标仪;黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A酶联免疫定量试剂盒(荷兰,EURO-PROXIMA公司)。
2.试验方法
(1)配制饲料混悬液
称取30.0mg普通猪饲料,置入实验室用小型超声波搅拌器中,加入一定量去离子水采用超声波搅拌60min,配制成浓度为0.01%的混悬液共300ml;
(2)配制受霉菌毒素污染的饲料混悬液
取300μLpH5.0的4种霉菌毒素工作液中之一种置入实验室用小型超声波搅拌器中,再加入配制好的饲料混悬液300ml,采用超声波搅拌30min,制成受霉菌毒素污染的饲料混悬液。
(3)称取10.0mg抗霉菌毒素IgY禽饲料添加剂,置入实验室用小型超声波搅拌器中,加入100ml受霉菌毒素污染的饲料混悬液,采用超声波搅拌60min,置于试管A中。
(4)称取10.0mg兽药店采购的一种霉菌毒素吸附剂,置入实验室用小型超声波搅拌器中,加入100ml受霉菌毒素污染的饲料混悬液,采用超声波搅拌60min,置于试管B中。
(5)剩余的100ml受霉菌毒素污染的饲料混悬液置于试管C中,作为空白对照。
(6)分别将A、B、C三个试管中的溶液于3500r/min离心10min,取上清液,分别采用ELISA法测定上清液中的霉菌毒素含量。
表4空白对照试管C溶液的上清液中的霉菌毒素含量
表5试管B溶液的上清液中的霉菌毒素含量
表6试管A溶液的上清液中的霉菌毒素含量
试验结果显示,受霉菌毒素污染的饲料采用兽药店采购的一种霉菌毒素吸附剂吸附霉菌毒素,吸附率最高为59%;因霉菌毒素无处不在,霉菌毒素吸附剂原本可能就吸附了霉菌毒素,造成添加吸附剂后,有些种类的霉菌毒素含量不降反升(详见表4和表5)。而受霉菌毒素污染的饲料添加含80%抗4种霉菌毒素IgY粗提物的禽饲料添加剂后,霉菌毒素被全部降解,含量立即降为零(详见表6)。说明本发明所制备的抗霉菌毒素IgY制剂对常见的霉菌毒素的抑灭效果比吸附剂强。
试验例六
玉米加入四合一抗霉菌毒素纯B4I-IgY纯干粉对贮存过程中霉菌毒素含量的影响
称取2000kg玉米平分为两组。一组为试验组按0.01%添加四合一抗霉菌毒素纯B4I-IgY纯干粉,充分混合均匀;另一组为空白对照组不添加四合一抗霉菌毒素纯B4I-IgY纯干粉。将两组玉米贮存在同一贮存条件的仓库内,第31天检测两组玉米中主要霉菌毒素含量。结果如下表所示。
表7抗多种霉菌毒素IgY纯干粉对霉菌毒素含量的影响
试验结果显示,未添加四合一抗霉菌毒素B4I-IgY纯干粉的对照组在仓库内贮存到第31天,玉米中主要霉菌毒素含量全部超标,其中呕吐毒素更严重超标7000多倍。而添加四合一抗霉菌毒素B4I-IgY纯干粉的试验组在同一贮存条件的仓库内贮存到第31天,玉米中主要霉菌毒素含量全部为零;证明本发明制备的抗多种霉菌毒素IgY制剂抑制霉菌毒素生长的效果十分明显。
试验例七
饲喂含0.01%抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物的牛饲料对牛奶中黄曲霉毒AFB1残留量和奶牛日产量的影响试验
(一)材料与方法
1.试验牛的选择根据年龄、胎次、泌乳阶段和产奶量相近的原则,选择经产荷斯坦牛30头,随机分为对照组和试验组,每组15头。试验开始前3周各组平均产奶量和乳成分的差异不显著。所有试验牛均在相同的条件下饲养。
2.饲养管理及试验设计试验采用单因素设计。两组基础饲料组成相同。试验组在精料补充料中表0.01%添加抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物,先用少量精料补充料预混抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物,再混合到试验组奶牛精料补充料中,并与其他饲料混合(TMR);对照组不添加抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物。每天饲喂3次,自由饮水。预试期7d,正试期为15d。
3.奶样的采集和分析试验在南宁皇氏乳业下属奶牛场进行。正试开始后记录每头牛试验期的产奶量,并在正式开始和结束当天采集奶样(一式两份),一份利用DHI分析仪分析奶样成分,另一份测定黄曲霉毒素M1含量。
4.统计分析试验数据用EXCEL和SPSS16.0进行分析,采用LSD法进行多重比较。
试验结果如下表。
表8抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物对牛奶中黄曲霉毒AFB1残留量和奶牛日产量的影响
从上表可见,试验组奶牛乳中黄曲霉毒素B1残留量大幅度下降至零,而对照组奶牛乳中黄曲霉毒素B1残留量则上升。同时,试验组奶牛的日产奶提高9%,乳蛋白含量提升10%;对照组的日产奶量和乳蛋白含量基本不变。
表9抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物提高经济效益的作用
(注:每头奶牛日平均消耗精饲料12kg,按0.01%比例添加抗黄曲霉毒AFB1-IgY纯干粉,每头奶牛日消耗抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物计0.0012kg,抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物单价以550元/kg计,则每头奶牛每日增加添加剂成本为0.078元)。
