HU227753B1 - Method for chromatographically purifying insulins - Google Patents

Description

Eljárás inzulinok kromatográfiás tisztítására

A jelen találmány tárgya javított eljárás inzulinok kromatográfiás tisztítására.

Az inzulinok előállítási eljárásaim enzimes és/vagy géntechnológiai folyamatok mellett lényegében kromatográfiás eljárások jellemzőek, tekintettel a szélsőséges tisztasági követelményekre.

Az inzulinok fogalommal itt természetes forrásokból származó vagy rekombináns (azaz genetikailag módosított mikroorganizmusok által expnmáll), állati vagy humán eredetű inzulinokat (például sertés-, szarvasmarha- vagy humán inzulint), proinzulinokat (például inzulin elotermékeket, preínzulínt) és inzulin-származékokat jelölünk, fozulin-szánnazékon az. alábbiakban természeteseit előforduló inzulinok, azaz humán inzulin vagy állati eredetű inzulin származékait értjük, amelyek legalább egy természetese» előforduló aminosavcsoport kiváltásával és/vagy legalább egy természetes amínosavesoport és/vagy .szerves csoport hozzáadásával a máskülönben azonos természetes Inzulintól különbözik.

A humán inzulin olyan poiipeptid, amely 51 aminosavtól áll. Az un, A-lánc (acídíe) 21, a B-lánc (hasié) 30 amínosavmaradékból ált A két aminosavíáncban 6 db císzíemcsoporí van jelen, és mindig két ciszieínesoportot egy díszulfidhíd kot össze (a két láncot két eíszteinhid tartja Össze. A biológiailag aktív humán inzulinban az A- és Bláncot két ciszteinhíd köti össze, és további híd az A-lánchan fordul elő. A (biológiailag aktív) humán inzulinban az alábbi cisztelncsoportok kapcsolódnak össze:

Aő-All

A ~ B7,

A20-BI9.

A betű a láncot, a szám az amino savmaradék pozícióját jelöli; az. utóbbit az. armnosavlánc aminovégétől a karboxílvége felé számolják,

A rekombináns inzulin előállítása általában fermentálásból, feltárásból, majd a tennék tisztítását célzó proteínkémiai és efjárásteehnolögíai, általában kromatigráfíás lépésekből ált

Géntechnológiai eljárásokkal mikroorganizmusokban olyan emberi inzulin vagy proinzuhn (inzulin-származékok proinzulínje) is állítható elő, amelynek aminosuvláne hossza és/vagy szekvenciája a természetes humán inzulintól eltér. A .genetikaiiag megváltoztatott Escheríchia coli sejtekben termelt prcmzulínoknuk nincsenek szabályosan

93849-9449 Toösszekötött cisztemhídjal. Szabályosan összekötött inzulínhídakkal rendelkező humán inzulin eiőáílitására eljárást például az EP ö 055 945 ismertet. Javított eljárások szabályosan összekötött Inzuiinhídakkal rendelkező humán inzulin és inzulin-származékok eiőáílitására például az alábbi Irodalomban találhatók: EP 0 600 372 Al (US 5,473,049) és EP 0 66S 292 Λ2 (US 5,663,291).

A genetikailag módosított mitoorgműzmosok termelte proinznlim (az inzulin elővegyületéí) először a sejtekből izolálják, szabályosan hajtogatják, majd enzimes úton humán inzulinná alakítják. Áz enzimes bontás során keletkező elegy nemkívánatos, melléktermékek mellett a terméket, valamint nemkívánatos inzuhnszerü kisérőanyagokat tartalmaz, amelyek sem móltőmegben, sem egyéb fizikai tulajdonságokban nem különböznek határozottan a terméktől, ezért ezek elválasztása, a termék tisztítása főleg ipari mértékben Igen nehéz.

