WO2011058993A1 - 新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2011058993A1
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bone
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    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a screening method for a bone resorption inhibitor having a novel mechanism.
  • Osteoclasts are the only cells in the body that melt and resorb bone, and are responsible for bone metabolism in coordination with osteoblasts that make bone.
  • Osteoclasts are cells derived from hematopoietic monocytes and macrophages. Osteoclast precursor cells settle on the bone surface from the blood, and RANKL (receptor activator of NF kappa B ligand) Is differentiated into mature osteoclasts with osteoclast activity by being stimulated by the differentiation factor, and bone resorption is performed (Nat Rev Genet. 2003 Aug; 4 (8): 638-49. Review).
  • RANK RANKL receptor
  • IL-1 receptor integrin ⁇ v ⁇ 3 and the like.
  • RANK RANKL receptor
  • IL-1 receptor integrin ⁇ v ⁇ 3
  • the activity of this osteoclast is enhanced.
  • vitamin D3, vitamin K2, ipriflavone, etc. are used as drugs that can prevent bone loss, and female hormones are expected to prevent bone loss and increase bone mass.
  • One type of estrogen and drugs that act on estrogen receptors SERM
  • SERM selective estrogen receptor modulator
  • a bisphosphonate preparation that suppresses the function by killing osteoclasts as a drug that is expected to be most effective is widely used as a prophylactic / therapeutic agent for these bone-absorbing diseases.
  • Bisphosphonate preparations are believed to adhere to the bone surface and be induced by osteoclasts to induce apoptosis.
  • a drug containing a compound having a sphingosine skeleton as an active ingredient has been disclosed as a preventive and ameliorating agent for osteoarthritis (Patent Document 1). Further, an osteogenesis promoter containing a compound having a sphingosine skeleton as an active ingredient is also disclosed (Patent Document 2). These documents disclose that a compound having a sphingosine skeleton activates osteoblasts and has a function as an osteogenesis promoter.
  • Sphingosine monophosphate (hereinafter referred to as “S1P”) is a representative product of sphingolipids constituting a biological membrane, and is one type of lipid mediator present in blood. S1P is also a physiologically active substance that causes cell migration and the like by binding to a G protein-coupled receptor expressed on the cell membrane after being released from the membrane by being released from the enzyme.
  • S1P 1 sphingosine 1-phosphate receptor type 1
  • S1P 5 type 5
  • S1P 1 and S1P 3 are said to promote the activity of Rac, a kind of low molecular weight G protein, and induce positive chemotaxis (chemo taxis) to S1P, while S1P 2 suppresses chemotaxis. It is said that.
  • chemotaxis may be referred to as migratory ability.
  • S1P has also been shown to be important for lymphocyte migration in the immune system. For example, when T lymphocytes receive antigen presentation in the lymph nodes and return to the systemic circulation, S1P 1 expression is enhanced, so that the mechanism that can return to the blood is known. (Nat Rev Immunol. 2005 Jul; 5 (7): 560-70. Review).
  • the osteoclast precursors based on the S1P 1 is one of the S1P receptors is found for the first time that it is expressed, the precursor cells by chemotaxis to the S1P 1 blood S1P is into the blood re There is a report suggesting that it can be refluxed (Patent Document 3).
  • S1P stimulates the osteoclast progenitor cell migration ability, and the interaction between S1P 1 and S1P causes the progenitor cell to mature from the bone surface before it matures into an osteoclast. This is due to a mechanism that prevents this.
  • the osteoclast precursor cells conditions including RANKL (RANKL (+)) or without conditions (RANKL (-)) were cultured in, RANKL (-) at the S1P 1 and SlP 2 mRNA is expressed, RANKL (+) have been attenuated in expression of S1P 1 is markedly the expression of SlP 2 that has been confirmed to be enhanced unchanged - mild (Patent Document 3, see FIG. 2A).
  • Patent Document 3 see FIG. 2A
  • it has been confirmed that the cell migration ability is enhanced in the case of RANKL ( ⁇ ) (see Patent Document 3, FIG. 2B).
  • Non-patent Document 1 There is a report that bone mass increased when fingolimod (FTY720) known as an S1P 1 agonist was administered to an osteoporosis model animal. However, in the interaction with S1P, no mention is the action of S1P receptors other than S1P 1.
  • a drug that suppresses the function of osteoclasts such as a conventionally known bisphosphonate preparation, is effective, but has not yet completely suppressed the decrease in bone mass. Development of drugs having a mechanism of action different from existing drugs is desired.
  • An object of the present invention is to provide a screening method based on a novel mechanism for developing a drug having an action mechanism different from that of an existing drug for a bone resorption inhibitor.
  • the present inventors stimulated the osteoclast precursor cell migration ability with chemokines such as S1P, CXCL12 (CXC motif ligand 12), and CX 3 CL1 (C-X3-C motif ligand 1).
  • chemokines such as S1P, CXCL12 (CXC motif ligand 12), and CX 3 CL1 (C-X3-C motif ligand 1).
  • S1P 2 one of the S1P receptors, affects the migration ability of osteoclast precursor cells, and the precursor cells mature into osteoclasts It was found for the first time that the progenitor cells can be detached from the bone surface and matured into osteoclasts, and the bone mass can be changed.
  • a screening method for a novel bone resorption inhibitor comprising detecting a substance capable of inhibiting the interaction between sphingosine monophosphate (S1P) and sphingosine monophosphate receptor type 2 (S1P 2 ).
  • the screening method according to item 1 above which comprises at least the following steps A) and B): Process to see the effect on the interaction of S1P and S1P 2 of A) a candidate agent, selecting a candidate substance capable of inhibiting the interaction of S1P and S1P 2; B) A step of confirming the influence of the candidate substance on the cell migration ability and selecting the substance confirmed to have enhanced migration ability. 3.
  • the screening method including the following steps: 1) A step of adding candidate substances to the test system and confirming the effect on the interaction between S1P and S1P 2 ; 2) A step of selecting a candidate substance that can inhibit the interaction between S1P and S1P 2 based on the result of confirming the influence on the interaction; 3) A step of adding the candidate substance selected in the above step to a cell culture system cultured in a system containing S1P; 4) A step of measuring the cell migration ability after the above step and further selecting a substance confirmed to have enhanced migration ability. 4). 3.
  • the screening method including the following steps: 1) A step of adding a candidate substance to a cell culture system cultured in a system containing S1P; 2) A step of measuring a cell's migration ability after the above step and selecting a candidate substance confirmed to have enhanced migration ability; 3) A step of adding the candidate substance selected in the above step to the test system and confirming the influence on the interaction between S1P and S1P 2 ; 4) A step of further selecting a substance capable of inhibiting the interaction between S1P and S1P 2 based on the result of confirming the influence on the interaction. 5. 5.
  • Cells used in the screening method is a cell expressing at least S1P 1 and SlP 2, the screening method according to any one of the preceding 2-5. 7).
  • 7. The screening method according to any one of items 2 to 6, wherein the cell used in the screening method is an osteoclast precursor cell.
  • a novel bone resorption inhibitor comprising a substance capable of inhibiting the interaction between S1P and S1P 2 as an active ingredient. 9.
  • novel bone resorption inhibitor according to item 8 above wherein the substance capable of inhibiting the interaction between S1P and S1P 2 is a substance capable of enhancing the migration ability of osteoclast precursor cells. 10. 10. The novel bone resorption inhibitor according to 8 or 9 above, wherein the substance capable of inhibiting the interaction between S1P and S1P 2 is an S1P 2 antagonist , an anti-S1P 2 antibody, or an S1P 2 expression inhibitor.
  • screening by a novel mechanism for developing a drug having an action mechanism different from that of an existing bone resorption inhibitor can be performed. Specifically, it is possible to perform screening that can sort a new bone resorption inhibitors based on effects on migration ability of interaction sequence osteoclast precursor cells with S1P and S1P 2.
  • a conventionally known bisphosphonate preparation is based on the action of apoptosis of mature osteoclasts on the bone surface, and is a drug that suppresses the function of mature osteoclasts.
  • the drug selected by the screening method of the present invention is excellent in that it targets migration / positioning of osteoclast precursor cells, which is a pre-stage of mature osteoclasts.
  • osteoporosis model mouse is a diagram showing changes in bone mass.
  • Example 1 It is a photograph figure which shows the dynamic analysis result of the osteoclast progenitor cell using biological multiphoton excitation imaging.
  • Example 2 It is a figure which shows the analysis result of the cell velocity using biological multiphoton excitation imaging.
  • Example 3 Using SlP 2 deficient mice and wild-type mice, it shows the results of investigation of the role on the migration of monocytic cells (osteoclast precursors) and T lymphocytes SlP 2.
  • Example 3 It is a photographic view showing the morphology of bone SlP 2 deficient mice and wild type mice.
  • Example 4 It is a diagram showing the histomorphological analysis of bone SlP 2 deficient mice and wild type mice.
  • Example 4 Three types of S1P 2 gene-deficient mice and wild-type mice were prepared: RANKL administration group to promote bone resorption, RANKL plus JTE013 administration group, and control (PBS) group. It is a figure which shows a static analysis result.
  • Example 4 It is a diagram showing the histomorphological analysis of bone when the osteoporosis model mice were administered SlP 2 antagonist (JTE013). (Example 5)
  • Chemokines such as S1P, CXCL12 (CXC motif ligand 12), CX 3 CL1 (C-X3-C motif ligand 1) stimulate the migration of osteoclast precursor cells, and S1P 1 expressed in the precursor cells and blood S1P Interact with each other, some osteoclast precursor cells recirculate into the blood without maturing into osteoclasts (see FIG. 1).
  • osteoclast precursor cell-derived cells (RAW264.7) and bone marrow-derived osteoclast precursors Cells (BM-MDM: bone marrow-derived M-CSF dependent monocytes) are cultured with or without RANKL (RANKL (+)) or without RANKL (RANKL (-)).
  • RANKL (+) RANKL
  • RANKL (-) bone marrow-derived M-CSF dependent monocytes
  • cell migration ability was examined by the Boyden chamber method. As a result, in RANKL (-), a significant difference was observed in the migration ability depending on the S1P concentration. Although RANKL (+) had a lower migration ability than RANKL (-), a difference was observed in the migration ability depending on the added S1P concentration (see FIG. 3).
