JPH0788400B2 - タンパク精製方法の改良 - Google Patents

タンパク精製方法の改良

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JPH0788400B2
JPH0788400B2 JP60263595A JP26359585A JPH0788400B2 JP H0788400 B2 JPH0788400 B2 JP H0788400B2 JP 60263595 A JP60263595 A JP 60263595A JP 26359585 A JP26359585 A JP 26359585A JP H0788400 B2 JPH0788400 B2 JP H0788400B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は固定化金属イオンとキレート結合するペプタイ
ドに、直接また間接的に共有結合した生物学的に活性な
ポリペプタイドまたはタンパクから成る化合物、および
該化合物を、他の不純物をも含有する混合物から分離す
る方法に関する。
〔技術的背景と先行技術〕
1975年に、ポレイス（Porath）は、タンパクを分別する
ため、固定化金属イオン・アフイニテイクロマトグラフ
イー（IMAC）を導入した〔ポレイス、カールソン、オル
ソンおよびベルフレージ（J.Porath,J.Carlsson,I.Olss
on,and G.Belfrage）、ネイチヤー（Nature）、ロンド
ン（London）、258、598−599頁（1975）〕。ポレイス
のIMACは、イミノジ酢酸（IDA）で樹脂を修飾するこ
と、およびこのIDAで修飾した樹脂に金属イオンをキレ
ート結合させること、から成つている。タンパクは、空
の配位部位を通じて金属イオンと結合し、カラム上に固
定される。その時以来、研究者たちは、樹脂に金属イオ
ンをキレート結合させるために、IDA以外の配位子を、
使用して来た。血清タンパクの研究において、IMADはき
わめて特異的かつ選択的な分離技術であることが示され
ている〔ポレイスおよびオーリン（J.Porath and B.oli
n）、バイオケミストリー（Biochemistry）、22、1621
−1630頁（1983）〕。
金属タンパク質の活性部位にヒスチジン、システイン、
メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンお
よびチロシンのような、ある種のアミノ酸残基が存在す
ることが、このようなアポタンパク質へ遊離の金属イオ
ンが実際に結合する原因の１つになつていると考えられ
ている。自由（遊離）金属イオンのタンパクが結合する
実際の機構は、よくわかつておらず、多くの因子に起因
しており、特定のタンパクの立体配座という因子の寄与
は小さいものではない。しかし金属イオンが固定化され
た時、少なくとも３つの付加的な限定因子が働く。すな
わち、金属上の利用可能な配位部位数の減少、タンパク
上の結合部位への固定化金属の接近の制限、および樹脂
の性質による、固定化金属イオンへのタンパクの接近の
限定である。このように、どのタンパクが固定化金属イ
オンに対して親和性を示し、どれが示さないかを言い表
わすことは、極めて困難である。
しかし、一度結合が起これば、タンパクと結合してい
る、金属イオン−結合配位子を水素化して、該タンパク
を遊離させることができる。周囲の緩衝溶媒のpHを低く
することにより、解離を行なうが、これが結合したタン
パクを溶出させる最も一般的な方法である。
再現性があり、かつ予測可能な、広範囲物質の精製のた
めに、この固定化金属イオン・アフイニテイクロマトグ
ラフイーの概念を応用し得ることが明らかにされてお
り、本発明の基本を成すのはこの発見である。以上のよ
うに、本発明は、（１）IMACによつて、混合物から容易
に精製し得る様、特異的に仕立てられた化合物、および
（２）このような精製のための方法を提供する。
〔発明の目的および構成〕
このように、本発明は、特に、固定化金属イオンとキレ
ート結合するペプタイドに、直接または間接的に共有結
合した生物学的に活性なポリペプタイドまたはタンパク
から成る化合物種に関する。
本発明の別の具体例は、生物学的に活性なポリペプタイ
ドまたはタンパクを、その先駆体（前駆体）の形で該先
駆体と不純物とを含有する混合物から分離する方法であ
り、これには、該先駆体を固定化金属イオンを浮遊する
樹脂と接触させ（ここに該先駆体が、固定化金属イオン
とキレート結合するペプタイドに、直接または間接的に
共有結合した生物学的に活性なポリペプタイドまたはタ
ンパクで構成されている）、該先駆体を該樹脂に結合さ
せ、そして、該前駆体を該樹脂から選択的に溶出させる
こと、が含まれている。
組み換えDNA方法論の出現、および潜在的な、無限量の
異なる構造のポリペプタイドまたはタンパクの利用可能
性は、得られた合成生成物の処理および精製のための手
段を開発する必要性を生じさせた。本発明の方法は、こ
