CN114324669B - 一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中l-精氨酸残留量的柱前手性衍生测定方法 - Google Patents
一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中l-精氨酸残留量的柱前手性衍生测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用普通C18柱反相HPLC进行人工合成的鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L‑精氨酸残留量的检测的柱前手性衍生测定方法，包括样品前处理和液相检测，样品前处理中，对照品DL‑精氨酸及D‑精氨酸中加入衍生剂处理；供试品是鲑鱼促性腺激素释放激素类似物水解制备得到后加入衍生剂处理；所述的衍生剂是1%Nα‑(2,4‑二硝基‑5‑氟苯基)‑L‑丙氨酰胺的丙酮溶液并加入0.5mol/L NaHCO3溶液作为缚酸剂。本发明能有效区分D‑精氨酸和L‑精氨酸，解决了普通液相D‑精氨酸和L‑精氨酸在同一位置流出无法区分且无足够紫外检测信号的问题，也解决了其他杂峰干扰，建立了人工合成的鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L‑精氨酸残留量检测的柱前手性衍生测定方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用普通C18柱反相HPLC进行人工合成的鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量的检测的柱前手性衍生测定方法。
背景技术
人工合成的促性腺激素释放激素(Gonadotrophin Releasing Hormone)的类似物，属于多肽，最初诞生于20世纪80年代，被命名为GnRH-F或sGnRH-A，研究发现当其用于鱼类时，与鲑鱼促性腺激素释放激素(Salmon Gonadotropin Releasing Hormone,sGnRH)相比，鱼类血清中GtH水平升高更为显著。sGnRH氨基酸序列为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-Gly-NH2，而sGnRH-A序列为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Trp-Leu-Pro-NEt(Peter R.E.等,1985)。相比于前者，本品的氨基酸序列在第6位上变成了D-型氨基酸，研究发现这样一个结构的变化使其生物活性显著升高；另外一个变化就是去除了10位的甘氨酸，并对C末端进行了乙胺化修饰；正是因为这两个位置的化学结构修饰或改变，使其生物活性显著升高(Peter等,1985,1987)，正因为与sGnRH氨基酸序列高度相似，而且后者又可以发挥类似于sGnRH的生理作用。鲑鱼的GnRH被分离提纯出来后，陆续合成了多种鲑鱼GnRH的类似物，而其中sGnRH-A对鱼的活性最强，约为LRH-A(LHRH-A2或Alarelin)的10多倍；其与DOM(Domperidone)合用，一次注射即可使多种鱼类的GtH迅速分泌并诱导排卵与产卵，催产率高而且相当稳定，效应时间较短，催产效果优于RES+LRH-A。
在制定质量标准过程中，鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量的检测是一个非常重要的指标，如何区分D/L精氨酸残留则是影响L-精氨酸残留量检测精准度的一个重要因素，直接影响到药物的生物活性。
鲑鱼促性腺激素释放激素类似物合成所使用的原料之一是D-精氨酸，D-精氨酸中可含有微量L-精氨酸；反应过程中D-精氨酸也可发生消旋化，产生L-精氨酸。以上因素均可导致药效降低，因此需要检测控制鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中的L-精氨酸残留量，以保证药效。
而常见的普通C18柱反相HPLC检测L-精氨酸有3个问题：第一，L-精氨酸和D-精氨酸互为对映体，极性一致，保留行为相同，将同时流出，无法区分；第二，L-精氨酸和D-精氨酸均没有共轭双键，无法给出足够的紫外检测信号；第三，L-精氨酸和D-精氨酸极性过强，在普通C18柱反相HPLC流出过快，无法和其他组分分离。