  • RAW264.7 cells were cultured under conditions (PTX (+)) or without (PTX (-)) containing pertussis toxin ⁇ ⁇ ⁇ (PTX: ⁇ Perutussistoxin) having inhibitory activity against G protein-coupled receptors, The concentration of S1P was added, and the cell migration ability was examined by the Boyden chamber method. As a result, in PTX (-), a significant difference was observed in the migration ability depending on the S1P concentration. On the other hand, PTX (+) had a lower cell migration ability than PTX (-), and a tendency was found that the cell migration ability was slightly higher when the added S1P concentration was lower (see FIG. 4).
  • S1P is a physiologically active substance that causes cell migration and the like by binding to a G protein-coupled receptor (S1P receptor) expressed on the cell membrane.
  • S1P receptor G protein-coupled receptor
  • the and the S1P 1 and blood S1P expressed in osteoclast precursors were confirmed chemotactic activity of cells by interacting. Further, the Patent Document 3, S1P 1 agonist, based on that it can be further enhanced migratory capacity of the cells was confirmed, the FTY720 is a kind of S1P 1 agonist, was confirmed the effect of actually on bone metabolism. As a result of intraperitoneal administration of FTY720 at 3 mg / kg / day for 4 weeks to osteoporosis model mice prepared by ovariectomy, it was confirmed that bone metabolism was clearly improved compared to the system without FTY720 (Fig. 6). From this, it was suggested that when the migration ability of osteoclast precursor cells is enhanced, bone metabolism is also improved.
  • S1P 1 agonists for example, SEW2871 (5- (4-Phenyl-5-trifluoromethylthiophen-2-yl) -3- (3-trifluoromethylphenyl) -1,2,4-oxadiazole), KRP-203 (2- amino-2- ⁇ 2- [4- (3-benzyloxyphenylthio) -2-chlorophenyl] ethyl ⁇ -1,3-propanediol hydrochloride), FTY720 (2-amino-2- [2- (4-octylphenyl) ethyl] propane -1,3-diol hydrochloride) and derivatives thereof.
  • SEW2871 (4-Phenyl-5-trifluoromethylthiophen-2-yl) -3- (3-trifluoromethylphenyl) -1,2,4-oxadiazole
  • KRP-203 (2- amino-2- ⁇ 2- [4- (3-benzyloxyphenylthio)
  • FTY720 is a compound created by chemical modification using myriocin produced by lasaria sinclairii, a kind of cordyceps as a lead compound. It is characterized by acting directly on T cells that cause cytotoxicity, and is expected to be a therapeutic agent for organ transplant rejection and autoimmune diseases when used in combination with existing drugs or existing immunosuppressants. . Similar to FTY720, KRP-203 has been reported to be usable as an immunosuppressant that suppresses rejection (Shimizu et al., Circulation 2005, Takahashi et al., Transplant Proc 2005).
  • S1P addition concentration has a higher binding ability to S1P than S1P 2, and therefore, in the presence of a low concentration of S1P, only S1P 1 acts to show positive chemotaxis, whereas a high concentration of S1P 1 in the presence, by acting in SlP 2, it believed chemotaxis is inhibited.
  • the present invention is characterized by detecting a substance capable of inhibiting the interaction of S1P and S1P 2, it relates to a method for screening a novel bone resorption inhibitors.
  • the screening method of the present invention it is necessary to confirm the influence on the interaction between S1P and S1P 2 for a candidate substance for a new bone resorption inhibitor.
  • the effect on the interaction of S1P and S1P 2 refers to inhibiting the interaction of S1P and S1P 2.
  • S1P 2 activity or S1P 2 expression In order to confirm such an effect, specifically, it is necessary to confirm S1P 2 activity or S1P 2 expression.
  • substances which can inhibit the interaction of S1P and S1P 2 is, it is also necessary to verify that can enhance the migration ability of osteoclast precursor cells.
  • the screening method of the present invention needs to include at least the following steps A) and B). To see the effect on the interaction of S1P and S1P 2 of A) the candidate substance, the step of selecting a candidate substance capable of inhibiting the interaction of S1P and S1P 2. B) A step of confirming the influence of the candidate substance on the cell migration ability and selecting the substance confirmed to have enhanced migration ability.
  • the order of these two kinds of processes is not particularly limited, and any of them may be first, but it is preferable that the substance selected in the process A) is further selected in the process B). It is. More specifically, the following 1. Or 2. It can screen by the method of.
  • step A) after step B) 1) A step of adding a candidate substance to a cell culture system cultured in a system containing S1P; 2) A step of measuring a cell's migration ability after the above step and selecting a candidate substance confirmed to have enhanced migration ability; 3) A step of adding the candidate substance selected in the above step to the test system and confirming the influence on the interaction between S1P and S1P 2 ; 4) A step of further selecting a substance capable of inhibiting the interaction between S1P and S1P 2 based on the result of confirming the influence on the interaction.
  • A) confirmed the interaction Effects of S1P and S1P 2 for screening candidate substances capable of inhibiting the interaction of S1P and S1P 2 is, S1P 2 activity or S1P 2 expression It can be by test system to confirm the amount.
  • a method for confirming S1P 2 activity a method known per se or a method to be developed in the future can be adopted, and it is not particularly limited.
  • Method and measurement system that observes binding by adding S1P 2 micelles to a substrate where S1P is bound using a protein plasmon resonance (SPR) measurement apparatus using a surface plasmon resonance (SPR) The method by can be applied.
  • SPR protein plasmon resonance
  • SPR surface plasmon resonance
  • S1P 2 micelle and S1P A method of observing whether the binding of is inhibited.
  • a device for measuring protein-protein interaction and lipid-protein interaction utilizing surface plasmon resonance (SPR) a commercially available device known per se, for example, a trade name BIAcore device can be used.
  • the candidate substance is a substance that can inhibit the S1P 2 antigen, for example, an anti-S1P 2 antibody
  • a method of simply confirming the antigen-antibody reaction between S1P 2 and the candidate substance may be used. Specifically, immunochromatography and ELISA can be used.
  • a method for confirming the expression level of S1P 2 can be a method known per se.
  • a method for confirming the expression level of mRNA can be performed by real-time PCR, and a method for confirming the expressed protein can be performed by, for example, a Western blot method or a flow cytometry method.
  • Analysis by the flow cytometry method can be performed by a flow cytometer known per se, for example, a trade name FACSCanto apparatus.
  • Suitable for high-throughput screening include measurement methods using surface plasmon resonance (SPR) and measurement methods by flow cytometry.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the cells can be used in the confirmation process of the effects on the interaction of S1P and S1P 2, forcing at least cells S1P 1 and S1P 2 is expressed, or a S1P 1 ⁇ S1P 2 Expressed cells can be used.
  • a cell is preferably an osteoclast precursor cell, and is preferably a cell lined and available for use in a screening system.
  • RAW264.7 cells, MOCP-5 cells, BM2 cells, HL-60 cells, or the like NIH3T3 and HEK293 cells forced to express SlP 2 and the like, preferably RAW264.7 cells, MOCP-5 cells Most preferred are RAW264.7 cells.
  • B) Confirmation of the influence of the candidate substance on the cell migration ability is performed by culturing cells in a system containing the candidate substance and S1P and confirming the influence of the candidate substance on the cell migration ability.
  • the concentration of S1P to be added in this case can be appropriately determined in relation to the number of cells used in the test system and the candidate substance. Specifically, a concentration of 10 ⁇ 9 M or more is preferable, and preferably 10 ⁇ 8 M or more, particularly preferably 10 ⁇ 7 M or more. Further, the upper limit of the concentration of S1P to be added is not particularly limited, but a concentration that can be dissolved in the culture medium is preferable, and for example, it is preferably 10 ⁇ 6 M or less.
  • the migration ability used in the screening method of the present invention can be measured by a method known per se. Specifically, a well-known Boyden chamber method, Zigmond chamber method, or a modified method thereof can be employed as a cell migration ability measurement technique. Furthermore, a new cell migration ability measuring technique that will be developed in the future can be adopted. Specifically, when cells are added to the upper chamber blocked by a membrane having a large number of pores, a chemotactic factor is added to the lower stage and reacted for a certain period of time, cells that exhibit chemotactic activity against the chemotactic factor are Pass through the membrane holes and fall into the lower chamber or adhere to the back side of the membrane.
  • the migratory ability can be determined by directly measuring the dropped cells or by measuring the cells within a certain area after fixing and staining the cells adhered to the membrane. Many samples can be processed by making a chamber into a multiwell.
  • a chemotaxis chamber manufactured by NeuroNProbe is commercially available and can be used.
  • screening can be performed by the following method.
  • the osteoclast precursor cells described above are cultured in a culture vessel for 2 to 7 days using a medium necessary for cell growth.
  • the obtained cells are isolated from the culture vessel according to a conventional method, suspended in a medium necessary for cell maintenance, and a cell suspension is prepared.
  • the concentration of cells in the cell suspension can be determined as appropriate according to the method for measuring migration ability.
  • a lower part of the chemotaxis chamber is filled with a solution containing a candidate substance of an appropriate concentration, a membrane is set, and the obtained cell suspension is added to the upper part and cultured for an appropriate time.
  • the culture time can be appropriately determined depending on the type of cells, the number of cells, the concentration of candidate substances, and the like.
  • After incubation remove the membrane from the chamber, and then fix and stain the cells attached to the membrane. Thereafter, the cells on the surface in contact with the upper chamber are wiped off and air-dried, and then the absorbance is measured using a microplate reader, whereby the migration ability of the cells by the candidate substance can be measured and evaluated.
  • cells that can be used in the step of confirming the effect on the migration ability can be used when culturing cells in a system containing the candidate substance and S1P and confirming the influence of the candidate substance on the cell migration ability is required to be a cell in which at least cells S1P 1 and SlP 2 is expressed, or a S1P 1 and SlP 2 is forcibly expressed. This is because it necessary by interaction with S1P 1 and S1P expressing confirm migration capacity of cells.
  • a cell is preferably an osteoclast precursor cell, and is preferably a cell lined and available for use in a screening system.
