CN115215942A - 抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法 - Google Patents

抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法，制备乙型肝炎表面抗原、核心抗原和e抗原载体蛋白偶联物，选择6‑8周龄的小鼠，进行单独分区饲养，将乙肝蛋白抗原偶联物与完全佐剂混匀，对小鼠进行皮下免疫，2周后，对麻醉后的小鼠进行脾内免疫，再过一周后处死小鼠，取出脾脏，将其置于培养液中体外免疫培养，3天后取上清进行效价检测。本发明建立了一种抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫的方法，通过将三种抗原偶联到载体蛋白上对小鼠进行免疫，经过一次融合可以获得三种乙型肝炎单克隆抗体，缩短免疫周期，降低成本，提高筛选效率。

Description

抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法
技术领域
本发明属于技术诊断领域，具体涉及一种抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫的方法。
背景技术
乙型肝炎（Hepatitis Bvirus，HBV）是一种DNA病毒，由包膜与核心两部分组成，包含三种抗原，即乙肝表面抗原(HBs Ag)、乙肝e抗原(HBe Ag)和乙肝核心抗原(HBc Ag)。
其中，HBs Ag只有抗原性没有传染性，能够提示已有HBV病毒感染情况发生，而HBeAg和HBc Ag的血清学检测则能更好的反应病毒的感染情况。目前临床上通常通过检测乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体和乙肝核心抗体来诊断HBV病毒的感染情况。
单一B细胞通过免疫、融合、筛选、培养等手段可以获得单克隆抗体，其具有高特异性、稳定性等特点，能够进行大批量生产，成为感染性疾病研究，诊断和治疗的有力手段。目前常用的获得单克隆抗体的方法是通过免疫小鼠获得分泌抗体的B细胞，经过筛选、培养等程序获得单克隆抗体。然而，常规的免疫手段虽然可以获得效价高、效果好的单克隆抗体，但耗时过长；并且只能获得针对这一种抗原的单克隆抗体。因此，制备某一株单克隆抗体往往需要花费数月时间，耗时长。为此，建立一种抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、高效的抗乙型肝炎单克隆抗体免疫方法，通过将乙型肝炎表面抗原、核心抗原及e抗原同时偶联到载体蛋白上，形成复合抗原对小鼠进行免疫，得到这三种抗原对应的杂交瘤细胞。本发明不仅缩短了免疫周期，还可同时制备三种抗乙型肝炎单克隆抗体。
本发明提供技术方案如下：
多种乙肝抗原蛋白偶联物，将三种乙型肝炎抗原通过偶联剂与载体蛋白进行偶联，所选抗原分别为乙型肝炎表面抗原、核心抗原及e抗原。
上述偶联剂选取1-乙基-3-碳化二亚胺（EDC）。
上述载体蛋白选取牛血清白蛋白（BSA）。
乙型肝炎表面抗原、核心抗原及e抗原分别按1:1:1的比例与载体蛋白进行偶联，复合抗原与载体蛋白的摩尔比为1:10。
本发明所述的乙肝抗原蛋白偶联物采用Thermo Scientific公司的ImjectTM EDCmcKLH Spin Kit的制备得到。
本发明提供利用上述乙肝抗原蛋白偶联物进行抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法的建立，以下为操作步骤：
S1、制备乙肝抗原蛋白偶联物；
S2、选择6-8周龄的小鼠，进行单独分区饲养；
S3、将乙肝抗原蛋白偶联物与弗氏完全佐剂按1:1的比例充分乳化混匀，每只小鼠皮下多点注射免疫抗原，注射剂量为50ug/每只；
S4、初次免疫2周后，使用乙醚对小鼠进行麻醉；
S5、剪开腹部表皮及腹腔膜，将脾脏后轻轻固定后向其注射50μg抗原偶联物，完成后快速缝合伤口；
S6、二次免疫1周后，处死小鼠，制备脾细胞悬液；
S7、将脾细胞悬液置于含有15%胎牛血清的培养基中，另添加50μg乙肝抗原进行培养；
S8、培养3天后，取培养液上清进行效价检测。
进一步的，根据S1中的操作步骤，将乙型肝炎表面抗原、核心抗原及e抗原分别按1:1:1的比例与载体蛋白进行偶联，复合抗原与载体蛋白的摩尔比为1:10。
进一步的，根据S2中的操作步骤，在对雌性小鼠进行皮下多点注射前4-6天，对小鼠进行分区饲养。
进一步的，根据S3中的操作步骤，将乙肝抗原蛋白偶联物与弗氏完全佐剂按1:1的比例混合均匀，按照50μg/只的剂量进行皮下多点免疫。