而为了检测鲑鱼促性腺激素释放激素类似物的L-精氨酸，还需解决水解问题并避免水解过程中的消旋化和其他干扰反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量的测定方法。采用HPLC的普通C18反相柱检测方法，用Marfey试剂对产品水解产生目标氨基酸进行手性衍生，使原本互为对映体的D-氨基酸和L-氨基酸形成非对映异构体，对D/L型氨基酸的比例进行检测。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量的测定方法，包括样品前处理和液相检测，样品前处理中，对照品DL-精氨酸及D-精氨酸中加入衍生剂处理；供试品是鲑鱼促性腺激素释放激素类似物水解制备得到后加入衍生剂处理；所述的衍生剂是1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺的丙酮溶液并加入0.5mol/L NaHCO3溶液作为缚酸剂。
进一步的，所述的DL-精氨酸和衍生剂的浓度比为1：1.2～1.7。
进一步的，所述的DL-精氨酸和衍生剂的浓度比在1：1.5。
进一步的，液相检测时的液相条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相是甲醇：水＝40:60；柱温35℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长340nm，进样量50μl。
进一步的，所述的供试品的制备：将鲑鱼促性腺激素释放激素类似物水解获得。
进一步的，供试品水解温度为110℃，水解时间为4小时。
进一步的，所述的供试品的制备：称取鲑鱼促性腺激素释放激素类似物适量，用6mol/L的盐酸溶液溶解并稀释置2ml安瓿中，一边旋转一边抽尽安瓿内的空气，并火焰熔封，把熔封后的安瓿置恒温干燥箱中，110℃水解4h，取出安瓿，放冷后即得衍生前供试品。
进一步的，一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量的测定方法，所述的供试品鲑鱼促性腺激素释放激素类似物的制备通过氨基酸拼接、裂解、沉淀干燥得到鲑鱼促性腺激素释放激素类似物粗品，再对粗品进行纯化、转盐、冷冻干燥、成品分装，得到鲑鱼促性腺激素释放激素类似物。
进一步的，所述的供试品鲑鱼促性腺激素释放激素类似物是由如下制备方法制备得到：
(1)Fmoc-Pro-CTC树脂的制备；
(2)Fmoc-Leu-Pro-CTC树脂的制备；
(3)Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Pro-CTC树脂到pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Pro-CTC树脂的制备；
(4)pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Pro-OH的制备(树脂切割)；
(5)Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu--Pro-NHEt的制备；
(6)Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Trp-Leu-Pro-NHEt的制备；
(7)纯化工艺；
(8)转盐工序；
(9)冷冻干燥、分装即得。
本发明一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量的测定方法，采用普通C18柱反相HPLC检测方法，用Marfey试剂对目标氨基酸进行手性衍生，使原本互为对映体的D-氨基酸和L-氨基酸形成非对映异构体，对D/L型氨基酸的比例进行检测，并通过合适的DL-精氨酸和衍生剂的浓度比，流动相以及供试品的水解时间等，有效区分D-精氨酸和L-精氨酸，解决了普通液相D-精氨酸和L-精氨酸在同一位置流出无法区分且无足够紫外检测信号的问题的问题，也解决了其他杂峰干扰，建立了人工合成的鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量检测的柱前手性衍生测定方法。
附图说明
图1：供试品的UV图；
图2：供试品的质谱图；
图3：供试品的相对分子质量；
图4：鲑鱼促性腺激素释放激素类似物(有关物质)图谱；
图5：实施例2中空白图谱；
图6：实施例2中DL-精氨酸对照品图谱；
图7：实施例2中D-精氨酸对照品图谱；
图8：实施例2中鲑鱼促性腺激素释放激素类似物供试品图谱；
图9：浓度比(DL-精氨酸：衍生剂＝1:3.5)的图谱；
图10：浓度比(DL-精氨酸：衍生剂＝1:1.7)的图谱；
图11：浓度比(DL-精氨酸：衍生剂＝1:1.2)的图谱；
图12：浓度比(DL-精氨酸：衍生剂＝1:0.8)的图谱；
图13：45％甲醇流动相下(DL-精氨酸)的图谱；
图14：45％甲醇流动相下(供试品)的图谱；
图15：40％甲醇流动相下(DL-精氨酸)的图谱；
图16：40％甲醇流动相下(供试品)的图谱；
图17：35％甲醇流动相下(DL-精氨酸)的图谱；