  • RAW264.7 cells preferably RAW264.7 cells, MOCP-5 cells, BM2 cells, HL-60 cells, or the like NIH3T3 and HEK293 cells forced to express SlP 2 and the like, preferably RAW264.7 cells, MOCP-5 cells Most preferred are RAW264.7 cells.
  • the functional effect of the candidate substance selected by the screening method of the present invention is that S1P 1 expressing cells, preferably cells expressing S1P 1 and S1P 2 are added to the candidate substance and S1P and cultured, It can be confirmed by measuring the migration ability against S1P. Furthermore, S1P 1 expressing cells, preferably cells expressing S1P 1 and S1P 2 , are added with a candidate substance and S1P and cultured to activate Rac, a kind of low molecular weight G protein in the cells. It can also be confirmed by measuring.
  • Rac is activated by stimulation of the S1P 1, cells to S1P This action is because showing the chemotactic activity. Cells that can be used for screening can be used as the cells for confirming the effect.
  • the present invention as an active ingredient a substance capable of inhibiting the interaction of S1P and S1P 2, extends to new bone resorption inhibitors.
  • substances capable of inhibiting the interaction of S1P and S1P 2 is a substance capable of enhancing the migration ability of osteoclast precursor cells.
  • Such substances include S1P 2 antagonists , anti-S1P 2 antibodies, or S1P 2 expression inhibitors.
  • a compound known as an S1P 2 antagonist is JTE013, but it may be a novel S1P 2 antagonist selected by the screening method of the present invention.
  • anti-SlP 2 antibodies are prepared by methods known per se, may be a monoclonal antibody to produce e.g. monoclonal antibodies from hybridomas, or by genetic recombination.
  • the S1P 2 expression inhibitor may be a novel S1P 2 expression inhibitor selected by a screening method, or may be an siRNA or an antisense oligonucleotide.
  • RANKL is contained using RAW264.7 cells or BM-MDM cells with ⁇ MEM (Minimal Essential Medium) added to 10% heat-inactivated fetal calf serum (hereinafter “FCS”) and penicillin / streptomycin.
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 3 days in a non-system (RANKL ( ⁇ )) and a system (RANKL (+)) to which RANKL having a final concentration of 50 ng / ml was added.
  • the cells were isolated and collected using a cell scraper, RNA was extracted from the cells by phenol / chloroform extraction, and cDNA was prepared by reverse transcriptase based on the RNA.
  • PCR reaction was performed using primers specific to various genes (S1P 1 to S1P 5 , integrin ⁇ v , GAPDH).
  • the primers used for PCR and the PCR conditions were as described in Patent Document 3.
  • the obtained PCR product is mixed with a loading buffer for electrophoresis (10 ⁇ loading buffer (Takara Bio)) and electrophoresed on a 2% agarose gel at 100V for 20 minutes to confirm the expression of the target gene. did.
  • RT means reverse transcription reaction
  • RT (+) means that reverse transcription reaction was performed
  • RT (-) means that reverse transcription reaction was not performed.
  • RT (-) is a negative control for confirming that genomic DNA is not contaminated when mRNA is extracted.
  • RAW264.7 cultured at 37 ° C for 3 days under the conditions of RANKL (-) was used as the final concentration of S1P.
  • the RAW264.7 cells were isolated using a cell scraper, and the cells were precipitated by centrifugation. Precipitated cells are resuspended in protein extraction buffer (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM Hepes-NaOH (pH 7.4), 1 mM PMSF, protease inhibitor cocktail) and sonicated.
  • a sample for measuring Rac activity was prepared by removing the insolubles by high-speed microcentrifugation.
  • Sample 1 and sample 2 were subjected to SDS-PAGE on a 15% acrylamide gel. After completion of electrophoresis, the cells were transferred to a PVDF membrane, followed by Western blotting using an anti-Rac antibody (Upstate Biotechnology) to identify the Rac protein on the membrane. By this method, each of the total Rac amount (Rac (1/100)) and the active type (GTP-binding type) Rac amount (GTP-Rac) in osteoclast precursor cells was examined.
  • FTY720-administered group 3 mg / kg of FTY720 was administered intraperitoneally once daily for 4 weeks from the day after ovariectomy or the day after sham surgery. Five mice were used for each group. After 4 weeks, the animals were sacrificed and the cross section of the femur was observed.
  • Example 1 Effect on bone metabolism when JTE013 (S1P 2 antagonist) is administered to an osteoporosis model mouse 1) Experimental method An osteoporosis model mouse prepared by the same method as in Reference Example 2 is an S1P 2 antagonist. The effect on the bone metabolism when JTE013 was administered was confirmed. JTE013 was dissolved in vehicle (5% DMSO-containing, 3% BSA-containing PBS not containing fatty acid). In the experiment, a healthy mouse (sham-operated) group and an osteoporosis model mouse group were prepared, and each mouse group was classified into a JTE013 administration group and a control group (vehicle) administered with vehicle.
  • vehicle 5% DMSO-containing, 3% BSA-containing PBS not containing fatty acid
  • JTE013 administration group 1 mg / kg of JTE013 was administered intraperitoneally once daily for 4 weeks from the day after ovariectomy or the day after sham surgery. Five mice were used for each group. After 4 weeks, the animals were sacrificed, the cross-section of the femur was observed, and the bone weight was measured.
  • JTE013 is dissolved in vehicle, and the control group is indicated as “vehicle” unless otherwise specified.
  • Example 2 Dynamic analysis of osteoclast progenitor cells using biological multiphoton excitation imaging and investigation of pharmacological effects of S1P 2 antagonists Intramedullary monocytic cells containing osteoclast progenitor cells become green fluorescent (GFP) Of the osteoclast progenitor cells when the S1P 2 antagonist JTE013 was administered into the living bone marrow of a labeled mouse (CX3CR1-EGFP knock-in mouse). The reperfusion effect to the inside was confirmed.
  • GFP green fluorescent
  • Example 3 Elucidation of role of S1P 2 in osteoclast precursor cell migration control and evaluation of pharmacological effect of S1P 2 antagonist S1P 2 gene-deficient mice (S1P2 -/- ) and wild type mice (WT) were used. Thus, the role of S1P 2 on the migration of monocyte cells (osteoclast precursor cells) and T lymphocytes was examined. S1P 2 gene-deficient mice (S1P2 ⁇ / ⁇ ) were distributed by the National Institutes of Health.
  • Peripheral blood was collected from S1P 2 gene-deficient mice (S1P2 -/- ) and wild-type mice (WT), and the number of each fraction of monocyte cells (Mo, CD11b +) and T lymphocytes (T, CD3 +) was measured.
  • JTE013 which is an S1P 2 antagonist
  • J and C administered with JTE013 were collected before collecting peripheral blood, and cells were collected from each group.
  • the cells are stained with anti-CD11b antibody (FITC label) and anti-CD3 antibody (PE label), and the number of cells is determined by flow cytometry (BD FACS Canto TM II (BD Biosciences, etc.)). Calculated.
  • T lymphocytes (T) that do not express S1P 2 , there is no change in the number of cells between WT, S1P2 ⁇ / ⁇ , C, and J (FIG. 10, left side), whereas CD11b positive monocyte lineage
  • cells (Mo) were significantly increased in S1P2 ⁇ / ⁇ (FIG. 10, right side). This from monocyte lineage cells to reperfusion from the bone marrow by S1P 1 action in peripheral blood has been inhibited SlP 2, outflow of the deficiency of SlP 2 S1P 1 action enhances blood is increased It represents that.
  • JTE013 administration also increased the number of CD11b positive cells in the blood, but this effect is not seen with S1P2 ⁇ / ⁇ .
  • JTE013 inhibits S1P 2 monocyte efflux to peripheral blood is thought to increase, but this effect is not seen in S1P 2 gene-deficient mice, so the effect of JTE013 is certainly mediated by S1P 2 It is shown that. These were confirmed in three or more independent experiments.
  • Example 4 In order to analyze the function for bone metabolic regulation of analysis SlP 2 bone tissue in SlP 2 deficient mice, SlP 2 gene-deficient mice used in Example 3 (S1P2 - / -) and wild-type mice ( For WT), bone histomorphological analysis was performed (3 mice each). As a result, it was confirmed that the bone mass was significantly increased in S1P2 ⁇ / ⁇ compared to WT (FIGS. 11 and 12).
  • FIG. 11 shows a CT image (upper row) and a microscopic tissue image (lower row) of each bone tissue.
  • FIG. 12 shows a numerical parameter measured based on the image data acquired in FIG. Each parameter shows the following.
  • Bone density BV / TV (Bone Volume Fraction) (%) Trabecular width: Tb.Th (Trabecular Thickness) (mm) Trabecular number: Tb.N (Trabecular Number) (1 / mm), Osteoblast adhesion cell surface: ObS / BS (%) (osteoblast surface / bone surface), Bone resorption surface%: (ES / BS) eroded surface / bone surface ( ⁇ osteoclast cell adhesion surface)
  • Example 5 Analysis of bone tissue when an S1P 2 antagonist was administered to an osteoporosis model mouse Effect on bone tissue when JTE013 was administered as an S1P 2 antagonist using an osteoporosis model mouse prepared by the same method as in Reference Example 2 The effect was confirmed.
  • a healthy mouse (sham-operated, Sham) group and an osteoporosis model mouse group (OVX) were prepared, and each mouse group was classified into a JTE013 administration group (JTE) and a control (vehicle).
  • JTE013 administration group 3 mg / kg of JTE013 was administered intraperitoneally once daily for 4 weeks from the day following ovariectomy or the day after sham surgery. Five mice were used for each group. After 4 weeks, the animals were sacrificed, the cross section of the femur was observed, and the bone density was measured. Each parameter is the same as in the fourth embodiment.
  • the screening method of the present invention allows screening by a mechanism different from that of existing bone resorption inhibitors. Specifically, it is possible to perform screening that can sort a new bone resorption inhibitors based on S1P interact with S1P 2, effects on migration ability of sequence osteoclast precursors.
  • the bone resorption inhibitor selected by the screening method of the present invention is different from the mechanism of action of existing bone resorption inhibitors, and targets the migration / positioning of osteoclast precursor cells, which is the previous stage of mature osteoclasts It is excellent in that it is.