从上表可见,试验组奶牛仅日产奶量提高一项每天每头就多盈利11.25元,每头牛年收益约增加4056元。扣除人工成本,每头牛每年约可增加产奶收益3600元以上,说明在饲料中添加抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物除了可显著降低霉菌毒素含量外,还可明显提高奶牛养殖经济效益。
结论:试验结果显示,给经产奶牛饲喂含0.01%抗黄曲霉毒AFB1-IgY粗提物的牛饲料既可大幅度降低奶牛乳中黄曲霉毒素B1残留量,又能产生很好的经济效益。
试验例八
抗霉菌毒素IgY纯干粉对中性粒细胞吞噬功能影响的试验
(一)目的
研究抗霉菌毒素IgY制剂中的抗体是否能够促进白细胞增加对相应的霉菌毒素的吞噬作用,以提高白细胞的吞噬功能。
(二)原理
将一定浓度的抗霉菌毒素特异性IgY抗体与白细胞、相应的霉菌毒素混合,IgY与霉菌毒素特异性结合,改变了霉菌毒素的离子极性、表面电荷、电埸和结构,从而使得霉菌毒素更容易被中性粒细胞接近和吞噬。
(三)实验材料
1、抗黄曲霉毒素B1-IgY纯干粉。
2、肝素抗凝的静脉血。
3、霉菌毒素溶液:标准黄曲霉毒工作液(pH5.0),含黄曲霉毒AFB1。
4、瑞姬氏染色液,载玻片。
5、光学显微镜。
(四)方法
1、霉菌毒素溶液准备:购自新加坡Pribo实验室。用pH5.0磷酸盐缓冲液配制标准黄曲霉毒工作液。
2、肝素抗凝外周血白细胞分离:取静脉血2ml,置于加入肝素(30μ/ml)的小试管中,轻轻混匀,将试管直立静置于37℃培养箱中1h或室温静置1h;待红细胞自然沉降后,此时可见试管中的悬液分三层,上层淡黄色血浆,底层为红细胞,在紧贴红细胞层上有一呈灰白色的白细胞层;用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液,置于青霉素小瓶备用。
3、抗黄曲霉毒素B1-IgY抗体与霉菌毒素和白细胞共同培养:
(1)抗黄曲霉毒素B1-IgY纯干粉用10%的牛血清生理盐水稀释成9mg/ml、4.5mg/ml、0mg/ml等不同的浓度;
(2)将上述三个不同浓度的抗黄曲霉毒素B1-IgY纯干粉各30μL分别与静脉外周血白细胞30μL、标准黄曲霉毒工作液30μL混匀于青霉素小瓶内,斜放于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养30min,每10min轻摇一次,每个抗黄曲霉毒素B1-IgY纯干粉浓度组均做复孔。
4、制片和染色:用小吸管混匀培养细胞后,取一滴悬液置于玻片一端,推片(每孔推2张片),干燥后瑞姬氏染色。加瑞姬氏染液3滴,染色1min,加沙黄分色液5滴,染色5min,水冲洗,干燥。
5、光学显微镜观察和计数:400倍的高倍镜下计数200个嗜中性粒细胞,记下吞噬黄曲霉毒的数量及每个中性粒细胞吞入的黄曲霉毒的数量,按下式计算:
(1)细胞吞噬率(%)=吞噬霉菌毒素的细胞数/200X100%;
(2)吞噬指数=200个中性粒细胞吞噬的霉菌毒素总数/200。
6、统计学分析:t检查。
表10抗霉菌毒素IgY纯干粉提高白细胞吞噬功能的测试
表11抗霉菌毒素IgY纯干粉促进白细胞吞噬功能的t检查
试验结果显示,3mg/ml的IgY抗体组细胞吞噬率为81.63%±1.70%,吞噬指数为2.19±0.12;1.5mg/ml的IgY抗体组细胞吞噬率为77.25%±3.01%,吞噬指数为1.98±0.15;无IgY抗体对照组细胞吞噬率为63.13%±2.78%,吞噬指数为1.42±0.07;3mg/ml的IgY抗体组细胞吞噬率和吞噬指数与无IgY抗体对照组相比,P值分别为0.003和0.0004,分别为:P<0.002和P<0.0005;1.5mg/ml的IgY抗体组细胞吞噬率和吞噬指数与无IgY抗体对照组相比,P值分别为0.016和0.007,分别为:P<0.02和P<0.01;3mg/ml的IgY抗体组细胞吞噬率和吞噬指数与1.5mg/ml的IgY抗体组相比,P值分别为0.021和0.070,分别为:P<0.03和P>0.05。
从试验数据可以看到,抗霉菌毒素IgY纯干粉中的特异性IgY抗体有明显地促进静脉血白细胞增加对相应的霉菌毒素的吞噬作用,故增强了白细胞的吞噬功能(P<0.005和P<0.03);并且,特异性IgY抗体的浓度越高促进白细胞增加对相应的霉菌毒素的吞噬作用越强。
试验例九
胃蛋白酶对抗细菌外毒素IgY活性的影响试验
1.主要材料
(1)抗细菌外毒素IgY粗提物
(2)胃蛋白酶(酶活性1∶3000)
(3)抗原:肠毒性大肠杆菌外毒素(肠毒素)和金黄色葡萄球菌外毒素
2.主要仪器和试剂盒
实验室用小型超声波搅拌器;Bio-RadiMarkTM酶标仪。
3.试验方法
(1)配制抗细菌外毒素IgY溶液
称取100m抗细菌外毒素IgY粗提物,置入实验室用小型超声波搅拌器中,加入一定量去离子水采用超声波搅拌60min,配制成浓度为0.1%的抗细菌外毒素IgY溶液100ml;取IgY溶液小样至试管A中。