图18：35％甲醇流动相下(供试品)的图谱；
图19：30％甲醇流动相下(DL-精氨酸)的图谱；
图20：30％甲醇流动相下(供试品)的图谱；
图21：供试品110℃水解24h图谱；
图22：供试品110℃水解20h图谱；
图23：供试品110℃水解8h图谱；
图24：供试品110℃水解4h图谱。
具体实施方式
实施例1：鲑鱼促性腺激素释放激素类似物的制备
本实施例鲑鱼促性腺激素释放激素类似物的制备工艺包括2个阶段，第一阶段为粗品生产，第二阶段为精品生产，各阶段主要操作叙述如下：
第一阶段：粗品生产
氨基酸拼接、裂解、干燥得到鲑鱼促性腺激素释放激素类似物粗品。
工序1：Fmoc-Pro-CTC树脂的制备
将Fmoc-Pro-OH、DIEA用DMF溶解后投入加有2-Cl-CTC树脂的反应釜中，制得Fmoc-Pro-CTC树脂。
工序2：Fmoc-Leu-Pro-CTC树脂的制备
加入哌啶溶液脱保护。称取Fmoc-Leu-OH、HOBT，用DMF溶解，加入DIC活化，加入反应釜中，搅拌。
工序3-9：Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Pro-CTC树脂到pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Pro-CTC树脂的制备
如上所述依次偶联下列氨基酸：Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)–OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、pGlu。
工序10：pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Pro-OH的制备(树脂切割)
将肽树脂加入裂解液中，搅拌。滤除树脂，合并滤液，浓缩。得全保护九肽。
工序11：Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu--Pro-NHEt的制备
上述全保护九肽用DCM溶解，投入PyBoP和乙胺盐酸盐，搅拌反应，旋干。
工序12：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Trp-Leu-Pro-NHEt的制备
将上述所得乙胺化产物加入脱保护液，反应制得粗肽(粗品)。
第二阶段：精品生产
对粗品进行纯化、转盐、冷冻干燥、成品分装等步骤，最终得到鲑鱼促性腺激素释放激素类似物原料药，结果符合质量标准。
工序1：纯化工序
(1)填料：C18填料。
(2)样品溶解：取鲑鱼促性腺激素释放激素类似物粗肽溶于纯化水中，适量醋酸助溶，用0.45μm微孔滤膜过滤。
(3)洗柱。
(4)上样：将样品溶液上柱，使样品吸附。
(5)洗脱：用磷酸盐缓冲液洗脱，分瓶收集，合并高纯度溶液。
工序2：转盐工序
(1)填料：同纯化工序。
(2)洗柱。
(3)用水相进行色谱柱的前平衡。
(4)上样：将样品溶液上柱。
(5)用水相进行后平衡。
(6)洗脱收集。
(7)浓缩：用旋转蒸发仪减压浓缩。将产品平铺于不锈钢冻干盘中，放入冻干箱，关好箱门。
工序3：冷冻干燥
将产品按照冷冻干燥程序进行冻干。
工序4：分装
产品碾碎，分装于瓶中。
制备获得的鲑鱼促性腺激素释放激素类似物经检测，各项指标均符合要求，纯度为98.18％。详见图1鲑鱼促性腺激素释放激素类似物的UV图，图2质谱图，图3供试品的相对分子质量，图4：鲑鱼促性腺激素释放激素类似物(有关物质)图谱。
实施例2：鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量的柱前手性衍生测定法。
1、样品信息
DL-精氨酸、D-精氨酸、鲑鱼促性腺激素释放激素类似物
2、实验目的
采用普通C18柱反相HPLC检测方法，用Marfey试剂对目标氨基酸进行手性衍生，测试鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量。
3、实验设备
(1)Thermo Fisher高效液相UltiMate3000
(2)真空安瓿熔封机
4、材料和试剂，均为市售
(1)Marfey试剂
(2)丙酮
(3)NaHCO3
(4)HCL
(5)NaOH
5、相关检测试剂准备
(1)1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey试剂)的丙酮溶液：取Marfey试剂约100mg，加入丙酮约13ml，混匀，即得。即含衍生剂Marfey试剂约28.9μmol/ml。
(2)取NaHCO3粉末适量，加水，使溶解成0.5mol/LNaHCO3溶液。
(3)取HCL适量，加水摇匀，使成3mol/LHCL溶液和6mol/LHCL溶液。