Az inzulin tisztítására alkalmazott eljárástechnológiai folyamatok különböző, egymásra követő kromatigráfiás eljárások (például adszorpelös kromatlgráfia, íoneserekromaligráfta, fordított fázisú, illetve nagy nyomású fordított fázisú kromatigráfiás eljárás vagy a felsoroltak kombinációja), amelyet több lépcsőben, különböző hordozóanyagokkal, részben kristályosítással végeznek. A tulajdonképpeni tisztítás a kromatigráfia során történik; az inzuhnszerü anyagok leválasztása az ioncserélőn, illetve a fordított fázisú kovasavgélen megy végbe.

A végső fényezés (end políshing; a legcsekélyebb szennyeződések eltávolítása utolsó tisztító lépésként) általában nagy nyomáson történő, fordított fázisú kovasavgélen végzett kromatográfiás lépés (RP-HPLC ~ Reversed Phase High Pressure Llquíd Chromatögraphy).

Fordított fázisú kovasavgéi lipofiliá, azaz hldrofóhbá tett olyan szllika-ajiyag, amelyre hidofőb mátrixot vittek fel. A hidrofób mátrix lehet például 3-20 szénatomos, előnyösen 4-18 szénatomos álkán. A szentesemére! 10 pm és SÖ fim közötti tartományba esik, a pőrusntéret 5Ö-3O0 A.

Kromatográfiás eljárások, amelyekben a technika állása szerint hasznosítják az RP-kovasavgéleket (RP-kovasavgéleket), például az alábbi irodalomban találhatók (EP 0 547 544 A2 (US 5,021,073), EP 0 474 213 Ál (US 5,245,008) A technika állása szerint csak. RP-kovasavgélekkel lehet az inzulin tisztasága iránt támasztott nagyon magas követelményeket teljesíteni. Az RP-kovasavgélek alkalmazásának azonban döntő hátrányai vannak.

Az RP-kovasavgélek csak a 2 -és 10 közötti pH-tartományban stabilak. A fermentációs- termékek kromatográfiás feldolgozása során mindig nagy móltöroegü melléktermékek vannak jelen, ezek szorosan adszorbeálódnak és a szokásos eluálással nem távolíthatók el. Ezek a melléktermékek az RP-kovasavgélen idővel feldúsulnak (ezt az adszorbens öregedésének nevezik). Regenerálás, illetve tisztítás (Cleaning. in piacé, GIF) többnyire csak Ing nátnum-hidroxid-oldattal lehetséges, azaz minden tisztításkor az _:RPkovasavgéi egy része tönkremegy, a folyamatos pótlás viszont igen költséges. Emellett az inzulin - kovasavgéllel érintkezve -- denaturálödhat

Sok kísérletet végeztek annak érdekében, hogy a szilika bázisú RP-kovasavgéleket valamivel helyettesítsék. Alummíum-oxid vagy titán-dioxid bázisú RPanyagokkal végzett kísérletek (mindkét anyag nem teljesen pH-stabil, de a. szitikagélnéi stabilabb) azt mutatták, hogy a szétválasztás nem kielégítő, a követelt tisztasági paraméterek nem. érhetők eh

A kromatográfiás anyagok egy további szükséges tulajdonsága a nyomásállóság, Nyomásállő polimer kromatográfiás anyagon olyan szerves poHmetrészecskéket értenek, amelyek különböző alakban, így rudacska, törmelék vagy előnyösen gömböeskék alakjában vannak jelen (az utóbbiak átmérője előnyösen 10-35 um) és nyomás behatására (70x10' Pa-ig) csak csekély mértékben deformálódnak. A kromatográfiás oszlopban lévő anyagnak oly sűrűn kell elhelyezkednie, hogy üreges tér ne keletkezzék, A részecskék minél sűrűbb elhelyezkedése döntően befolyásolja a szétválasztás eredményét. A kolonnák megtöltésére alapvetően két módszer ismert, amely kombináltan is alkalmazható. Az egyik az, hogy (többnyire hidraulikusan üzemeltethető) bélyegző segítségével az anyagot összenyomják (DAC ~ öíreet. Axial Compression); a másik módszer szerint a kolonnát hidrodinamikusán töltik, azaz folyadék és részecskék szuszpenzióját nyomják a kolonnába nagynyomású szivattyúval, Mindkét esetben a gyakorlat azt mutatja, hogy a kolonna keresztmetszetére akár 70x10' Pa nyomásnak kell hatoía ahhoz, hogy a részecskék kellő sűrűséggel, üreges helyek keletkezése nélkül helyezkedhessenek el.