  • the drug selected by the method of the present invention controls the balance of inflow and outflow of osteoclast precursor cells into bone cells. Therefore, it can be said that the drug is safer.
  • Bone resorption inhibitors with different mechanisms of action can also be used in combination with conventional drugs. By using in combination, the amount of conventional drugs used can be reduced and a synergistic effect can be expected. Furthermore, since it has the effect

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Abstract

　本発明は、骨吸収抑制剤について、現存の薬剤とは異なる作用機序を有する薬剤を開発するための、新規メカニズムによるスクリーニング方法を提供する。スフィンゴシン１リン酸（S1P）とスフィンゴシン１リン酸受容体２型（S1P2）との相互作用を阻害しうる物質を検出することを特徴とする、新規骨吸収抑制物質のスクリーニング方法による。具体的には、少なくともＡ）候補物質のS1PとS1P2 との相互作用に及ぼす影響を確認し、S1PとS1P2 との相互作用を阻害しうる候補物質を選別する工程、及びＢ）候補物質による細胞の遊走能に及ぼす影響を確認し、遊走能の増強が確認された物質を選別する工程を含むスクリーニング方法による。

Description

新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法
　本発明は、新規メカニズムを有する骨吸収抑制剤のスクリーニング方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２００９－２６０６５５号優先権を請求する。
　破骨細胞は骨を融解・吸収する生体内での唯一の細胞であり、骨を作る骨芽細胞と協調して骨の新陳代謝を担っている。
　骨組織は「骨芽細胞による骨新生」と「破骨細胞による骨吸収」のバランスによって恒常性が維持されている。破骨細胞の膜表面には分化や機能調節をつかさどる膜表面分子が存在している。破骨細胞は、血球系の単球・マクロファージ由来の細胞であり、破骨細胞前駆細胞が血中から骨表面に定着し、その場所で骨芽細胞からRANKL（receptor activator of NF kappa B ligand）という分化因子による刺激を受けることにより破骨能を持った成熟破骨細胞に分化し、骨吸収が行われる（Nat Rev Genet. 2003 Aug;4(8):638-49. Review）。正の制御に関与するものとして、RANK（RANKLレセプター）とIL-1レセプター、及びインテグリンαｖβ３などが挙げられる。関節リウマチや閉経後骨粗鬆症などの骨吸収性疾患では、この破骨細胞の活性が増強している。
　骨粗鬆症の治療薬としては、骨量の減少を防止しうる薬剤として、ビタミンD3、ビタミンK2、イプリフラボンなどが使用されており、骨減少を防止し、骨量増加が期待される薬剤として、女性ホルモンの１種であるエストロゲンやエストロゲン受容体に作用する薬剤（選択的エストロゲン受容体モデュレーター、通称SERM）などが使用されている。また、近年、最も効果が期待されている薬剤として破骨細胞を細胞死させて機能を抑えるビスホスホネート製剤が、これらの骨吸収性疾患の予防・治療薬として汎用されている。ビスホスホネート製剤は骨表面に接着し、これを破骨細胞が取り込むことによりアポトーシスが誘導されると考えられている。
　骨関節疾患の予防及び改善薬として、スフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする薬剤が開示されている（特許文献１）。また、スフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする骨形成促進剤についても開示されている（特許文献２）。これらの文献では、スフィンゴシン骨格を有する化合物が骨芽細胞を活性化し、骨形成促進剤としての機能を有することが開示されている。
　スフィンゴシン１リン酸（以下、「S1P」という。）は、生体膜を構成するスフィンゴ脂質の代表産物であり、血中に存在する脂質メディエーターの１種である。S1Pは、酵素などにより膜から切り出されて遊離した後に、細胞膜に発現しているＧタンパク質共役受容体に結合することによって、細胞遊走などを引き起こす生理活性物質でもある。S1Pの受容体としてスフィンゴシン１リン酸受容体１型（S1P1）～５型（S1P5）の５種類のＧタンパク質共役受容体が知られている。特にS1P1とS1P3は低分子量Ｇタンパク質の一種であるRacの活性を促進化し、S1Pに対する正の走化性（chemo taxis）を誘導するといわれており、一方、S1P2は走化性を抑制するといわれている。以降、走化性を遊走能という場合もある。
　またS1Pは、免疫システムでのリンパ球などの移動に重要であることも示されている。例えば、Ｔリンパ球がリンパ節内で抗原提示を受けて全身循環に戻っていくときに、S1P1の発現が増強されることで、血中に戻っていくことができるようになる機構が知られている（Nat Rev Immunol. 2005 Jul;5(7):560-70. Review）。
　破骨細胞前駆細胞に、S1P受容体のひとつであるS1P1が発現していることを初めて見出したことに基づき、S1P1の血中S1Pへの走化性により当該前駆細胞が血中へ再還流しうることを示唆する報告がある（特許文献３）。S1Pが破骨細胞前駆細胞の遊走能を刺激し、S1P1とS1Pとの相互作用により当該前駆細胞が破骨細胞に成熟する前に骨表面から当該前駆細胞を引き離して破骨細胞に成熟するのを阻止するというメカニズムによる。
　具体的には、破骨細胞前駆細胞に、RANKLを含む条件(RANKL(+))又は含まない条件(RANKL(-))で培養したところ、RANKL(-)でS1P1及びS1P2のmRNAが発現し、RANKL(+)ではS1P1の発現が著明に減弱しており、S1P2の発現が不変～軽度亢進していることが確認されている（特許文献３、図２Ａ参照）。また、細胞の遊走能は、RANKL(-)の場合に増強することが確認されている（特許文献３、図２Ｂ参照）。さらに、S1P1アゴニストであるSEW2871を加えて細胞の遊走能を調べたところ、SEW2871の添加により遊走能が増強することが確認されている（特許文献３、図３参照）。しかしながら、SEW2871による骨代謝に及ぼす影響までは確認していない。つまり、S1P1を発現した破骨細胞前駆細胞が、血中S1Pへの走化性により血中へ再還流しうるというメカニズムについては示唆はあるものの、それにより、骨量に対して実際に影響を及ぼすことについては確認されていない。
　S1P1アゴニストとして公知のフィンゴリモド（Fingolimod：FTY720）を骨粗鬆症モデル動物に投与すると、骨量が増加したことについて報告がある（非特許文献１）。しかしながら、S1Pとの相互作用において、S1P1以外のS1P受容体の作用についてはなんら言及されていない。
　従来公知のビスホスホネート製剤など破骨細胞の機能を抑制する薬剤は、有効ではあるが、骨量の減少を完全に抑制するには至ってはいない。現存の薬剤とは異なる作用機序を有する薬剤の開発が望まれている。
特開2001-158736号公開公報 特開2004-231616号公開公報 特開2007-267665号公開公報
Nature, Vol.458, 26 March 2009, 524-528
　本発明は、骨吸収抑制剤について、現存の薬剤とは異なる作用機序を有する薬剤を開発するための、新規メカニズムによるスクリーニング方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために、S1PやCXCL12 (C-X-C motif ligand 12)、CX3CL1 (C-X3-C motif ligand 1)等のケモカインが破骨細胞前駆細胞の遊走能を刺激することに着目し、鋭意検討を重ねた結果、S1P受容体のひとつであるS1P2を調節することで、破骨細胞前駆細胞の遊走能に影響を及ぼし、当該前駆細胞が破骨細胞に成熟する前に骨表面から当該前駆細胞を引き離して破骨細胞に成熟するのを阻止し、骨量を変化させうることを初めて見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下よりなる。
１．スフィンゴシン１リン酸（S1P）とスフィンゴシン１リン酸受容体２型（S1P2）との相互作用を阻害しうる物質を検出することを特徴とする、新規骨吸収抑制物質のスクリーニング方法。
２．少なくとも以下のＡ）及びＢ）の工程を含むことを特徴とする前項１に記載のスクリーニング方法：
Ａ）候補物質のS1PとS1P2 との相互作用に及ぼす影響を確認し、S1PとS1P2 との相互作用を阻害しうる候補物質を選別する工程；
Ｂ）候補物質による細胞の遊走能に及ぼす影響を確認し、遊走能の増強が確認された物質を選別する工程。
３．以下の工程を含む前項１又は２に記載のスクリーニング方法：
１）試験系に候補物質を添加し、S1PとS1P2との相互作用に及ぼす影響を確認する工程；
２）前記相互作用に及ぼす影響を確認した結果に基づき、S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる候補物質を選別する工程；
３）前記工程により選別された候補物質を、S1Pを含む系で培養した細胞培養系に添加する工程；
４）前記工程の後、細胞の遊走能を測定し、遊走能の増強が確認された物質をさらに選別する工程。
４．以下の工程を含む前項１又は２に記載のスクリーニング方法：
１）候補物質をS1Pを含む系で培養した細胞培養系に添加する工程；
２）前記工程の後、細胞の遊走能を測定し、遊走能の増強が確認された候補物質を選別する工程；
３）試験系に前記工程により選別された候補物質を添加し、S1PとS1P2との相互作用に及ぼす影響を確認する工程；
４）前記相互作用に及ぼす影響を確認した結果に基づき、S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質をさらに選別する工程。
５．S1PとS1P2との相互作用に及ぼす影響を確認する工程が、S1P2活性又はS1P2発現量を確認する工程による、前項２～４のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