(4)取NaOH粉末适量，加水，使溶解成5mol/LNaOH溶液。
检测方法：
色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶(4.6mm×250mm，5μm)为填充剂；以甲醇：水＝40:60为流动相；柱温35℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长340nm，进样量50μl。
对照品的柱前手性衍生：取DL-精氨酸对照品适量，加水溶解至浓度约为0.2mg/ml，作为对照品储备液。量取上述对照品储备液2ml，加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液100μl，加1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey试剂)的丙酮溶液100μl，充分混匀，在40℃下放置反应90分钟，然后用3mol/L的盐酸溶液调节pH至中性，用流动相稀释并定容至25ml，即得DL-精氨酸对照品溶液(系统适用性)。
用水代替DL-精氨酸对照品储备液，同上法操作，即得空白对照溶液。
取D-精氨酸对照品适量，加水溶解至浓度约为0.1mg/ml，作为对照品储备液。量取上述对照品储备液2ml，加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液50μl，加1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey试剂)的丙酮溶液50μl，充分混匀，同法衍生，然后用3mol/L的盐酸溶液调节pH至中性，用流动相稀释并定容至25ml，即得D-精氨酸对照品溶液。
衍生前供试品的制备：称取鲑鱼促性腺激素释放激素类似物适量，用6mol/L的盐酸溶液溶解并稀释至每1ml约含鲑鱼促性腺激素释放激素类似物2.5mg的溶液，精密移取1ml，置2ml安瓿中。把安瓿置定型设备“真空安瓿熔封机”内，一边旋转一边抽尽安瓿内的空气，并火焰熔封。把熔封后的安瓿置恒温干燥箱中，110℃水解(24h、20h、8h、4h)。取出安瓿，放冷，作为衍生前供试品溶液。
供试品的柱前手性衍生：将上述衍生前供试品全部内容物移出，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至中性，加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液1.2ml，加1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey试剂)的丙酮溶液1.2ml，充分混匀，在40℃下放置反应90分钟，然后用3mol/L的盐酸溶液调节pH至中性，用流动相稀释并定容至25ml，即得供试品溶液。
具体检测结果如下：该批鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中经水解及Marfey试剂衍生后成单个氨基酸，通过高效液相色谱法反相色谱柱检测，精氨酸中只存在D精氨酸。详见图5～图8。
实施例3：氨基酸浓度与衍生剂浓度反应比例筛选
取DL-精氨酸配制一定浓度的溶液，添加不同量的一定浓度下的衍生剂在相同条件下进行反应，通过高效液相色谱法观察，是否存在反应过量或反应不充分，以确定一个合适的浓度比范围。
1、样品前处理
分别取DL精氨酸对照品适量，加水溶解，使成含氨基酸约50μmol/ml。加入适量0.5mol/LNaHCO3溶液及衍生剂1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey试剂)的丙酮溶液，充分混匀，在40℃下放置反应90分钟，然后用3mol/LHCL溶液调节pH至中性，用流动相稀释并定容至25ml。
2、色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶(4.6mm×250mm，5μm)为填充剂；以甲醇：水＝45:55为流动相；柱温35℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长340nm，进样量5μl。
由图9～图12以及上表可知，DL-精氨酸和衍生剂的浓度比在1：1.2和1：1.7均比较适宜。1：0.8衍生剂不够，衍生不充分。因此DL-精氨酸和衍生剂的浓度比在1.2～1.7之间比较适宜，其中1：1.5效果最佳，DL-精氨酸既能充分衍生，也不会使过量的衍生剂跟其他位点反应，导致图谱变得复杂难辨。
实施例4：流动相比例的确定