Számos szerves polimerrészecske nem nyomásálió, és nyomás behatására annyira deíbrrnalódnak, hogy a gömbök lapos koronggá alakulnak, a korongok átlapolják egymást, a tölteten keresztül lehetetlenné válik az átfolyás. Ezzel szemben a RPkovasavgélek lényegesen keményebbek, az említett nyomások alatt alig deformálódnak.

A jelen találmány feladata olyan eljárás kidolgozása volt, amellyel inzulinok kromatográfiásan tisztíthatok alkalmas, nyomásállő, az 1-14 közötti teljes pH♦·*··* * *♦ * ♦ * ♦ * A« tartományban alkalmazható kromatográfiás anyagon. További célkitűzés oly mértékű elválasztási teljesítmény volt, hogy a technika állása szerint szokásos két vagy több, egymást követő kromatográfiás lépés helyett az inzulin szükséges tisztaságának elérésére, ugyanakkor e tiszthölépés hozamának növelésére csak egy lépés szükséges.

A íéntl feladatot inzulinok kromatográfiás tisztítására szolgáló eljárással oldottuk meg, amelyre jellemző, hogy álló fázisként nyomásaik) szerves polimer 'kromatográfiás anyagot alkalmazunk, a mozgó· fázis legalább egy, vízzel elegyedő szerves oldószert és legalább egy pufferanyagot tartalmaz és a pH-érték 7 és 11 közötti.

Meglepő módon azt találtuk, hogy 7 és 11 közötti pH-érték mellett, azaz bázikus tartományban végzett kromatográfiás eljárással nyomásálló szerves polimer kromatográfiás anyagokon nagyon jó· elválasztás érhető el. A pH-érték előnyösen 9 és lö közötti,

A találmány szerinti eljárás különös előnye, hogy a bázikus pH-tartományban a dez-amido-inzulín képződése visszaszorul; a dés-amiho-ínzuiin olyan kísérőanyag, amely rendszerint savas közegben képződik és az Inzulin-készítményekre érvényes specifikációk szerint igen csekély mennyiségű maradékig elválasztandó.

Az elváláshoz használt mozgó fázis vízzel elegyedő szerves oldószert, például l.~ 4 szénatomos alkoholokat, ketont, metil-aeetátot vagy aceto-nitriit tartalmaz. Előnyösek az alkoholok, igy I- vagy 2-propannl (n~ vagy izopropanol), metanol vagy etanol, A vízzel elegyedő szerves oldószer részaránya 1 tí% és 90 tf% közötti, előnyösen IÖ rf% és 50 tf% közötti.

A mozgó fázis továbbá pufferanyagot tartalmaz az eluens pH-értékének állandó értéken tartására. Alkalmas pufíéraayagok például foszfátok, alkálifém- vagy alkálitöldfemsók, így náíríum-citrát vagy kálium-acetát, ammóninm-chrát, -acetát, -szulfát vagy -klorid.

Á pH értéket sósav vagy nátrium-hídroxid-oldal adagolásával állítjuk be.

Az eluálás Ízokrafikusan, azaz a pufferanyag koncentrációjának és a szerves oldószer részarányának állandó értéken tartása mellett, vagy - előnyösen - lineáris gradienssel, az oldószer részarányának folyamatos emelésével történhet.

A nyomásálló szerves polimer kromatográfiás anyag átlagos szemcsemérete előnyösen 5 juh és 300 jxm közötti, különösen előnyösen 1(1 pm és 50 pm közötti. Minél kisebb a részecskeméret, annál élesebb és jobb az elválasztás, A kisebb részecskék nyomásállósága azonban kisebb.