(2)分别采用肠毒性大肠杆菌外毒素(肠毒素)和金黄色葡萄球菌外毒素作为检测抗原,用“ELISA”方法(酶联免疫法)检测试管A中抗细菌外毒素IgY纳米粉溶液小样的抗体效价。
(3)配制1.0mg/ml胃蛋白酶溶液10ml:将1.0mg的胃蛋白酶加入到9.999ml水中,轻轻摇动,直至胃蛋白酶完全溶解;不要涡旋混合。
(4)将剩余抗细菌外毒素IgY溶液置入实验室用小型超声波搅拌器中,加入1.0ml胃蛋白酶溶液,采用超声波搅拌10min;调pH值至4.0,37℃放置24小时后,调pH值至8.0终止反应;再取混合液小样至试管B中。
(5)分别采用肠毒性大肠杆菌外毒素(肠毒素)和金黄色葡萄球菌外毒素作为检测抗原,用“ELISA”方法(酶联免疫法)检测试管B混合液小样的抗体效价。
表12胃蛋白酶对抗细菌外毒素IgY纳米粉活性的影响
从以上检测结果可看出,所制备的抗细菌外毒素IgY在pH值至4.0和37℃的条件下,经胃蛋白酶作用24小时仍可保持50%以上的活性。
下面通过具体实施例的配方和工艺对本发明的技术方案进行进一步详细说明。
实施例一
预防和治疗霉菌毒素感染的猪饲料添加剂
配方如下:
表13预防和治疗霉菌毒素感染的猪饲料添加剂的配方
工艺:
1、将配方量低聚果糖加入蔗糖中充分搅拌均匀,制得混合物A。
2、将混合物A加入配方量加益粉中,充分搅拌均匀,制得混合物B。
3、用等量放大法将混合物B与配方量猪用抗霉菌毒素和大肠杆菌肠毒素及猪病原体复合IgY充分混合均匀,制成粉剂成品。
4、全检合格后包装出厂。
实施例二
猪用预防和治疗霉菌毒素疾病口服液
配方如下:
表13猪用预防和治疗霉菌毒素疾病口服液的配方
工艺:
1、将配方量pH7.0的PBS缓冲液或蒸馏水煮沸后冷却至室温。
2、将配方量低聚果糖用冷却后的pH7.0的PBS缓冲液或蒸馏水溶解成
浓度20%的储备液。
3、先后将配方量猪用抗霉菌毒素和大肠杆菌肠毒素及猪病原体复合IgY纯干粉或过滤除菌后上清液和低聚果糖储备液加入剩余的pH7.0的PBS缓冲液或蒸馏水中,充分搅拌均匀。
4、用枸椽酸或0.1mol/L的NaOH溶液调pH至7.0,将药液灌入消毒过的500ml药用瓶中,热封后旋紧瓶盖,贴上瓶贴。
5、全检合格后包装出厂。
实施例三
猪用抗霉菌毒素IgY果冻型乳猪料。
配方如下:
表14猪用抗霉菌毒素IgY果冻型乳猪料的配方
工艺:
1、将配方量蒸馏水采用高压蒸气灭菌,加热到121-126℃,压力升至102.9kPa(1.05kg/cm2),停留60min,冷却到95℃,然后保持温度在95℃。
2、将配方量果冻粉加入占配方量90%的95℃的蒸馏水中溶解,充分搅拌均匀,制成果冻水溶液A。
3、将配方量糖液加热至95℃,然后加入到果汁果冻水溶液A中,再用大火迅速煮沸浓缩,边煮边搅拌,在20分钟内使混合液上升达106℃,这时即为浓缩终点,制成果冻浓浆B。
4、把占配方量10%的95℃的蒸馏水冷却到室温,再将配方量猪用抗霉菌毒素和大肠杆菌肠毒素及猪病原体复合IgY纯干粉或过滤除菌后上清液加入冷却到室温的蒸馏水中溶解,充分搅拌均匀,制成IgY水溶液C。
5、将果冻浓浆B冷却到室温,然后一边搅拌一边缓慢地将IgY水溶液C滴加入到果冻浓浆B中,高速(3000r/min)搅拌60min以上,即制成香甜可口的猪用抗霉菌毒素IgY果冻型乳猪料。
实施例四
提高蛋鸡产蛋率的禽饲料添加剂-IgY蛋多多
配方如下:
表15提高蛋鸡产蛋率的禽饲料添加剂-IgY蛋多多的配方
工艺:
1.采用等量放大稀释法将配方量维生素C加入中混合均匀,制成混合物A。
2.采用等量放大稀释法将混合物A加入禽用抗霉菌毒素和细菌外毒素及禽病原体复合IgY中混合均匀,搅拌30min以上,充分混合均匀,制成IgY蛋多多鸡饲料添加剂成品。
实施例五
禽用预防和治疗霉菌毒素和大肠杆菌肠毒素及禽病原体感染疾病IgY水剂
配方如下:
表16禽用预防和治疗霉菌毒素和大肠杆菌肠毒素及禽病原体感染疾病IgY水剂配方
工艺:
1、将配方量pH7.0的PBS缓冲液或纯净水煮沸后冷却至室温。
2、将配方量禽用抗霉菌毒素和大肠杆菌肠毒素及禽病原体复合IgY纯干粉或过滤除菌后上清液加入冷却至室温的pH7.0的PBS缓冲液或纯净水中,充分搅拌均匀。
3、用枸椽酸或0.1mol/L的NaOH溶液调pH至7.0,将药液灌入消毒过的500ml药用瓶中,热封后旋紧瓶盖,贴上瓶贴。
4、全检合格后包装出厂。
实施例六
治疗奶牛重度乳房炎用纳米微囊IgY乳房灌注剂
配方如下:
表17治疗奶牛重度乳房炎用纳米微囊IgY乳房灌注剂的配方
工艺:
1、将吐温加热至50℃,一边搅拌一边将大豆油徐徐滴加入到吐温中,高速(3000r/min)搅拌15min,保持温度在50℃,得到溶液A。
2、一边搅拌一边将助表面活性剂徐徐滴加入到溶液A中,高速(3000r/min)搅拌30min,冷却到室温,得到溶液B。
3、将配方量蒸馏水采用高压蒸气灭菌,加热到121-126℃,压力升至102.9kPa(1.05kg/cm2),停留60min,然后冷却到室温。
4、分别将配方量抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素复合IgY纯干粉或过滤除菌后上清液与抗牛乳房炎耐药菌复合IgY纯干粉或过滤除菌后上清液加入高温灭菌后冷却到室温的蒸馏水中溶解,充分搅拌均匀,制成IgY水溶液C。