６．スクリーニング方法に用いる細胞が、少なくともS1P1及びS1P2を発現している細胞である、前項２～５のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
７．スクリーニング方法に用いる細胞が、破骨細胞前駆細胞である、前項２～６のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
８．S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質を有効成分とする、新規骨吸収抑制剤。
９．S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質が、破骨細胞前駆細胞の遊走能を増強しうる物質である、前項８に記載の新規骨吸収抑制剤。
１０．S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質が、S1P2アンタゴニスト、抗S1P2抗体又はS1P2発現抑制剤である、前項８又は９に記載の新規骨吸収抑制剤。
　本発明のスクリーニング方法により、現存の骨吸収抑制剤とは異なる作用機序を有する薬剤を開発するための、新規メカニズムによるスクリーニングを行うことができる。具体的には、S1PとS1P2との相互作用並び破骨細胞前駆細胞の遊走能に及ぼす効果に基づく新規骨吸収抑制物質を選別しうるスクリーニングを行うことができる。従来公知のビスホスホネート製剤は骨表面で成熟破骨細胞をアポトーシスさせる作用によるものであり、成熟破骨細胞の機能を抑制する薬剤である。一方、本発明のスクリーニング方法により選別される薬剤は、成熟した破骨細胞の前段階である破骨細胞前駆細胞の遊走・位置決めを標的としている点において、極めて優れている。
破骨細胞による骨吸収メカニズム及び破骨細胞前駆細胞の血中への再還流メカニズムを示す図である。 破骨細胞前駆細胞の培養系にRANKLを含む条件(RANKL(+))又は含まない条件(RANKL(-))で、各濃度のS1Pを加えて培養したときの、各種S1P受容体の発現を確認した写真図である。（参考例１） 破骨細胞前駆細胞の培養系にRANKL(+)又はRANKL(-)で、各濃度のS1Pを加えて培養したときの、S1Pに対する細胞の遊走能を示す図である。（参考例１） RAW264.7細胞の培養系に、RANKL(-)で、百日咳毒素 (PTX: Pertussis toxin)を含む条件(PTX(+))又は含まない条件(PTX(-))で各濃度のS1Pを加えて培養したときの、S1Pに対する破骨細胞前駆細胞の遊走能を示す図である。（参考例１） 破骨細胞前駆細胞内でのRacの活性化について確認した写真図である。（参考例１） 骨粗鬆症モデルマウスにS1P1アゴニスト(FTY720)を作用させたときの、骨量の変化を示す写真図である。（参考例２） 骨粗鬆症モデルマウスにS1P2アンタゴニスト(JTE013)を作用させたときの、骨量の変化を示す図である。（実施例１） 生体多光子励起イメージングを用いた破骨細胞前駆細胞の動態解析結果を示す写真図である。（実施例２） 生体多光子励起イメージングを用いた細胞速度の解析結果を示す図である。（実施例２） S1P2遺伝子欠損マウス及び野生型マウスを用いて、S1P2の単球系細胞（破骨細胞前駆細胞）及びTリンパ球の遊走に及ぼす役割について検討した結果を示す図である。（実施例３） S1P2遺伝子欠損マウス及び野生型マウスの骨の組織形態を示す写真図である。（実施例４） S1P2遺伝子欠損マウス及び野生型マウスの骨の組織形態学的解析結果を示す図である。（実施例４） S1P2遺伝子欠損マウス及び野生型マウスについて、骨吸収を促進させるためのRANKL投与群、RANKLに加えJTE013を投与した群及び対照(PBS)群の３種類を作製し、それぞれの骨の組織形態学的解析結果を示す図である。（実施例４） 骨粗鬆症モデルマウスにS1P2アンタゴニスト(JTE013)を投与した場合の骨の組織形態学的解析結果を示す図である。（実施例５）
　本発明を説明するにあたり、本発明を完成するに至った経緯をまず詳述する。
　S1PやCXCL12 (C-X-C motif ligand 12)、CX3CL1(C-X3-C motif ligand 1)等のケモカインは破骨細胞前駆細胞の遊走を刺激し、当該前駆細胞に発現したS1P1と血中S1Pとが相互作用することにより、破骨細胞前駆細胞の一部は破骨細胞へ成熟することなく血中へ再還流される（図１参照）。
　破骨細胞前駆細胞に発現したS1P1と血中S1Pとが相互作用することによる細胞の遊走能を確認するために、破骨細胞前駆細胞由来細胞(RAW264.7)及び骨髄由来破骨細胞前駆細胞（BM-MDM :bone marrow-derived M-CSF dependent monocytes）細胞をRANKLを含む条件(RANKL(+))又は含まない条件(RANKL(-))で培養し、各培養系に各濃度のS1Pを加えて、ボイデンチェンバー法により細胞の遊走能を調べた。その結果、RANKL(-)ではS1P濃度により遊走能に顕著な違いが認められた。また、RANKL(+)ではRANKL(-)に比べて遊走能は低いものの、添加したS1P濃度により遊走能に違いが認められた（図３参照）。
　さらに、RAW264.7細胞をＧタンパク質共役受容体に対して阻害活性を有する百日咳毒素 (PTX: Perutussistoxin)を含む条件(PTX(+))又は含まない条件(PTX(-))で培養し、各濃度のS1Pを加えて、ボイデンチェンバー法により細胞の遊走能を調べた。その結果、PTX(-)ではS1P濃度により遊走能に顕著な違いが認められた。一方、PTX(+)ではPTX(-)に比べて細胞の遊走能は低く、添加したS1P濃度が低い方がやや細胞の遊走能が高い傾向が認められた（図４参照）。背景技術の欄でも説明したように、S1Pは細胞膜に発現しているＧタンパク質共役受容体（S1P受容体）に結合することによって、細胞遊走などを引き起こす生理活性物質でもある。Ｇタンパク質共役受容体に対して阻害活性を有するPTXを添加した場合、S1Pを加えた系でも遊走能が抑制されていることから、破骨細胞前駆細胞はS1PとＧタンパク質共役受容体との相互作用において、遊走能を有することが確認された。
　上記により、破骨細胞前駆細胞に発現したS1P1と血中S1Pとが相互作用することによる細胞の遊走能が確認された。また、特許文献３により、S1P1アゴニストが細胞の遊走能をさらに増強させうることが確認されたことに基づき、S1P1アゴニストの一種であるFTY720について、実際に骨代謝に及ぼす影響を確認した。卵巣摘出により作製した骨粗鬆症モデルマウスに、FTY720を3mg/kg/dayで4週間腹腔内投与を行なった結果、FTY720を投与しない系に比べて明らかに骨代謝が改善することが確認された（図６参照）。このことより、破骨細胞前駆細胞の遊走能が増強されると、骨代謝も改善されることが示唆された。
　ここで、S1P1アゴニストとして、例えばSEW2871（5-(4-Phenyl-5-trifluoromethylthiophen-2-yl)-3-(3-trifluoromethylphenyl)-1,2,4-oxadiazole）、KRP-203（2-amino-2-{2-[4-(3-benzyloxyphenylthio)-2-chlorophenyl]ethyl}-1,3-propanediol hydrochloride）、FTY720（2-amino-2-[2-(4-octylphenyl)ethyl]propane-1,3-diol hydrochloride）及びこれらの誘導体等が例示される。FTY720は、冬虫夏草の一種であるlasaria sinclairii菌が産生するミリオシン（myriocin）をリード化合物として、化学修飾により創製された化合物である。細胞傷害を引き起こすＴ細胞に直接作用することが特徴で、既存の薬剤もしくは既存の免疫抑制剤と併用することで、臓器移植の拒絶反応抑制や自己免疫疾患などの治療薬になると期待されている。KRP-203は、FTY720と同様に、拒絶反応を抑える免疫抑制剤として使用可能であることが報告されている（Shimizu et al., Circulation 2005、Takahashi et al., Transplant Proc 2005）。
　ここで、上述の細胞培養系に各濃度のS1Pを添加した場合における、S1P添加濃度と細胞の遊走能との関係をさらに検討した。図３の結果より、S1P添加濃度が高い場合に、却って遊走能が低下している傾向が認められた。また、S1P1はS1P2に比べて、S1Pに対する結合能が高く、このため低濃度のS1P存在下では、S1P1のみが作用して正の走化性を示すのに対し、高濃度のS1P存在下では、S1P2にも作用することにより、走化性が阻害されると考えられる。
　そこで、本発明において、破骨細胞前駆細胞のモデル細胞であるRAW264.7にS1P1 siRNA又はS1P2 siRNAを作用させた場合の細胞の遊走能に及ぼす影響について初めて確認した。その結果、S1P2 siRNAを作用させた場合は、S1P1 siRNAを作用させた場合に比べて遊走能が増強していることが観察された。このことより、S1P2を抑制することで、細胞の遊走能を増強しうることが示唆された。
　上記の知見に基づき、本発明の新規骨吸収抑制物質のスクリーニング方法を完成した。以下、本発明の内容を詳細に説明する。
　本発明は、S1PとS1P2 との相互作用を阻害しうる物質を検出することを特徴とする、新規骨吸収抑制物質のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法では、新規骨吸収抑制物質の候補物質について、S1PとS1P2 との相互作用に及ぼす影響を確認することを要する。ここで、S1PとS1P2 との相互作用に及ぼす影響とは、S1PとS1P2 との相互作用を阻害することをいう。このような影響を確認するために、具体的にはS1P2活性又はS1P2発現を確認することが必要である。さらに、S1PとS1P2 との相互作用を阻害しうる物質が、破骨細胞前駆細胞の遊走能を増強しうることを確認することも必要である。
　従って、本発明のスクリーニング方法では、少なくとも以下のＡ）及びＢ）の工程を含むことが必要である。
Ａ）候補物質のS1PとS1P2 との相互作用に及ぼす影響を確認し、S1PとS1P2 との相互作用を阻害しうる候補物質を選別する工程。
Ｂ）候補物質による細胞の遊走能に及ぼす影響を確認し、遊走能の増強が確認された物質を選別する工程。
　上記において、これら２種の工程の順序は特に限定されず、いずれが先であっても良いが、好ましくはＡ）の工程で選別された物質について、さらにＢ）の工程で選別するのが好適である。より具体的には、以下の１．又は２．の方法により、スクリーニングすることができる。
１．Ａ）の工程の後、Ｂ）の工程を行なうスクリーニング方法：