从上述氨基酸浓度与衍生剂浓度反应比例筛选过程中发现，在色谱条件以甲醇：水＝45:55为流动相下，D精氨酸与其左侧的降解产物峰之间的分离度明显小于1.5。将鲑鱼促性腺激素释放激素类似物供试品水解后衍生，同时与衍生后的氨基酸对照品利用高效液相色谱法进行分析，通过流动相比例的调整，排除其他峰对L精氨酸峰、D精氨酸峰的干扰。
1、样品前处理
分别取DL精氨酸对照品适量，加水溶解，使成含氨基酸约50μmol/ml。加入适量衍生剂0.5mol/LNaHCO3溶液及1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey试剂)的丙酮溶液，充分混匀，在40℃下放置反应90分钟，然后用3mol/LHCL溶液调节pH至中性，用流动相稀释并定容至25ml。
衍生前供试品的制备：称取鲑鱼促性腺激素释放激素类似物适量，用6mol/L的盐酸溶液溶解并稀释置2ml安瓿中。把安瓿置定型设备“真空安瓿熔封机”内，一边旋转一边抽尽安瓿内的空气，并火焰熔封。把熔封后的安瓿置恒温干燥箱中，110℃水解4h。取出安瓿，放冷，作为衍生前供试品溶液。
供试品的柱前手性衍生：将上述衍生前供试品全部内容物移出，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至中性，加入适量0.5mol/LNaHCO3溶液及衍生剂1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey试剂)的丙酮溶液，充分混匀，在40℃下放置反应90分钟，然后用3mol/L的盐酸溶液调节pH至中性，用流动相稀释并定容至25ml，即得供试品溶液。
2、色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶(4.6mm×250mm，5μm)为填充剂；柱温35℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长340nm，调整流动相中有机相的比例，观察其出峰情况。见图13～图20。
| 序号 | 流动相比例 | 结果 |
| 1 | 甲醇：水＝45:55 | 对照品中D精氨酸受其他产物峰干扰 |
| 2 | 甲醇：水＝40:60 | D精氨酸、L精氨酸之间分离度良好，未受其他产物峰或系统峰干扰 |
| 3 | 甲醇：水＝35:65 | 对照品中L精氨酸受其他产物峰干扰 |
| 4 | 甲醇：水＝30:70 | 供试品中L精氨酸受系统峰干扰 |
从结果来看，利用高效液相色谱法通过流动相比例的调整，在色谱条件以甲醇：水＝40:60为流动相下D精氨酸、L精氨酸之间分离度良好，未受其他产物峰或系统峰干扰。
实施例5：衍生前供试品水解时间对消旋化的影响
色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶(4.6mm×250mm，5μm)为填充剂；以甲醇：水＝40:60为流动相；柱温35℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长340nm，进样量50μl。
对照品的柱前手性衍生：取DL-精氨酸对照品适量，加水溶解至浓度约为0.2mg/ml，作为对照品储备液。量取上述对照品储备液2ml，加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液100μl，加1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey试剂)的丙酮溶液100μl，充分混匀，在40℃下放置反应90分钟，然后用3mol/L的盐酸溶液调节pH至中性，用流动相稀释并定容至25ml，即得DL-精氨酸对照品溶液(系统适用性)。
用水代替DL-精氨酸对照品储备液，同上法操作，即得空白对照溶液。
取D-精氨酸对照品适量，加水溶解至浓度约为0.1mg/ml，作为对照品储备液。量取上述对照品储备液2ml，加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液50μl，加1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey试剂)的丙酮溶液50μl，充分混匀，同法衍生，然后用3mol/L的盐酸溶液调节pH至中性，用流动相稀释并定容至25ml，即得D-精氨酸对照品溶液。
衍生前供试品的制备：称取鲑鱼促性腺激素释放激素类似物适量，用6mol/L的盐酸溶液溶解并稀释至每1ml约含鲑鱼促性腺激素释放激素类似物2.5mg的溶液，精密移取1ml，置2ml安瓿中。把安瓿置定型设备“真空安瓿熔封机”内，一边旋转一边抽尽安瓿内的空气，并火焰熔封。把熔封后的安瓿置恒温干燥箱中，110℃水解(24h、20h、8h、4h)。取出安瓿，放冷，作为衍生前供试品溶液。