5、一边搅拌一边缓慢地将IgY水溶液C滴加入到溶液B中,高速(3000r/min)搅拌60min以上,得到纳米微囊溶液D。经检测,溶液D的80%粒径在2-50μm范围,平均收率可达91.4%。
6、用枸椽酸或0.1mol/L的NaOH溶液调pH至7.0,将纳米微囊溶液D分装灌入消毒过的20ml塑料注射管中,贴上瓶贴。
7、全检合格后包装出厂。
目前金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎治愈率最低,其根本原因就是金黄色葡萄球菌α-毒素破坏了乳腺组织细胞,造成深度化浓性溃疡;而金黄色葡萄球菌PVL-杀白细胞素又损害了乳房内的天然免疫屏障,进一步加重了病情。乳腺组织一旦受损是很难修复的;这也就是许多奶牛乳房炎无药可治的根源。而抗生素等对这种穿孔毒素导致的深度感染是毫无作用的。本实例采用专门针对金黄色葡萄球菌α-毒素和PVL-杀白细胞素的复合IgY制成特殊乳房灌注剂,就可使这个长期困扰奶牛养殖业的难题迎刃而解。
实施例七
降低体细胞数和提高奶产量的奶牛饲料添加剂
配方如下:
表18降低体细胞数和提高奶产量的奶牛饲料添加剂的配方
工艺:
1、将配方量牛用抗霉菌毒素和大肠杆菌肠毒素及牛病原体复合IgY纯干粉与配方量抗牛乳房炎耐药菌复合IgY纯干粉混合,充分搅拌均匀,制得混合物A。
2、用等量放大法将配方量低聚果糖与混合物A充分混合均匀,制得混合物B。
3、将混合物B与配方量抗葡萄糖混合,充分搅拌均匀,制得成品粉剂。
4、全检合格后包装出厂。
实施例八
水产用抗霉菌毒素水溶液
配方如下:
表19水产用抗霉菌毒素水溶液的配方
工艺:
1.将配方量pH7.0的PBS缓冲液或纯净水煮沸后冷却至室温。
2.将配方量水产专用抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素及水产病原体复合IgY纯干粉或过滤除菌后上清液加入冷却至室温的pH7.0的PBS缓冲液或去离子水中,充分搅拌均匀。
3、用枸椽酸或0.1mol/L的NaOH溶液调pH至7.0,将药液灌入消毒过的500ml药用瓶中,热封后旋紧瓶盖,贴上瓶贴。
4、全检合格后包装出厂。
实施例九
抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY凝胶剂的制备
配方如下:
表20抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY凝胶剂的配方
工艺:
1.将配方量蒸馏水煮沸后冷却至室温。
2.将配方量桉叶油和甘油以及薄荷油、薄荷香精用乙醇溶解,得油相。
3.一边搅拌一边将羟丙甲基纤维素加入冷却至室温的蒸馏水中,得溶涨好的羧甲基纤维素钠。
4.一边搅拌一边先后将抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素复合IgY纯干粉或过滤除菌后上清液和油相加入溶涨好的羧甲基纤维素钠中,搅拌均匀,即制得专用于治疗化浓性创伤(外伤或烧伤)和溃疡(伤口深度或口蹄疫继发感染溃疡)的凝胶剂。
实施例十
抗霉菌毒素和和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY喷雾剂的制备
配方如下:
表21抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY喷雾剂的配方
工艺:
1.取700mL蒸馏水加热至沸,停止加热,冷却至90℃分别加入S-40、分散剂,搅拌30分钟以上,溶解均匀;室温冷却至40℃左右,成溶液A,备用。
2.取抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY纯干粉或过滤除菌后上清液溶于新沸过并冷却至室温的蒸馏水约200mL中搅匀,成溶液B,备用。
3.取配方量的薄荷油和香精,加95%以上的酒精溶解,再加入甘油及吐温-80,搅拌30分钟以上直至均匀,成溶液C,备用。
4.将溶液B在搅拌下加于40℃溶液A中搅匀;再将溶液C在搅拌下加于溶液A及B的混合液中,搅拌30分钟以上,混合均匀制成溶液D。
5.调节溶液D的pH值至6.8-7.2。
6.补加灭菌后冷却至40℃以下的蒸馏水至1,000ml,搅拌1小时以上,充分搅匀,制成最终溶液。然后用塑料或铝质喷雾瓶灌装、封口、包装,检验合格出厂,即制得专用于治疗化浓性创伤(外伤或烧伤)和溃疡(伤口深度或口蹄疫继发感染溃疡)的喷雾剂。
实施例十一
含抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY的治疗重度胃溃疡口服剂制备
配方如下:
表22含IgY的治疗重度胃溃疡口服剂的配方
工艺:
分别将抗霉菌毒素和和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY纯干粉或过滤除菌后上清液和抗耐药幽门杆菌和球菌以及相关酶和黏附素复合IgY纯干粉或过滤除菌后上清液溶于蒸馏水中,混匀;将薄荷脑、香精加入乙醇溶解,再加PEG400混匀,在搅拌下加入上述IgY制剂溶液搅匀、过滤,补加蒸馏水至全量,调pH至6.8。将药液灌入常压塑料瓶中,热封贴标签。检验合格出厂。