１）試験系に候補物質を添加し、S1PとS1P2との相互作用に及ぼす影響を確認する工程；
２）前記相互作用に及ぼす影響を確認した結果に基づき、S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる候補物質を選別する工程；
３）前記工程により選別された候補物質を、S1Pを含む系で培養した細胞培養系に添加する工程；
４）前記工程の後、細胞の遊走能を測定し、遊走能の増強が確認された物質をさらに選別する工程。
２．Ｂ）の工程の後、Ａ）の工程を行なうスクリーニング方法：
１）候補物質をS1Pを含む系で培養した細胞培養系に添加する工程；
２）前記工程の後、細胞の遊走能を測定し、遊走能の増強が確認された候補物質を選別する工程；
３）試験系に前記工程により選別された候補物質を添加し、S1PとS1P2との相互作用に及ぼす影響を確認する工程；
４）前記相互作用に及ぼす影響を確認した結果に基づき、S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質をさらに選別する工程。
　本発明のスクリーニング方法において、Ａ）S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる候補物質を選別するためのS1PとS1P2との相互作用に及ぼす影響の確認は、S1P2活性又はS1P2発現量を確認する試験系によることができる。
　本発明のスクリーニング方法において、S1P2活性を確認する方法としては、自体公知の方法又は今後開発される方法を採用することができ、特に限定されない。例えばS1P2（受容体＝膜タンパク質）を組み込んだ担体と標識されたS1Pとの結合を測定する試験系において、候補物質を添加して、S1P2担体と標識化S1Pの結合の阻害を観察する方法や、表面プラズモン共鳴（SPR）を利用した、タンパク質間相互作用、脂質－タンパク質間相互作用測定装置を用いてS1Pを結合させた基盤に対し、S1P2ミセルを添加して結合を見る測定系による方法などを適用することができる。具体的には、S1P2を組み込んだ擬似的な脂質ミセルを作製し、これに32P（ラジオアイソトープ）で標識したS1Pとの結合能を測定する系において、S1P2ミセルとS1P(32P)の結合が阻害されるかを観察する方法が挙げられる。また、表面プラズモン共鳴（SPR）を利用したタンパク質間相互作用、脂質－タンパク質間相互作用測定装置を用いる方法では、市販されている自体公知の装置、例えば商品名BIAcore装置を用いることができる。また候補物質が、S1P2抗原を阻害しうる物質、例えば抗S1P2抗体の場合には、単にS1P2と候補物質の抗原抗体反応を確認する方法であっても良い。具体的には、免疫クロマトグラフィー、ELISA法によることができる。
　本発明のスクリーニング方法において、S1P2発現量を確認する方法としては自体公知の方法によることができる。例えば、mRNAの発現量を確認する方法としては、リアルタイムPCRによることができ、発現したタンパク質を確認する方法としては、例えばウェスタンブロット(Western blot)法やフローサイトメトリー法によることができる。フローサイトメトリー法による解析は、自体公知のフローサイトメーター、例えば商品名FACSCanto装置により解析することができる。ハイスループットスクリーニングとして適しているのは、表面プラズモン共鳴（SPR）を利用した測定方法や、フローサイトメトリー法による測定方法が挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法のうち、S1PとS1P2との相互作用に及ぼす影響の確認工程で使用可能な細胞は、少なくともS1P1とS1P2が発現している細胞、又はS1P1・S1P2を強制発現させた細胞を使用することができる。このような細胞としては、好ましくは破骨細胞前駆細胞であり、スクリーニング系に使用するために株化され、入手可能な細胞であることが好ましい。具体的にはRAW264.7細胞、MOCP-5細胞、BM2細胞、HL-60細胞、又はS1P2を強制発現させたNIH3T3やHEK293細胞などが挙げられ、好ましくはRAW264.7細胞、MOCP-5細胞であり、最も好ましくはRAW264.7細胞である。
　本発明のスクリーニング方法において、Ｂ）候補物質による細胞の遊走能に及ぼす影響の確認は、候補物質とS1Pを含む系で細胞を培養し、候補物質による細胞の遊走能に及ぼす影響を確認することにより達成することができる。この場合に添加するS1P濃度は、試験系において使用する細胞数及び候補物質との関係で適宜決定することができるが、具体的には10-9 M以上の濃度が好ましく、好適には10-8 M以上、特に好ましくは10-7 M以上である。また、添加するS1P濃度の上限は特に限定されないが、培養液に溶解しうる濃度が好ましく、例えば10-6 M以下であることが好ましい。
　本発明のスクリーニング方法で使用する遊走能の測定は、自体公知の方法により行うことができる。具体的には、細胞遊走能測定技術として公知のボイデンチェンバー法、ジグモンドチェンバー法やその変法を採用することができる。さらに、今後開発される新たな細胞遊走能測定技術を採用することもできる。具体的には、多数の孔を有するメンブレンにより遮断された上室に細胞を加え、下段に走化性因子を加え、一定時間反応させると、走化性因子に対して遊走活性を示す細胞は、メンブレンの孔を通過して下室に落ちるか、又はメンブレンの裏側に接着する。その落下した細胞を直接計測するか、又はメンブレンに接着した細胞を固定・染色後に一定面積内の細胞を計測することにより、遊走能を判定することができる。チェンバーをマルチウェルとすることにより、多くの試料を処理することができる。例えば、Neuro Probe社製のケモタキシスチェンバーが市販されており、利用することができる。
　より具体的には、次の方法によりスクリーニングすることができる。
　上述の破骨細胞前駆細胞を、細胞増殖に必要な培地を用いて2～7日間培養容器内で培養する。得られた細胞を、常法に従って培養容器から単離し、細胞の維持に必要な培地に懸濁し、細胞浮遊液を調製する。細胞浮遊液中の細胞の濃度は、遊走能の測定方法に従い適宜決定することができる。
　例えば、Neuro Probe社製のケモタキシスチェンバーを用いる場合について説明するが、これらに制限されるものではない。ケモタキシスチェンバーの下段には適当な濃度の候補物質を含む溶液を満たし、メンブレンをセットし、さらに上段に上記得られた細胞浮遊液を加えて、適当な時間培養する。培養時間は、細胞の種類、細胞数、候補物質の濃度等により適宜決定することができる。培養後、メンブレンをチェンバーから取り外し、その後メンブレンに付着している細胞を固定し、染色する。その後、上室に接していた面の細胞をふき取り風乾したのち、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定することにより、候補物質による細胞の遊走能を測定し、評価することができる。
　本発明のスクリーニング方法のうち、遊走能に及ぼす影響の確認工程で、候補物質とS1Pを含む系で細胞を培養し、候補物質による細胞の遊走能に及ぼす影響を確認する場合に使用可能な細胞は、少なくともS1P1とS1P2が発現している細胞、又はS1P1とS1P2を強制発現させた細胞であることが必要である。発現しているS1P1とS1Pとの相互作用による細胞の遊走能を確認することが必要だからである。このような細胞としては、好ましくは破骨細胞前駆細胞であり、スクリーニング系に使用するために株化され、入手可能な細胞であることが好ましい。具体的にはRAW264.7細胞、MOCP-5細胞、BM2細胞、HL-60細胞、又はS1P2を強制発現させたNIH3T3やHEK293細胞などが挙げられ、好ましくはRAW264.7細胞、MOCP-5細胞であり、最も好ましくはRAW264.7細胞である。
　また、本発明のスクリーニング方法により選抜された候補物質の機能的効果は、S1P1発現細胞、好ましくはS1P1及びS1P2を発現している細胞に候補物質とS1Pを加えて培養し、細胞のS1Pに対する遊走能を測定することにより確認することができる。さらには、S1P1発現細胞、好ましくはS1P1及びS1P2を発現している細胞に、候補物質とS1Pを加えて培養し、細胞内での低分子量Ｇタンパク質の一種であるRacの活性化を測定することでも確認可能である。RacはS1P1の刺激により活性化し、この作用によりS1Pに対して細胞が遊走能を示すからである。効果の確認に用いる細胞は、スクリーニングに使用可能な細胞を使用することができる。
　本発明は、S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質を有効成分とする、新規骨吸収抑制剤にも及ぶ。ここにおいて、S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質は、破骨細胞前駆細胞の遊走能を増強しうる物質である。そのような物質としては、S1P2アンタゴニスト、抗S1P2抗体又はS1P2発現抑制剤が挙げられる。S1P2アンタゴニストとして公知の化合物はJTE013であるが、本発明のスクリーニング方法により選別される新規S1P2アンタゴニストであってもよい。また、抗S1P2抗体は、自体公知の方法、例えばハイブリドーマから得たモノクローナル抗体、若しくは遺伝子組換により作製するモノクローナル抗体であっても良い。S1P2発現抑制剤としては、スクリーニング方法により選別される新規S1P2発現抑制剤であっても良いし、siRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドなどであっても良い。
　以下に、本発明を完成させるために行なった実験結果を参考例として示し、実施例において本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
（参考例１）破骨細胞前駆細胞とS1Pとの作用について
１）S1Pの受容体発現の確認
　破骨細胞前駆細胞由来細胞(RAW264.7)又は骨髄由来破骨細胞前駆細胞(BM-MDM)について、S1P1～S1P5及びインテグリンαｖのmRNA発現を確認した。mRNAの発現確認のため、対照としてGAPDHについても調べた。
　RAW264.7細胞又はBM-MDM細胞を、培地としてαMEM（Minimal Essential Medium）に10％熱非働化ウシ胎児血清（以下、「FCS」）とペニシリン／ストレプトマイシンを加えたものを用いて、RANKLを含まない系(RANKL(-))及び終濃度50ng/mlのRANKLを添加した系(RANKL(+))で37℃、3日間培養した。この細胞をセルスクレーパーを用いて単離して集め、該細胞からフェノール・クロロホルム抽出によりRNAを抽出し、これを基にして逆転写酵素によりcDNAを作製した。これを鋳型として各種遺伝子(S1P1～S1P5、インテグリンαｖ、GAPDH)に特異的なプライマーを用いてPCR反応を行った。PCRに用いたプライマー及びPCRの条件は、特許文献３の記載に従った。