进一步的，根据S4中的操作步骤，初次免疫14天后，使用一定剂量的乙醚对小鼠进行麻醉。
进一步的，根据S5中的操作步骤，使用灭菌后的手术器械剪开小鼠腹部表皮及腹腔膜，将脾脏后轻轻固定后，向其脾脏内注入50μg乙肝抗原蛋白偶联物，注射完成后快速缝合伤口。
进一步的，根据S6中的操作步骤，第二次免疫七天后，脱颈法处死小鼠，取其脾脏制备成脾细胞悬液。
进一步的，根据S7中的操作步骤，将脾细胞悬液置于含有15%胎牛血清的培养基中，另添加50μg乙肝抗原蛋白偶联物进行培养。
进一步的，根据S8中的操作步骤，取培养3天后的上清进行效价检测。
有益效果：
（1）本发明中，通过将乙肝三种抗原同时偶联到一个载体蛋白上，形成乙肝抗原蛋白偶联物，通过对小鼠进行免疫及一次细胞融合，可以同时获得针对三种乙型肝炎抗原的单克隆抗体。
（2）本发明中，对小鼠进行脾内免疫，可以让抗原直接刺激脾脏，更有利于B细胞分泌高特异性抗体。
（3）本发明中，免疫时间缩短至14天，抗原使用量仅为50ug就完成免疫过程，降低实验成本，提高了筛选效率。
附图说明
图1为抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法的建立。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行完整清晰的描述。
本发明提供的技术方案参照图1，抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法得建立，包括以下步骤：
步骤一、制备乙肝抗原蛋白偶联物；
步骤二、选择6-8周龄的小鼠，进行单独分区饲养；
步骤三、将乙肝抗原蛋白偶联物与弗氏完全佐剂充分乳化混匀，对小鼠进行免疫；
步骤四、初次免疫2周后，使用乙醚对小鼠进行麻醉；
步骤五、剪开腹部表皮及腹腔膜，将脾脏后轻轻固定后向其注射50μg抗原偶联物，完成后快速缝合伤口；
步骤六、二次免疫1周后，处死小鼠，制备脾细胞悬液；
步骤七、将脾细胞悬液置于培养基中，另添加乙肝抗原蛋白偶联物进行培养；
步骤八、培养3天后，取培养液上清进行效价检测。
具体的，根据步骤一中的操作步骤，将乙型肝炎表面抗原、核心抗原及e抗原与载体蛋白进行偶联；，乙型肝炎表面抗原、核心抗原及e抗原分别按1:1:1的比例与载体蛋白进行偶联，复合抗原与载体蛋白的摩尔比为1:10。
具体的，根据步骤二中的操作步骤，在对雌性小鼠进行皮下多点，注射前4-6天，对小鼠进行分区饲养。
具体的，根据步骤三中的操作步骤，将乙肝抗原蛋白偶联物与弗氏完全佐剂按1:1的比例混合均匀，按照50μg/只的剂量对小鼠进行皮下多点免疫。
具体的，根据步骤四中的操作步骤，初次免疫14天后，使用一定剂量的乙醚对小鼠进行麻醉。
具体的，根据步骤五中的操作步骤，使用灭菌后的手术器械剪开小鼠腹部表皮及腹腔膜，将脾脏后轻轻固定后，向其脾脏内注入50μg乙肝抗原蛋白偶联物，注射完成后快速缝合伤口。
具体的，根据步骤六中的操作步骤，第二次免疫七天后，脱颈法处死小鼠，取其脾脏制备成脾细胞悬液。
具体的，根据步骤七中的操作步骤，将脾细胞悬液置于含有15%胎牛血清的培养基中，另添加50μg乙肝抗原蛋白偶联物进行培养。
具体的，根据步骤八中的操作步骤，取培养3天后的上清进行效价检测。
将传统方法（单独免疫）与本申请方法进行对比，得到数据如表1所示：
表1：
抗原用量 免疫次数 免疫周期 免疫难易情况 特异性抗体产生效果
传统方法 >100ug 3-5次 大于1个月 较难，不易成功 效价为1:10000左右
本实施例 50ug 1次 14天 较易，易成功 效价>1:64000
由上述实验数据可以看出，该抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法的建立，在实施时，具有抗原使用量少、免疫易成功、特异性抗体产生效价高的优点。
抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法的建立，包括以下步骤：
步骤一、使用ImjectTM EDC mcKLH Spin Kit(Thermo Scientific)完成抗原与牛血清白蛋白的偶联，具体操作步骤见试剂盒(Thermo Scientific)附带说明书进行。简而言之，将称取好的牛血清白蛋白倒入200μL的超纯水中，配制成10mg/mL的溶液。乙型肝炎表面抗原、核心抗原及e抗原各2mg溶于450μLEDC偶联缓冲液中，再将抗原溶液与载体蛋白溶液混合，加入到10mgEDC中，通过温和混合溶解，在室温下孵育2小时，通过脱盐柱提纯共轭物，除去未反应的交联剂和叠氮化钠，得到纯化后的乙肝抗原蛋白偶联物。