实施例十二
含抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY的治疗重度胃溃疡口含片制备
配方如下:
表23含IgY的治疗重度胃溃疡口含片的配方
工艺:
1、山梨糖醇与阿斯巴甜充分混合均匀,过60目筛两次备用。
2、羧甲基纤维素分散于30%乙醇中制成1%乙醇溶液。
3、将1项用适量2项制软材,14目筛网制粒,60℃通风干燥,18目筛整粒。
4、用40目筛筛出适量细粉与抗霉菌毒素和和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY纳米粉和抗耐药幽门杆菌和球菌以及相关酶和黏附素复合IgY纳米脂质体液晶微囊充分混匀并喷入薄荷、香橙香精搅匀,再拌入硬脂酸镁,一起与整批颗粒混合均匀,密闭4小时以上。
5、压片,每片600mg。
6、检验合格后包装出厂。
实施例十三
含抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY的治疗重度胃溃疡泡腾片的制备
配方如下:
表24含IgY的治疗重度胃溃疡泡腾片的配方
工艺:
1.NaHCO360℃干燥2h,加20%PEG乙醇液适量制软材,14目尼龙筛制粒60℃干燥备用。
2.枸椽酸、乳糖、MCC混匀80目粉碎,加于2%HPMC醇液中搅匀。
3.加入抗霉菌毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素及PVL-杀白细胞素IgY纳米粉和抗耐药幽门杆菌和球菌以及相关酶和黏附素复合IgY纳米脂质体液晶微囊、氢氧化铝混匀过一次14目筛,再加硬脂酸镁混匀压片即得。
4.检验合格后水泡眼包装,外套铝塑复合膜塑料袋密封,装盒,装箱入库。
实施例十四
用于治疗严重腹泻的抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY口服液的制备
配方如下:
表25用于治疗严重腹泻的IgY口服液的配方
工艺:
1、将配方量蒸馏水煮沸后冷却至室温;
2、将配方量抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY纯干粉或过滤除菌后上清液和葡萄糖以及低聚果糖分别加入pH7.0的PBS缓冲液中,充分搅拌均匀。
3、用枸椽酸或0.1mol/L的NaOH溶液调pH至7.0。将药液灌入消毒过的100ml药用瓶中,热封后旋紧瓶盖,贴上瓶贴。
实施例十五
用于治疗严重腹泻的抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY片剂的制备
配方如下:
表26用于治疗严重腹泻的IgY片剂的配方
工艺:
1、山梨糖醇过60目筛两次备用。
2、羧甲基纤维素分散于30%乙醇中制成1%乙醇溶液。
3、将1项用适量2项制软材,14目筛网制粒,60℃通风干燥,18目筛整粒。用40目筛筛出适量细粉与抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY纯干粉充分混匀。
4、再拌入硬脂酸镁,一起与整批颗粒混合均匀,密闭4小时以上。
5、压片机压片,每片600mg。
6、检验合格后,包装,全验出厂。
实施例十六
用于治疗严重腹泻的抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY泡腾片的制备
配方如下:
表27用于治疗严重腹泻的IgY泡腾片的配方
工艺:
1.NaHCO360℃干燥2h,加20%PEG乙醇液适量制软材,14目尼龙筛制粒60℃干燥备用。
2.枸椽酸、乳糖、MCC混匀80目粉碎,加于2%HPMC醇液中搅匀。
3.加入抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY纯干粉、氢氧化铝混匀过一次14目筛,再加硬脂酸镁混匀压片即得。
4.检验合格后水泡眼包装,外套铝塑复合膜塑料袋密封,装盒,装箱入库。
实施例十七
用于治疗严重腹泻的抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY胶囊的制备
配方如下:
表28用于治疗严重腹泻的IgY胶囊的配方
工艺:
1、按配方量将抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY纯干粉和药用葡萄糖按重量比1:1比例混合,充分搅拌均匀。
2、用胶囊充填机将复合IgY纯干粉和药用葡萄糖混合物定量分装入药用胶囊,每粒装300mg。
3、将胶囊装瓶,检验出厂。
实施例十八
用于治疗严重腹泻的抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY软胶囊的制备
配方如下:
表29用于治疗严重腹泻的IgY软胶囊的配方
工艺:
1、将吐温加热至50℃,一边搅拌一边将大豆油徐徐滴加入到吐温中,高速(3000r|min)搅拌15min,冷却到室温,得到溶液A。
3、将配方量蒸馏水采用高压蒸气灭菌,加热到121-126℃,压力升至102.9kPa(1.05kg/cm2),停留60min,然后冷却到室温。