Az inzulin egy viszonylag kis pepiid (mőltömege kb, 6008), ezért 10 nm-es pórusokba könnyen bediífusdál (nincs térbeli gátlás). Kis pórnsátmérövel rendelkező anyagok alkalmasabbak, mert a fajlagos felületük és ezzel együtt adszorpciós kapacitásuk nagyobb A nyomásálló szerves polimer kromatográfiás anyag átlagos pórusmérete előnyösen 5-5OÖ nm, különösen előnyösen 10-50 nm.

A találmány szerinti eljárásban nyomásálló szerves polimer kromatográfiás anyagként a pofiszfirol-diviniibenzolböl vagy polimetakriiátból állók különösen alkalmasak. Az 1. táblázatban példákat adunk olyan nyomásálló szerves polimer kromatográfiás anyagokra, amelyek a kereskedelmi forgalomban beszerezhetők és a találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazhatók.

1. táblázat: a kereskedelmi forgalomban beszerezhető kromatográfiás anyagok

Gyártó	Kerekedelmí nét	Anyag	Legkisebb szentesemére! (pm)	Pórusátmerő (nm)
TosoHaas	Ambercferojne^'	PMA	35	100
Pharmacia	Source®·'	StDVB	15	100
Perseptive	Poros^	StDVB	10	200
Mitsubishi	CHP2ÖP*	StDVB	35	100
Biosepra	RPC PoIyBií?”	StDVB	Í0	30
Macherey & Nagel	Nucleogel'^	StDVB	20	10
Polymer laboratorie	PLRP®	StDVB	10-15	10

PMA - poHmetakriiát StDVB ^::: szrirol-divinilbenzol

A találmány szerinti eljárás alkalmazható az elemző, a félpreparatív és különösen a preparatív kromatográfia területén. A preparatív kromatográfia kifejezésen tiszta termékek ipari mértékben történő előállítását értjük.

Az inzulin-készítményektől követeit tisztaság elérésére a fordított fázisú kromatográfiás eljárás (például EP 0 547 544 A2 = US 5,621,073 vagy EP 0 474 213 Al - US 5,245,008 szerint) előtt legalább még egy további fordított fázisú vagy kationeserekromatográfiás lépést és adott esetben egy kristályosítási lépést kell végezni. A találmány szerinti eljárásban ugyanezt az eredményt a poiímerhordozőn végzett egylépéses kromatográfiás elválasztással érjük el. Ezért a találmány szerinti eljárás az inznlingyártás összhozamát lényegesen javítja, tekintettel arra., hogy több eljárási lépés egy lépessé való Összevonása révén kevesebb a veszteség.

A találmány szennti eljárás a leírás elején adott definíció szerinti összes inzulin kromatográfiás tisztítására alkalmas, azaz természetes forrásokból származó vagy rekombináns (azaz genetikailag módosított mikroorganizmusok által exprimált), állati vagy humán eredetű inzulinokat (például sertés-, szarvasmarha- vagy humán inzulint), proíoznlinokat {például inzulin elöíermékeket, preínzuiint) és inzulin-származékokat az utóbbiakon természetesen előforduló inzulinok, azaz humán inzulin vagy állati eredetű inzulin származékait érijük, amelyek legalább egy természetesen előforduló aminosavcsoport kiváltásával és/vagy legalább egy természetes aminosavcsoport és/vagv szerves csoport hozzáadásával a megfelelő, máskülönben azonos természetes inzulintól különbözik.