　得られたPCR産物を電気泳動用ローディングバッファー(10×loading buffer（タカラバイオ製）)と混合し、2％アガロースゲルにて100V・20分の電気泳動を行い、目的とする遺伝子の発現を確認した。
　その結果を図２に示した。破骨細胞前駆細胞においては、RANKL(-)では、S1P1及びS1P2のmRNAが発現していることが確認された。一方、RANKL(+)の系では、S1P1の発現が著明に減弱しており、S1P2の発現が不変～軽度亢進していることが確認された。また、S1P3～S1P5の発現は見られなかった。
　なお、破骨細胞前駆細胞及び破骨細胞に発現し、RANKLにてその発現が亢進することが知られているインテグリンαｖについては、RANKL(+)の系で発現増強が見られた。これより、本試験系において破骨細胞前駆細胞はRANKLにより分化誘導シグナルを受けていることが確認された。また、GAPDHの結果より、RANKL(+)(-)の系で全mRNAレベルに変化がない（またはその抽出過程での変化もない）ことを確認した。図２において、RTは逆転写反応を意味し、RT(+)は逆転写反応を行ったもの、RT(-)は逆転写反応を行わなかったもの意味する。RT(-)はmRNAを抽出する際に、ゲノムのDNAがコンタミネーションしていないことを確認するためのネガティブ・コントロールである。
２）破骨細胞前駆細胞のS1Pに対する遊走能の確認
　上記１）と同様に、RANKL(+)又は(-)の系で37℃、3日間培養したRAW264.7細胞又はBM-MDM細胞をセルスクレーパー及び0.025％トリプシン-EDTAを用いて単離した。96ウェル・ケモタキシスチェンバー(Neuro Probe社製）にフィブロネクチンでコートしたポリカーボン製メンブレンフィルターをセットし、下段にはS1Pの終濃度が0, 10-10～10-7 Mとなるように調製したS1P含有培地を加えた。上段には単離したRAW264.7細胞又はBM-MDM細胞を、１ウェルあたり3×105個加え、CO2インキュベーターにて37℃、5時間培養した。その後、メンブレンフィルターを取り出してヘマトキシリン・エオジン染色を行い、プレートリーダーを用いて吸光度を測定し、遊走によりメンブレンフィルターへ移動した細胞の数を定量した。
　その結果in vitroの試験系で、RANKL(-)、即ちRANKLにより分化誘導されていない破骨細胞前駆細胞がS1Pに対する遊走能を示すことが確認された（図３ａｂ）。また、RAW264.7細胞ではS1Pの終濃度が10-9～10-8 Mの場合に遊走能が最も高く、10-7 Mの場合はやや低下した（図３ａ）。BM-MDM細胞ではS1Pの濃度依存的に遊走能も増強した（図３ｂ）。
３）破骨細胞前駆細胞のS1Pに対する遊走能の確認
　RANKL(-)の条件で、PTX(+)又は(-)の系で37℃、3日間培養したRAW264.7細胞を上記２）と同手法にてメンブレンフィルターをセットし、下段にはS1Pの終濃度が0, 10-12～10-5 Mとなるように調製したS1P含有培地を加えた。上記２）と同手法にて上段には単離したRAW264.7細胞を加え、培養後、メンブレンフィルターを取り出してヘマトキシリン・エオジン染色を行い、プレートリーダーを用いて吸光度を測定し、遊走によりメンブレンフィルターへ移動した細胞の数を定量した。
　その結果を図４に示した。in vitroの試験系で、PTX(+)の系で、破骨細胞前駆細胞のS1Pに対する遊走能の阻害が確認された。
４）破骨細胞前駆細胞内でのRacの活性化の確認
　上記２）及び３）と同様に、RANKL(-)の条件で、37℃、3日間培養したRAW264.7を、S1Pの終濃度が0, 10-8～10-6 Mとなるように調製したS1P含有培地を用いてさらに3時間培養した。該RAW264.7細胞をセルスクレーパーを用いて単離し、遠心分離により細胞を沈殿させた。沈殿した細胞をタンパク質抽出用緩衝液（150 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM Hepes-NaOH (pH 7.4), 1 mM PMSF, プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて再懸濁し、これを超音波破砕器で処理し、高速微量遠心分離により不溶解物を除去したものをRac活性測定用の試料とした。
　上記により得た試料の1/100量を分離し、試料１（Rac(1/100)）とした。残りの試料に、グルタチオン・セファロース（ビーズ）に固着させた「活性型（GTP結合型）Rac結合ドメインタンパク質（大腸菌で発現・精製）」を添加し、プルダウン・アッセイ法（標準的プロトコールに従う）によりこれに結合するタンパク質を単離し、試料２（GTP-Rac）とした。
　試料１及び試料２について、15％アクリルアミドゲルにてSDS-PAGEを行った。電気泳動終了後、PVDF膜へトランスファーした後に、抗Rac抗体（Upstate Biotechnology社製）を用いてウェスタン・ブロッティングを行い、膜上でのRacタンパク質の同定を行った。この方法により、破骨細胞前駆細胞での総Rac量（Rac(1/100)）、及び活性型（GTP結合型）Rac量（GTP-Rac）のそれぞれを調べた。
　その結果を図５に示した。S1Pの添加により、細胞内での総Rac量（Rac(1/100)）には変化がないのに対し、遊走能に重要な活性型Rac量（GTP-Rac）が増加していることが認められた。この結果は、S1Pによる刺激により破骨細胞前駆細胞内でRacの活性化が見られることを意味している。
５）結果
　破骨細胞前駆細胞にS1Pの受容体（S1P1及びS1P2）が発現していることが確認された。また、RANKLの刺激により破骨細胞前駆細胞が成熟破骨細胞に分化すると、S1P1の発現が低下することが確認された（図２）。in vitroの試験系で、破骨細胞前駆細胞が実際にS1Pに対する遊走能を示すことが確認された（図３，４）。さらに、細胞の遊走に重要なRacの活性化が破骨細胞前駆細胞内で起こっていることが確認された（図５）。
（参考例２）骨粗鬆症モデルマウスにFTY720（S1P1アゴニスト）を投与した場合の骨代謝に及ぼす影響
１）実験方法
　8～12週齢のC57BL/6マウス（雌性）の卵巣を麻酔下で摘出した骨粗鬆症モデルマウスを用いて、FTY720（S1P1アゴニスト）を投与した場合の骨代謝に及ぼす影響を確認した。卵巣摘出手術を行った骨粗鬆症モデルマウス及び偽手術を行った健常マウス(sham-operated)を作製した。健常マウス(sham-operated)群及び骨粗鬆症モデルマウス群について、FTY720投与群及び対照群(vehicle)に分類した。FTY720投与群では、卵巣摘出翌日若しくは偽手術翌日より、FTY720を3 mg/kgを毎日1度ずつ4週間連続して腹腔内投与した。各群5匹のマウスを用いた。4週間後に屠殺し、大腿骨の断面を観察した。
２）結果
　上記の結果、骨粗鬆症モデルマウス群では、対照群に比べてFTY720投与群の方が、明らかに骨密度が増加し、骨代謝が行なわれていることが観察された。一方、健常マウス群においては、骨密度に違いは殆ど認められなかった。このことより、S1P1アゴニストであるFTY720の投与により、骨粗鬆症モデルの場合は、骨密度が改善したのに対し、健常マウスでは健常な骨密度を維持し、骨密度を異常に上昇させることはなかった（図６参照）。
（実施例１）骨粗鬆症モデルマウスにJTE013（S1P2アンタゴニスト）を投与した場合の骨代謝に及ぼす影響
１）実験方法
　参考例２と同手法により作製した骨粗鬆症モデルマウスを用いて、S1P2アンタゴニストであるJTE013を投与した場合の骨代謝に及ぼす影響を確認した。JTE013は、vehicle（5% DMSO含有、脂肪酸を含まない3% BSA含有PBS)で溶解した。実験は、健常マウス(sham-operated)群及び骨粗鬆症モデルマウス群を準備し、各マウス群について、JTE013投与群及びvehicleを投与した対照群(vehicle)に分類した。JTE013投与群では、卵巣摘出翌日若しくは偽手術翌日より、JTE013を1 mg/kgを毎日1度ずつ4週間連続して腹腔内投与した。各群5匹のマウスを用いた。4週間後に屠殺し、大腿骨の断面を観察し、骨重量を測定した。以下の実施例において、特に説明する場合を除き、本実施例と同様に、JTE013はvehicleで溶解し、対照群を、「対照（vehicle）」と示す。
２）結果
　上記の結果、骨粗鬆症モデルマウス群では、対照群に比べてJTE013投与群の方が、明らかに骨密度が増加し、骨代謝が行なわれていることが観察された。一方、健常マウス群においては、骨密度に違いは殆ど認められなかった。このことより、S1P2アンタゴニストであるJTE013の投与により、骨粗鬆症モデルの場合は骨密度が改善したのに対し、健常マウスでは健常な骨密度を維持し、必要以上に骨密度を上昇させることはなかった（図７Ａ，Ｂ参照）。
（実施例２）生体多光子励起イメージングを用いた破骨細胞前駆細胞の動態解析とS1P2アンタゴニストの薬理効果の検討
　破骨細胞前駆細胞を含む骨髄内単球系細胞が緑色蛍光（GFP）にて標識されたマウス（CX3CR1-EGFPノックインマウス）の生きた骨髄内を、生体多光子励起蛍光イメージングにより可視化し、これにS1P2アンタゴニストであるJTE013を投与した場合の、破骨細胞前駆細胞の血中への再灌流効果について確認した。
　その結果、骨髄内での破骨細胞前駆細胞を含む単球系細胞は定常状態ではほとんどが静止しているが（図８、上段）、JTE013の投与により、対照に比べて動きが大きくなり、より多くの細胞が血中に再灌流されることが確認された（図８、下段）。実際に細胞速度の解析結果からも、JTE013投与群の方が、対照群（vehicle）に比べて細胞の動きが速くなっていることが観察された（図９）。これらは独立した6回の実験で確認されており、速度の解析の際には、JTE013投与群で237個、対照（vehicle）で252個の細胞から速度を算出し、unpaired t-testにて統計的有意差を検定した。
（実施例３）破骨細胞前駆細胞の遊走制御におけるS1P2の役割の解明と、S1P2アンタゴニストの薬理効果の評価
　S1P2遺伝子欠損マウス（S1P2-/-）及び野生型マウス（WT）を用いて、S1P2が単球系細胞（破骨細胞前駆細胞）及びTリンパ球の遊走に及ぼす役割について検討した。なお、S1P2遺伝子欠損マウス（S1P2-/-）は、米国国立衛生研究所より分与された。