供试品的柱前手性衍生：将上述衍生前供试品全部内容物移出，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至中性，加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液1.2ml，加1％Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(Marfey试剂)的丙酮溶液1.2ml，充分混匀，在40℃下放置反应90分钟，然后用3mol/L的盐酸溶液调节pH至中性，用流动相稀释并定容至25ml，即得供试品溶液。
由图21～图24可知，水解时间为4h时，未发生消旋反应，水解时间合适，其他水解8小时、20小时和24小时均发生消旋化。
Claims (2)
1.一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量的测定方法，包括样品前处理和液相检测，其特征在于，样品前处理中，对照品DL-精氨酸及D-精氨酸中加入衍生剂处理；鲑鱼促性腺激素释放激素类似物水解制备得到供试品后加入衍生剂处理；所述的衍生剂是1%Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺的丙酮溶液并加入0.5mol/L NaHCO3溶液作为缚酸剂；其中所述的DL-精氨酸和衍生剂的浓度比在1：1.5；所述的鲑鱼促性腺激素释放激素类似物是Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Trp-Leu-Pro-NHEt；所述的液相检测时的液相条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相是甲醇:水=40:60，柱温35℃，流速为每分钟1.0ml，检测波长340nm，进样量50μl；所述的供试品的制备：称取鲑鱼促性腺激素释放激素类似物适量，用6mol/L的盐酸溶液溶解并稀释置2ml安瓿中，一边旋转一边抽尽安瓿内的空气，并火焰熔封，把熔封后的安瓿置恒温干燥箱中，110℃水解4h，取出安瓿，放冷后即得衍生前供试品。
2.根据权利要求1所述的一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中L-精氨酸残留量的测定方法，其特征在于，所述的供试品鲑鱼促性腺激素释放激素类似物的制备通过氨基酸拼接、裂解、沉淀干燥得到鲑鱼促性腺激素释放激素类似物粗品，再对粗品进行纯化、转盐、冷冻干燥、成品分装，得到鲑鱼促性腺激素释放激素类似物，具体由如下制备方法制备得到：
（1）Fmoc-Pro-CTC树脂的制备；
（2）Fmoc-Leu-Pro-CTC树脂的制备；
（3）Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Pro-CTC树脂到pGlu-His（Trt）
-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Leu-Pro-CTC树脂的制备；
（4）pGlu-His（Trt）-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-
Leu-Pro-OH的制备；
（5）Pyr-His（Trt）-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-
Leu--Pro-NHEt的制备；
（6）Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Trp-Leu-Pro-NHEt的制备；
（7）纯化工艺；
（8）转盐工序；
（9）冷冻干燥、分装即得。
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Non-Patent Citations (3)
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| Amino Acid Racemization in Pseudomonas putida KT2440;Atanas D. Radkov等;Journal of Bacteriology;第195卷;5016-5024 * |
| Atanas D. Radkov等.Amino Acid Racemization in Pseudomonas putida KT2440.Journal of Bacteriology.2013,第195卷5016-5024. * |
| 反相高效液相色谱定量分析多肽中的氨基酸组成;吕艳等;浙江农业科学(第2期);211-214 * |
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