Az ilyen inzulinok példáiként az alábbiakat soroljuk fel: humáninzulin·, .szarvasmarhainzufb, sertésinznlin, az EP 9 368 187 (US 5,656,722) szerinti inzulinok, például Gly(A2l),Atg(B31),Árg(B32)~bumáninznlin, az EP O 821 006 (ZA 97(6645) szerinti inzulinok vagy az EP 0 547 544 Al (US 5,621,073), EP 0 474 213 Al (US 5,245,008), EP 0 600 372 Ál (US· 5,473 049) vagy EP 0 668 292 (US 5,663,291) szerinti inzulinok, (Az A és 8 betű az adott mzulm-aminosavláncot, a szám annak az ammosavcsoportoak a pozícióját jelöli, amely a zárójel előtt megadott anilnosavosoporttal lett lecserélve.

Példák

1. példa: a ρΗ-érték variálása

Az 1, példában 10 mm átmérőjű, 120 mm hosszúságú félpreparatív oszloppal kísérleteztünk, amely PLRP-S 10-15 pm löOA (Polymer Laboratories) anyaggal volt megtöltve- A feladat, előtisztított, 95 terület-% tisztaságú inzulin 98,5 tertfiet-%-nál nagyobb tisztaságra való tisztítása volt.

Az adagolt mennyiségei úgy állítottuk be, hogy a polimer kromatográfiás anyagra őg/1 [Agytérfogat] inzulin jutott. Az adagoláshoz használt puffer és a mozgó fázis vízpropanol-elegv volt, amely 0,05 M ammónlum-acetátot és 0,1 M glíeint tartalmazott. A pH-érték beállítása sósavval, illetve nátrium-Hdroxid-oldattal történt. Üres oszlopban a sebesség 150 enriöra volt. Három pH-érteket Állítottunk be: 3,5 pH - 6,8 pH - 9 pH. Az eluátumot frakciókban gyüjíettük.

A 2. táblázat az eredményeket mutatja. Csak 9 pH mellett volt a tisztaság 98 terűlet-%~nál nagyobb, azaz a specifikáció teljesült. Egyértelműen kiviláglik, hogy az

inzulin polimer kromatográfiás anyagon végzett tisztítása csak bázikus közegben rendelkezik kellő hatékonysággal

2, táblázat; Inzulin tisztasága és koncentrációja különböző pH-értékek mellett a FLRP

S 10-15 100 polimer kromatográfiás anyaggal

	pH 3,5	pH 6,8	pH 9
Frakció	Tisztaság [íeE-%]	Konc. img/mlj	Tisztaság	Konc. : [mg/mi]	Tisztaság jíel-%]	Konc. jmg/ml]
1			95,22	0,236	92,74	0,565
2	96,74	0,449	94,68	0.196	96,70	1,310
3	96.69	0,690	94,84	0,274	98,59	1.362
4	97,43	1,020	95,38	0,454	99,54	2,020
5	97,39	1,240	96,84	1,120	98,99	2,230
6	97,14	1,330	97,95	2,236	99,24	1,730
7	96,07	1,250	97,82	3,140	98,80	1,340
8	94,94	1,120	97,64	3,120	98,46	1,200
9	93,30	0,974 . .............	97,12	2,080	97,28	0,960

2. példa: Nyomásálloság, az oszlop megtöltése mm átmérőjű kromatográfiás oszlopot (Frccferom®' LCSO) a DACüeckmkával (Dlrect Axiai Compression) megtöltöttünk. A kmmatográíiás anyagot (sz álló fázist)

1ÖÖ % metanollal vittük az oszlopba. Különböző· átfolyási sebesség mellett mértük 1 í%-n-propanol-elegy nyomásesését. A kromatográfiás kolonna bélygző-nyomását 5x10'· Fa és 8öxlÖ⁵ Pa között változtattuk.