4、将配方量抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY纯干粉或纳米粉或过滤除菌后上清液先用高温灭菌后冷却到室温的蒸馏水溶解,充分搅拌均匀,制成IgY水溶液B。
5、一边搅拌一边缓慢地抗金黄色葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素及人混合感染病原体复合IgY水溶液B加入到溶液A中,高速(3000r|min)搅拌60min以上,得到纳米微囊溶液C。经检测,溶液C中80%粒径在2-50μm范围,平均收率可达91.4%。
6、将所制成的纳米微囊溶液C加入软胶囊机滚压模切断成型,每粒300mg。
7、将压模成型的软胶囊干燥定型。
8、采用铝塑包装机包装。
9、纸盒包装,检验合格出厂。
实施例十九
用于清除霉菌毒素和预防致病菌感染的抗霉菌毒素和人混合感染病原体IgY保健食品口含片的制备
配方如下:
表30抗霉菌毒素和人混合感染病原体IgY保健食品口含片的配方
工艺:
1、山梨糖醇和低聚果糖与阿斯巴甜充分混合均匀,过60目筛两次备用。
2、羧甲基纤维素分散于30%乙醇中制成1%乙醇溶液。
3、将1项用适量2项制软材,14目筛网制粒,60℃通风干燥,18目筛整粒。
4、用40目筛筛出适量细粉与抗霉菌毒素IgY纳米脂质体液晶微囊和人混合感染病原体复合IgY纯干粉充分混匀并喷入薄荷、香橙香精搅匀,再拌入硬脂酸镁,一起与整批颗粒混合均匀,密闭4小时以上。
5、压片,每片600mg。
6、检验合格后包装出厂。
鉴于食品中的毒素不会因加工而灭活,食物烹饪过程也不可能减少霉菌毒素的含量,而且毒素在消化道中也不会被破坏,其危害远胜致病菌和病毒;因此,人们每天都可能受到霉菌毒素的侵害,大多数人的肝脏也都或多或少储藏有霉菌毒素,这些都严重影响身体健康。本实例是专门为此设计的人人必备的保健食品。实际应用时,还可制成其他剂型的除毒保健食品,如含抗霉菌毒素和人混合感染病原体复合IgY的胶囊和软胶囊或者各种口服液;也可将抗霉菌毒素和人混合感染病原体复合IgY或本发明的一系列IgY或复合IgY中一种或多种直接作为食品成份加入各种食品中,从源头消除霉菌毒素的危害。
本发明的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体IgY或复合IgY及其制剂还具有以下几个方面的独特优势:
第一、在消除霉菌毒素感染方面
一、试验例八证明,IgY会大幅度提升白细胞吞噬功能,人和动物食用了本发明制备的各种IgY制剂或组合剂后,其中所含的IgY会使人和动物体内的白细胞吞噬霉菌毒素和细菌外毒素的能力大幅提升而迅速把体内残留的霉菌毒素和细菌外毒素清除掉。IgY提升免疫细胞吞噬能力的作用正好弥补霉菌毒素和细菌外毒素破坏人和动物机体的免疫系统的负面作用。
二、根据本发明试验例九的试验,IgY在pH4.0和37℃的环境中经24小时,其活性仅下降50%左右,这表明本发明的各种抗霉菌毒素和细菌外毒素IgY以及复合IgY供幼童或幼畜使用时,胃蛋白酶对IgY活性影响有限(如果是提供给成人或中大猪使用,则最好采用脂质体IgY或其他形式包被的IgY)。另外,科学试验显示,IgY既使被胃蛋白酶分解成小分子的片段,其片段仍保持一定的活性;因此,本发明的各种制剂中所含的一部分抗霉菌毒素IgY或抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY会以带抗体活性的小分子片段形式进入体内包括进入肝脏,直接中和并抑灭其中残留的霉菌毒素和细菌外毒素。
三、本发明提供了抗霉菌毒素IgY与抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY纳米粉或纳米脂质体液晶微囊的制备方法,这些IgY或复合IgY纳米粉或纳米脂质体液晶微囊对粘膜具有很强的渗透能力,可通过粘膜进入体内发生作用。
这些特点都使本发明的抗霉菌毒素IgY与抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY既可预防霉菌毒素和细菌外毒素侵染人和动物的机体,又可有效清除已进入体内特别是肝脏内的霉菌毒素和细菌外毒素。这是其他除霉剂、抗生素和抗病毒药以及其他防霉、抗霉产品都做不到的。
第二、在治疗深度感染疾病方面
一、大肠杆菌肠毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素侵染肠粘膜后,会直接破坏粘膜细胞,引起久治不愈的严重腹泻。
二、金黄色葡萄球菌PVL-杀白细胞素会破坏皮肤和粘膜的天然免疫屏障,金黄色葡萄球菌肠毒素又促使炎症细胞因子显著增加,致使炎症细胞浸润机体组织,使组织坏死;同时,金黄色葡萄球菌α-毒素会在机体细胞膜上形成孔道,导致细胞破裂;从而,使牛乳房炎、各种发炎或溃烂以及创伤和烧伤等转变成难治的深度化脓性感染。
三、金黄色葡萄球菌肠毒素α-毒素使胃粘膜细胞破裂,形成急慢性胃溃疡。
对于这类细菌外毒素导致的深度感染疾病,抗生素和抗病毒西药疗效普遍不佳,造成医务人员往往束手无策,甚至越治越严重。而本发明的抗细菌外毒素复合IgY能特异性地与大肠杆菌肠毒素和金黄色葡萄球菌α-毒素以及PVL-杀白细胞素结合而将其抑灭,达到药到病除的目的;解决了长期困扰国际医药界的难题。