　S1P2遺伝子欠損マウス(S1P2-/-)及び野生型マウス（WT）から末梢血を採取し、その中の単球系細胞（Mo, CD11b+）及びTリンパ球（T, CD3+）の各分画数を計測した。またこの際、S1P2アンタゴニストであるJTE013の薬理効果について検討するため、末梢血採取前にJTE013を投与した群（J）と対照(vehicle)（C）を作製し、各群から細胞を回収した。各分画数の計数のために、細胞を抗CD11b抗体（FITC標識）と抗CD3抗体（PE標識）で染色し、フローサイトメトリー（BD FACS CantoTM II（BD Biosciences社）など）において細胞数を算出した。この結果、S1P2を発現しないTリンパ球(T)では、WTやS1P2-/-, CやJ間で細胞数に変化がないのに対し（図１０、左側）、CD11b陽性の単球系細胞(Mo)はS1P2-/-で有意に増加していることが確認された（図１０、右側）。これは単球系細胞がS1P1作用により骨髄から末梢血中に再還流するのをS1P2が阻害しており、S1P2の欠損によりS1P1作用が増強し血中への流出が増加していることを表している。
　またJTE013投与により血中のCD11b陽性細胞数は増加しているが、この効果はS1P2-/-では見られない。JTE013がS1P2を阻害するため単球の末梢血への流出が増加すると考えられるが、この効果はS1P2遺伝子欠損マウスでは見られないことから、JTE013の効果が確かにS1P2を介したものであることを示している。これらは独立した3回以上の実験で確認された。
（実施例４）S1P2遺伝子欠損マウスにおける骨組織の解析
　S1P2の骨代謝調節に対する機能を解析するため、実施例３で使用したS1P2遺伝子欠損マウス（S1P2-/-）及び野生型マウス（WT）について、骨の組織形態学的解析を行った（各３匹ずつ）。この結果、S1P2-/-ではWTに比べて、骨量が有意に増加していることが確認された（図１１、１２）。図１１では各骨組織のCT画像（上段）及び顕微鏡組織像（下段）を示す。図１２では、図１１で取得した画像データを元に、数値パラメータを計測したものを示す。各パラメータは以下を示す。
骨密度 ：BV/TV（Bone Volume Fraction）（%）、
骨梁幅 ：Tb.Th（Trabecular Thickness）（mm）、
骨梁数 ：Tb.N（Trabecular Number）（1/mm）、
骨芽接着細胞面 ％：ObS/BS (%) (osteoblast surface/bone surface)、
骨吸収面 ％：(ES/BS) eroded surface/bone surface（≒破骨細胞接着面）
　結果としては、S1P2-/-ではWTに比べて骨密度（及び骨梁幅・骨梁数）が有意に増加しており、骨芽細胞接着面には有意な変化が見られないものの、骨吸収面（破骨細胞接着面）が有意に低下していることから、S1P2-/-による骨密度の増加は破骨細胞の接着・骨吸収機能の低下による（骨芽細胞の機能亢進ではなく）と判断される。これは、S1P2が破骨細胞前駆細胞の骨組織への流入を促している（骨から血中への再還流を阻害している）ことと対応する結果である。
　次に、S1P2遺伝子欠損マウス（S1P2-/-）及び野生型マウス（WT）について、骨吸収を促進させるためのRANKL投与群、RANKLに加えJTE013を投与した群及び対照(PBS)群の3種類を作製し、それぞれの骨組織を解析した（図１３）。RANKLは、PBSで溶解し、JTE013は、vehicle（5% DMSO含有、脂肪酸を含まない3% BSA含有PBS)で溶解した。RANKLは2 mg/kgを、JTE013は3 mg/kgをそれぞれ2日連続で腹腔内に投与し、その翌日にマウスを屠殺し、骨組織を回収・解析した。実験においては各群につき３匹ずつのマウスを使用した。
　この結果、WTでのRANKL投与群では、骨吸収面が増加し骨密度が低下したのに対し、RANKLに加えてJTE013を投与した群ではこれがいずれも抑制されており、JTE013が骨吸収抑制効果を示すことが確認された（図１３、上段）。一方、S1P2-/-では図１１、１２で示したと同様に、ベースの骨密度が高いが、RANKL投与で骨密度が低下するものの、JTE013では回復が見られなかった。これはJTE013の効果が、確かにS1P2を介したものであることを示すものである（図１３、下段）。
（実施例５）骨粗鬆症モデルマウスにS1P2アンタゴニスト投与した場合の骨組織の解析
　参考例２と同手法により作製した骨粗鬆症モデルマウスを用いて、S1P2アンタゴニストとしてJTE013を投与した場合の骨組織に及ぼす影響を確認した。実験は、健常マウス(sham-operated, Sham）群及び骨粗鬆症モデルマウス群(OVX)を準備し、各マウス群について、JTE013投与群(JTE)及び対照(vehicle)に分類した。
　JTE013投与群では、卵巣摘出翌日若しくは偽手術翌日より、JTE013を3 mg/kgを毎日1度ずつ4週間連続して腹腔内投与した。各群5匹のマウスを用いた。4週間後に屠殺し、大腿骨の断面を観察し、骨密度を測定した。各パラメータは、実施例４と同様である。
　上記の結果、骨粗鬆症モデルマウス群では対照群に比べてJTE013投与群の方が、明らかに骨密度 (BV/TV)、骨梁幅(Tb.Th)が増加することが観察された。一方、健常マウス群においては、対照群に比べてJTE013投与群による骨密度、骨量幅の増加の程度は、骨粗鬆症モデルマウス群に比べて低かった。このことより、S1P2アンタゴニストであるJTE013の投与により、骨粗鬆症モデルの場合は骨密度が改善したのに対し、健常マウスでは健常な骨密度を維持し、必要以上に骨密度を上昇させることはなかった。また、骨梁数(Tb.N)は、いずれのマウス群でも、JTE013の投与により微増したが、各マウス群の間で、差をほとんど認めなかった（図１４参照）。
　以上詳述したように、本発明のスクリーニング方法により、現存の骨吸収抑制剤とは異なるメカニズムによるスクリーニングを行うことができる。具体的には、S1PとS1P2との相互作用、並び破骨細胞前駆細胞の遊走能に及ぼす効果に基づく新規骨吸収抑制物質を選別しうるスクリーニングを行うことができる。本発明のスクリーニング方法により選別された骨吸収抑制剤は、現存する骨吸収抑制剤の作用機序とは異なり、成熟した破骨細胞の前段階である破骨細胞前駆細胞の遊走・位置決めを標的としている点において、極めて優れている。
　従来公知のビスホスホネート製剤は骨表面で成熟破骨細胞をアポトーシスさせる作用によるものであるが、本発明の方法により選別される薬剤は破骨細胞前駆細胞の骨細胞への流出入のバランスを制御するものであり、より安全性が高い薬剤ということができる。異なる作用機序による骨吸収抑制剤は、従来の薬剤と併用して使用することもできる。併用することで、従来の薬剤の使用量を軽減させ、かつ相乗効果も期待できる。さらに、破骨細胞前駆細胞が破骨細胞に成熟するのを防止する作用があることから、予防的に使用することで、骨粗鬆症の発症を抑制することも期待できる。
　人口の４人に１人が６５歳以上の高齢者という超高齢者時代を迎えた日本では、加齢による骨粗鬆症の患者数は1000万人を突破しつつある。また、社会の高齢化及び骨吸収性疾患の増加は、日本に限ったものではなく先進諸国に共通した問題である。現在、骨粗鬆症の罹患患者数は日米欧の先進諸国において約7500万人と推定されており、ビスホスホネート製剤をはじめとする骨吸収抑制剤の世界市場は総額8000億円に及ぶ巨大なマーケットである。また、この市場は今後確実に増加することが予想される。このため、本発明を基にした新規の有効な骨吸収抑制剤の開発の意義は、日本国内に留まらず、世界規模での創薬ビジネスへと発展することが期待される。

Claims (10)

  1. スフィンゴシン１リン酸（S1P）とスフィンゴシン１リン酸受容体２型（S1P2）との相互作用を阻害しうる物質を検出することを特徴とする、新規骨吸収抑制物質のスクリーニング方法。
  2. 少なくとも以下のＡ）及びＢ）の工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法：
    Ａ）候補物質のS1PとS1P2 との相互作用に及ぼす影響を確認し、S1PとS1P2 との相互作用を阻害しうる候補物質を選別する工程；
    Ｂ）候補物質による細胞の遊走能に及ぼす影響を確認し、遊走能の増強が確認された物質を選別する工程。
  3. 以下の工程を含む請求項１又は２に記載のスクリーニング方法：
    １）試験系に候補物質を添加し、S1PとS1P2との相互作用に及ぼす影響を確認する工程；
    ２）前記相互作用に及ぼす影響を確認した結果に基づき、S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる候補物質を選別する工程；
    ３）前記工程により選別された候補物質を、S1Pを含む系で培養した細胞培養系に添加する工程；
    ４）前記工程の後、細胞の遊走能を測定し、遊走能の増強が確認された物質をさらに選別する工程。
  4. 以下の工程を含む請求項１又は２に記載のスクリーニング方法：
    １）候補物質をS1Pを含む系で培養した細胞培養系に添加する工程；
    ２）前記工程の後、細胞の遊走能を測定し、遊走能の増強が確認された候補物質を選別する工程；
    ３）試験系に前記工程により選別された候補物質を添加し、S1PとS1P2との相互作用に及ぼす影響を確認する工程；
    ４）前記相互作用に及ぼす影響を確認した結果に基づき、S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質をさらに選別する工程。
  5. S1PとS1P2との相互作用に及ぼす影響を確認する工程が、S1P2活性又はS1P2発現量を確認する工程による、請求項２～４のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
  6. スクリーニング方法に用いる細胞が、少なくともS1P2及びS1P1を発現している細胞である、請求項２～５のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
  7. スクリーニング方法に用いる細胞が、破骨細胞前駆細胞である、請求項２～６のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
  8. S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質を有効成分とする、新規骨吸収抑制剤。
  9. S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質が、破骨細胞前駆細胞の遊走能を増強しうる物質である、請求項８に記載の新規骨吸収抑制剤。
  10. S1PとS1P2との相互作用を阻害しうる物質が、S1P2アンタゴニスト、抗S1P2抗体又はS1P2発現抑制剤である、請求項８又は９に記載の新規骨吸収抑制剤。
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