Az alábbi kromatográfiás anyagokat vizsgáltuk:

PLRP-S 10-15 I ÖÖ''^V (Polymcr Laboratories)

Source® 15 RPC { Amersham Pharmacia Biotech)

KromasiF 13-120 (Akzo Nobel)

Az anyagok részecskemérete (gömb alakú részecskék) mintegy azonos. PERF* és Source® polimerek, Kromasií® nagy értéké RP-kovssavgél

3. táblázat; propanol-viz-eiegy nyomásesése· (10^s PWcm]

	50 cm/óra	100 cm/óra	150 cm/óra
5x19' Pa bélyegzőnyomás ; PLR.P * ~ Source*	0,31 0,40	0,62 0,80	1,00 1,50
2.0x10* Pa bélyegzonyomás PLRP* Source*	0,32 0,85	0,72 1,85	1,04 3,14
40x10* Pa bélyegző-nyomás PLRP*' Stmree*	0.50 3,33	1,08 6,33	1.67 9,33
89x10* Pa bélyegzőnyotnás Kromasíl*	0,5	l.o	1,6

Ha a fajlagos nyomásveszteség ICfPa/cm, ez 30 cm-es töltetben 30x10* Pa ayo~ másveszieségeí jelest; ez a technikai krrnnatogmfia területén szokásos érték.

3. péld a

Humán inzulin tisztítása preparativ mértékben.

A DAC-elv szerint mozgó bélyegzővel töltött ipari oszloppal Összesen három kísérletet végeztünk .Froebrom*LC5ö -oszloppal, az oszlop mindegyik esetben 50 mm átmérőjű, 110*120 mm tőitethosszúságú volt, 95 terület% tisztaságú humán inzulint 98,5 teröiet%-nál nagyobb tisztaságra kellett tisztítani. Három .kromatográfiás hordozót alkalmaztunk;

PLRP-S 10-15 100* (Pol vmier Laboratories)

Sonree* 15 RFC (Amersbatn Pharmacia Rlotech)

Kromasil*' €4 13-120 (Akzo Nobel)

Ahogy azt a 2. példában már megjegyeztük, PLRP és Soarce* polimer anyagokmíg Kromasíl®' nagyértékű. RP-kovasavgél hordozó. Az. adagoló puffét és a. mozgó fázis az 1. példában alkahmizoítnak felelt meg. Az inzulin mennyiségét g/1 ágytérfogatban adjak meg. Hozamként, az eluáturnnak azt a részét tüóníettük fel, amelynek tisztasága meghaladta a 98,5 terüiet%-ot.

4. táblázat; humáninzulin preparativ tisztításának hozama

	PLRP-S 10-15 100*	Source* 15RPC	Kromasií *C4 13-120
Mennyiség	6 g/1	őgzl	6 g/i
pH	9	9	3,5
Bélyegzónyomá	40)¾	25x10* Pa	SOxlíFPa
Hozam	60 %	73 %	68%

«-·**' fr ***

A 4. táblázatban az elért hozamot tüntettük fel. A 69 % és 70 % közötti értékek 12 em-es ágyhossz esetén meglepően jók. A technika állása (tisztítás kmvasavhordozöm itt Kromasif^) és a polimerhordozón végzett tisztítás között a lényeges különbség, a pHértékben van: esak 9 körüli pH esetén várható ilyen jő hozam.

Bólusz-titzulin tisztítása preparatív mértékben

Ebben a példában bóiosz-inztdiat (fást acting insulln) kellett tisztítani. Emellett a példa azt matatja, hogy a kromatográfiás lépés kiindulási anyagaként rosszabb minőségű inzulin is megfelel. A technika állása szerbi az inzulin végső tisztítását rendszerint két kromatográf ás lépésben végzik; ha a végső tisztítás oszlopaira rosszabb, azaz erősen szennyezett terméket, engednek, a követelt tisztaság és a nagy hozam már nem érhető el.

Meglepő módon most azt találtuk, hogy a vizsgált polimer anyaggal a követelt tisztaságot egver/e/r^gy· kromatográf ás lépésben érhető el. Ez a kis (10-15 pm) részecskeméretnek és a kiváló adszotpciós tulajdonságoknak köszönhető.