以上的试验例和实施例只是以其中一个试验方法和实施方案加以说明,实际应用时,可根据情况变更试验方法以及更换实际案例的配方成份和工艺;但是,都在本发明的技术范围内。
同样,以上所述仅为本发明的较佳实验例和实施例,并非对本发明的技术范围作任何限制,凡是依据本发明的技术实质对上面的试验例和实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰,以及对本发明第八条(应用)中所例举的所有应用的任何等同变化,均仍属于本发明技术的范围内。
本发明未述及之处适用于现有技术。
Claims (10)
1.一种抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备抗原:选取霉菌毒素、细菌外毒素或病原体,采用基因工程重组蛋白或偶联载体蛋白或常规方法,分别制成抗原;
(2)将步骤(1)制备出的霉菌毒素抗原、细菌外毒素抗原或病原体抗原其中的一种或混合多种按(10-1)∶(1-10)的比例加入福氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8,000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得不同种类的免疫用抗原;
(3)将步骤(2)制备出的免疫用抗原对产蛋禽类进行免疫;每隔二周再强化注射一次,计免疫三次;第一次免疫20天后,分别检取产蛋禽类所产免疫蛋,并进行编码标记,即可分别制得相对应的抗霉菌毒素IgY免疫蛋、抗细菌外毒素IgY免疫蛋和抗病原体IgY免疫蛋;
(4)将步骤(3)制得的抗霉菌毒素IgY免疫蛋、抗细菌外毒素IgY免疫蛋或抗病原体IgY免疫蛋用流动水洗净,酒精擦洗消毒,再用打蛋机打碎免疫蛋,采用蛋黄筛筛滤去蛋清,留下蛋黄,搅拌均匀;再按蛋黄液体积的3-8倍加入蒸馏水,进行稀释并混合均匀,用1.0mol/LHCl溶液调pH至5.5-6.5;将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀,然后将其冷却至2-15℃,静置12-24小时;将稀释液于10,000rpm下离心20分钟;取分离所得的上清液置于超滤器中进行超滤浓缩10-20倍;继而加入重量百分数2.0%的海藻酸钠液,至终浓度为0.1%,搅拌至出现浑浊;再加入重量百分数2.0%CaCl2溶液,至终浓度为0.1%,搅拌均匀,30-40℃静置8-12小时;8,000rpm下离心20分钟,取上清液,用0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌;然后用UltiporVFTMDV50除病毒过滤器除去病毒;冷冻干燥,即分别制得抗霉菌毒素IgY粗提物、抗细菌外毒素IgY粗提物和抗病原体IgY粗提物;
(5)将步骤(4)中制得的抗霉菌毒素IgY粗提物、抗细菌外毒素IgY粗提物或抗病原体IgY粗提物分别溶解于pH7.0、0.01mol/L磷酸盐缓冲液中,再依次分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析,冷冻干燥或低温喷雾干燥,即相应制得抗霉菌毒素IgY纯干粉、抗细菌外毒素IgY纯干粉和抗病原体IgY纯干粉;
(6)将步骤(5)中制得的抗霉菌毒素IgY纯干粉、抗细菌外毒素IgY纯干粉或抗病原体IgY纯干粉,加入到超微粉碎机中碾磨粉碎,加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子,即相应制得抗霉菌毒素IgY纳米粉、抗细菌外毒素IgY纳米粉和抗病原体IgY纳米粉;
(7)制备IgY纳米脂质体液晶微囊:把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中,再将步骤(6)中制备的抗霉菌毒素IgY纳米粉、抗细菌外毒素IgY纳米粉或抗病原体IgY纳米粉加入4mmol/L磷酸盐缓冲液配成抗毒素IgY纳米粉溶液,超声处理2min(每处理0.5min,间歇0.5min),立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状,漩涡振荡使凝胶转相,再继续蒸发除尽乙醚,进而超速离心(35000r/min,30min)分离除去未包入的抗毒素IgY纳米粉,将沉淀用水洗二次,离心,取沉淀,用10mmol/L磷酸盐缓冲液稀释,即相应制得抗霉菌毒素IgY纳米脂质体液晶微囊、抗细菌外毒素IgY纳米脂质体液晶微囊和抗病原体IgY纳米脂质体液晶微囊;
(8)将步骤(4)-(7)所得的4组产物组内复合,即得4种状态的多种抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY。
2.根据权利要求1所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法,其特征在于:所述霉菌毒素包括黄曲霉毒AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐烯醇)、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸、T-2毒素以及任何一种霉菌毒素;