步骤二、选择6-8周龄的小鼠，进行单独分区饲养，及时添加食水，更换垫料，确保小鼠状态良好。
步骤三、将偶联获得的乙肝抗原蛋白偶联物按1:1的比例与弗氏完全佐剂充分乳化混匀，按50μg/只，采用皮下多点注射的方法注射进小鼠体内，进行初次免疫，不间断观察小鼠状态；
步骤四、初次免疫2周后，进行二次免疫，使用乙醚对小鼠进行麻醉。
步骤五、将麻醉好的小鼠侧躺于超净工作台中，用扎带固定，用镊子夹起腹部皮毛，剪开腹部表皮及腹腔膜，找到脾脏后轻轻固定后向其注射50μg乙肝抗原蛋白偶联物，完成后快速缝合伤口，不间断观察小鼠状态；
步骤六、二次免疫1周后，杀死小鼠，用扎带固定，用镊子夹起腹部皮毛，剪开腹部表皮及腹腔膜，剪除脾脏周围组织，取出脾脏，经过研磨、离心、去除红细胞等步骤，制备脾细胞悬液。
步骤七、将其置于含有15%胎牛血清的培养基中，另添加50μg乙肝抗原蛋白偶联物进行培养；
步骤八、培养3天后，取培养上清进行效价检测，检测值>1:64000。
该免疫方法是通过将不同的抗原偶联到载体蛋白上，对小鼠进行皮下多点免疫、脾内免疫和体外免疫，过程包括免疫、解刨、缝合和采血。可以根据不同的免疫原注射不同的免疫剂量，已达到最佳免疫效果。
为了对本方法进行更好的说明，以CD9、CD37和CD81单克隆抗体制备的免疫过程为例：
1）将CD9、CD37和CD81抗原偶联到载体蛋白BSA上，采用Thermo Scientific公司的ImjectTM EDC mcKLH Spin Kit的制备得到，具体操作步骤见试剂盒(Thermo Scientific)附带说明书进行。
2）准备免疫所需6-8周龄的雌性小鼠。
3）将抗原蛋白偶联物与完全佐剂充分混匀，按50μg/只对小鼠进行皮下多点注射。
4）2周后，使用乙醚麻醉小鼠。
5）将麻醉后的小鼠固定住，用手术器械剪开腹部表皮及腹腔膜，往脾脏内注入50μg乙肝抗原蛋白偶联物后快速缝合伤口。
6）再过1周，脱颈处死小鼠，取脾制备脾细胞悬液。
7）将脾细胞悬液置于含15%胎牛血清的培养基中培养，同时加入50μg抗原蛋白偶联物。
8）3天后，取培养液上清进行效价检测, 检测值>1:64000,显著高于传统方案的1:10000。
尽管已对本实施案例进行了详细的描述，对于本领域的技术而言，可以在不脱离本发明的原理的情况下可以对本实施案例进行适当的修改和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种乙肝抗原蛋白偶联物，其特征在于：将三种乙肝病毒抗原与载体蛋白进行交联获得。
2.根据权利要求1所述的乙肝抗原蛋白偶联物，其特征在于，所述抗原为乙肝表面抗原(HBs Ag)、乙肝e抗原(HBe Ag)和乙肝核心抗原(HBc Ag)。
3.根据权利要求1所述的乙肝抗原蛋白偶联物，其特征在于，所述偶联剂选取1-乙基-3-碳化二亚胺（EDC）。
4.根据权利要求1所述的乙肝抗原蛋白偶联物，其特征在于，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白（BSA）。
5.根据权利要求1所述的乙肝抗原蛋白偶联物，其特征在于，所述乙肝抗原蛋白偶联物采用Thermo Scientific公司的ImjectTM EDC mcKLH Spin Kit的制备得到。
6.根据权利要求1所述的乙肝抗原蛋白偶联物，其特征在于，所述乙肝抗原蛋白偶联物中乙型肝炎表面抗原、核心抗原及e抗原分别按1:1:1的比例与载体蛋白进行偶联。
7.一种抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）使用权利要求1-6中任意一项所述的乙肝抗原蛋白偶联物免疫小鼠；
（2）选择6-8周龄的小鼠，进行单独分区饲养，将乙肝抗原蛋白偶联物与弗氏完全佐剂充分乳化混匀，对小鼠进行皮下多点注射；
（3）初次免疫2周后，使用乙醚对小鼠进行麻醉，剪开腹部表皮及腹腔膜，将脾脏后轻轻固定后向其注射抗原偶联物，完成后快速缝合伤口；
（4）第二次免疫1周后，处死小鼠，制备脾细胞悬液；
（5）将脾细胞悬液置于含有15%胎牛血清的培养基中，另添加50μg乙肝抗原进行培养；
（6）培养3天后，取培养液上清进行效价检测。
8.根据权利要求7所述的一种抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法，其特征在于，所述乙肝抗原蛋白偶联物与弗氏完全佐剂按1:1的比例混合。
9.根据权利要求7所述的一种抗乙型肝炎单克隆抗体快速免疫方法，其特征在于，步骤2）和步骤3）中注射剂量为50μg/只。
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