Négy kísérletet végeztünk az alábbi tisztaságú kiindulási -anyagokkal:

íerület% tisztaság 89 lew.let% tisztaság tertfeíH tisztaság 93 teröíet% tisztaság

Az 5. táblázatban megadjuk az elért hozamokat (azaz a kiindulási inzulinnak azt a részét, amely a 98,5 ierűleí%-ot meghaladó tisztasággal eluáiódott. Ha a kiindulási inzulin tisztasága csak 75 területid, a 98,5 terület%-nál nagyobb tisztaság nem érhető el, hanem csak 98,0 terttietH körüli.

Ha a kiindulási inzulin tisztasága azonban 85 terüleHe-nál nagyobb, a 98,5 terület%-ot meghaladó megkövetelt tisztaság biztonsággal érhető el, 60 % és 8-0 % közötti hozam mellett.

5. táblázat; különböző minőségű bólusz-mzulin tisztítása

Hordozó	Kiindulási inzulin tisztasága terület%-ban	Hozam (98,5 terüíet%-nál tís; tább végtermék részaránya
PLRP-S 10-15 100	75	0
PLRP-S 19-15 100 *	85	64
: PLRP-S 10-15 190 -	89	73
PLRP-S 19-15 190	93	73

**** *

«. * * **« * * **, wí* *

Az. 5. táblázatból jól látható, hogy a kromatográfiás tisztítás hozama mennyire, fiigg a kiindulási anyag tisztaságától. A kísérletek egyértelműen azt mutatják, hogy az egyetlenegy kromatográfiás lépésben végzett tisztítás, megbízhatóén lehetséges.

Claims (19)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás inzulinok kromatográfiás tisztítására, azzal jellemezve, hogy álló fázisként fordított fázisú kromatograrMáshan használatos, nyomásálló szerves polimer kromatográfiás anyagot alkalmazunk, az eluálő mozgó fázis legalább egy, vízzel elegyedő szerves oldószert és legalább egy puOeranyagot tartalmaz, a pH-érték 7 és Π közötti, és az álló fázis olyan szemcsékből. áll, amelyek nyomásáilők 70x10 Pa nyomásértékig.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH-érték 9 és· 10 közötti.
3. 3. Az. 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vízzel elegyedő szerves oldószerként .1 -4 szénatomos alkoholt alkalmazunk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, ásza/ jellemezve, hogy alkoholként 1nropanolt vagy 2-propanoit alkalmazunk.
5. 5. A 3, Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkoholként etanolt alkalmazunk.
6. 6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkoholként metanolt alkalmazunk.
7. 7. A 2. Igénypont szerinti eljárás, cezzal jellemezve, hogy vízzel elegyedő szerves oldószerként ketont alkalmazunk,.
8. 8. A 2. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vízzel elegyedő szerves oldószerként metii-acélától alkalmazunk.
9. 9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vízzel elegyedő szerves oldószerként aceto-nitrilt alkalmazunk.
10. 10. Az. 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mozgó fázisban a vízzel elegyedő szerves oldószer részaránya 1 -90 térfogat%.
11. 11. A lö. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mozgó fázisban a vízzel elegyedő szerves oldószer részaránya 19-59 térfogat%.
12. 12. Az 1-11. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eluálás Izokradkusan történik.
13. 13. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eluálás a vízzel elegyedő szerves oldószer növekvő koncentrációjú gradiensével történik.
14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, mrm/ye/hnnerve, hogy a nyomásálló szerves polimer kromatográfiás anyag átlagos szemcsemérete 5-300 um.
15. 15. A 14, igénypont szerinti -eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyomásállő szerves polimer kromatográfi ás anyag átlagos szemcsemérete 10-50 μτη.
16. 16. Az 1-15. igénypontok bsnnelylke szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyoroásállő szerves- polimer kromatográfiás anyag átlagos pórusmérete 5-500 nm.
17. 17. A ló. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átlagos pórusméret 10-50 nm.
18. 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy a nyomásállő szerves polimer kromatográfiás anyag pohmetakriláthól áll.
19. 19. Az I-Π, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyomásálló -szerves polimer kromatográfiás anyag polisztírol-divinilfeenzolból áll,

    A meghatalmazott.