所述细菌外毒素包括大肠杆菌肠毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素、金黄色葡萄球菌α-毒素、金黄色葡萄球菌PVL-杀白细胞素以及任何一种细菌外毒素。
3.根据权利要求1所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法,其特征在于:所述病原体包括人感染病原体和动物感染病原体;所述人感染病原体包括肠毒性大肠杆菌、空肠弯曲菌、轮状病毒、柯萨奇病毒和诺瓦克病毒以及其他人致病菌和病毒;所述动物感染病原体包括猪感染病原体、禽感染病原体、牛感染病原体和水产感染病原体;
所述猪感染病原体包括猪肠毒性大肠埃希氏菌k88、猪肠毒性大肠埃希氏菌k99、猪肠毒性大肠埃希氏菌987p、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒和轮状病毒轮状病毒以及其他猪致病菌和病毒;
所述禽感染病原体包括禽大肠埃希氏菌、禽流感H5N1、禽流感H9N2、新城疫病毒、支原体和传染性法氏囊病毒以及其他禽致病菌和病毒;
所述牛感染病原体包括牛肠毒性大肠埃希氏菌、B型魏氏梭菌、牛传染性胃肠炎病毒、牛流行性腹泻病毒和牛轮状病毒以及其他牛致病菌和病毒;
所述水产感染病原体包括柱状嗜纤维菌、嗜水气单胞菌、水霉菌、绵霉菌、呼肠孤病毒和鱼疱疹病毒以及其他水产致病菌和病毒。
4.根据权利要求1所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中的霉菌毒素抗原为一种或多种混合;所述细菌外毒素抗原为一种或多种混合;所述病原体抗原为猪感染病原体中的一种或多种混合、禽感染病原体中的一种或多种混合、牛感染病原体中的一种或多种混合或水产感染病原体中的一种或多种混合、人感染病原体中的一种或多种混合。
5.一种抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,包含由权利要求1-4任一项所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY制备方法所得的抗霉菌毒素IgY或抗细菌外毒素IgY或抗病原体IgY或各种组合的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY。
6.根据权利要求5所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,所述抗霉菌毒素IgY或抗细菌外毒素IgY或抗病原体IgY或抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY为粗提物、纯干粉、纳米粉或纳米脂质体液晶微囊。
7.根据权利要求6所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,所述抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体IgY或复合IgY制剂还包括辅料或基料;选用所述抗霉菌毒素IgY或抗细菌外毒素IgY或抗病原体IgY或抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY以重量含量0.0001%以上任意比例与辅料或基料制成各种片剂、泡腾片、丸剂、胶囊剂、喷雾剂、粉剂、纳米微囊液、口服液剂、果冻或胶囊和微胶囊以及注射用粉针剂和水针剂、水产浸浴液、水剂,或者以重量含量0.0001%以上任意比例与化学药品、中药等配成复方组合制剂。
8.根据权利要求7所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,所述制剂还包括赋形剂、填充剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种,胶囊辅料包括软胶囊和硬胶囊辅料。
9.根据权利要求5所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,所述抗霉菌毒素IgY或抗细菌外毒素IgY或抗病原体IgY或抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY以重量含量0.0001%以上的任意比例添加到小麦、稻谷、大米、玉米、大豆等粮食和粮食中间加工产品或者玉米粕、豆粕及麸皮等饲料原料中,也可按重量含量0.0001%以上的任意比例添加到各种食品、副食品和食用油、调味剂中,如米制品、面制品、奶粉和液体奶等奶制品以及各种油产品和制品。
10.根据权利要求5所述的抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体单一IgY或复合IgY制剂,其特征在于,所述抗霉菌毒素IgY或抗细菌外毒素IgY或抗病原体IgY或抗霉菌毒素和细菌外毒素及病原体复合IgY直接作为饲料或配以玉米蛋白粉或小麦粉或氨基酸粉或工业葡萄糖等载体成份或辅料或溶剂,制成各种畜、禽用及水生动物用饲料抗霉剂或者饲料添加剂和预配料以及水剂。
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