の必要性に応答するものであり、タンパクおよびポリペ
プタイド、特に、組み換えDNA技術によつて供給される
それらについての再現性ある精製に焦点をあてている。
以上のように本発明は、不純物から、生物学的に活性な
ポリペプタイドおよび／またはタンパクを分離する方法
を含んでいる。“生物学的に活性なポリペプタイドおよ
びタンパク”という語句は、それ自身が生物学的に活性
であるポリペプタイドおよびタンパク、まは生物学的に
活性なポリペプタイドおよびタンパクを生産するのに有
用なポリペプタイドおよびタンパクを表わす。
ここで言うポリペプタイドおよびタンパクは天然物また
は合成物のいずれでも良く、もし合成物であるなら、古
典的な溶液相、固相、または組み換えDNA方法学のいず
れによつて生産されていても良い。期待されるポリペプ
タイドおよびタンパクは、好ましくは組み換えDNA方法
学から生成されるようなものである。
本発明の化合物は２成分で構成されている。すなわち、
前記の生物学的に活性なポリペプタイドまたはタンパ
ク、および共有結合によつてそれらに直接または間接的
に結合する固定化金属イオンとキレート結合するペプタ
イドである。
“固定化金属イオンとキレート結合するペプタイド”と
は、コバルト、ニツケル、および銅の中から選択した金
属の、固定化された２価金属イオンとキレート結合する
アミノ酸配列を意味する。
前記の金属イオンの中で、ニツケルおよび銅からなる群
から選択した金属イオンが、本発明のキレート化に好ま
しい。
本発明化合物の１要素である、金属をキレート結合する
ペプタイドの本質的な性質は、（１）それが固定金属イ
オンとキレート結合すること、および（２）そのキレー
ト化能力が、生物学的に活性なポリペプタイドまたはタ
ンパクに結合した時に、保持されていることである。イ
オンおよびペプタイドの両方が外的な抑制から解放され
ている条件下では、多数のペプタイドが金属イオンとキ
レート結合する。しかし、金属イオンが固定化されてい
る時には、そのキレート化能力は極めて制限され、さら
に、キレート化活性を示すペプタイドが他の物質、すな
わち生物学的に活性なポリペプタイドまたはタンパクを
も結合している時には、キレート化能力が減少する。本
発明の構成に使用するキレート結合するペプタイドは、
前記の両性質を備えている。
本発明で有用かつ好適な固定化金属イオンとキレート結
合するペプタイドは、ヒスチジンおよびシステインから
選択した少なくとも１つのアミノ酸を含有する。最も好
適な固定化金属イオンとキレート結合するペプタイド
は、ヒスチジンを含有する。
固定化金属イオンとキレート結合するペプタイドの最適
長さは、固定化金属イオンの非占有配位部位の数に多分
に依存している。たとえば、金属イオンはイミノジ酢酸
を通して樹脂に結合するが、このイミノジ酢酸は３配座
である。このように、特定の金属に応じ、イミノジ酢酸
を通じて樹脂に結合している金属イオン上に３つの空の
配位部位が得られる。従つて、選択したジペプタイド
は、少なくとも３つの供与潜在性のある原子を提供し
て、効果の高い３配座配位子として働く。従つて、通常
考えられるキレート結合するペプタイドは、少くとも２
から約５までのアミノ酸を含有する。
特定のヒスチジンを含有する固定化金属イオンとキレー
ト結合するペプタイドの例は、式： His−Ｘ 〔式中Ｘは−Gly−His、−Try、−Gly、−Trp、−Val、
−Leu、−Ser、−Lys、−Phe、−Met、−Ala、−Glu、
−Ile、−Thr、−Asp、−Asn、−Gln、−Arg、−Cys、
および−Proを表わす〕 で示される。
前記の中で、His−Trp、His−Tyr、His−Gly−His、お
よびHis−Pheで示されるサブクラスが好ましく、さらに
His−Trp、His−TyrおよびHis−Gly−Hisで示されるサ
ブクラスが最も好ましい。
別種のヒスチジン含有の固定化金属イオンとキレート結
合するペプタイドは、式： Ｙ−His 〔式中Ｙは、好ましくは−Gly、−、Ala、または−Tyr
を表わす〕 で示される。
さらに、別種のヒスチジン含有の固定金属イオンとキレ
ート結合するペプタイドは、式： Met−His−Ｘ 〔式中Ｘは前記に同じ〕 で示される。
いずれかの特定の状況下でどの固定化金属イオンとキレ
ート結合するペプタイドを使用するかについては、もち
ろん多数の因子に依存し、この因子の１つは、金属イオ
ンの内容である。たとえば、もし金属イオンがNi（II）
であれば、次のようなヒスチジンを含有する固定化金属
イオンとキレート結合するペプタイドが好ましい。すな
わち、His−Gly−His、His−Tyr、His−Trp、His−Gl
y、His−Val、His−Leu、His−Ser、His−Lys、His−Me
t、Gly−His、およびAla−Hisである。もし金属イオン
がCu（II）であるなら、次のようなヒスチジン含有の固
定化金属イオンとキレート結合するペプタイドが好まし
い。すなわち、His−Gly、His−Gly−His、His−Ala、H
is−Val、His−Leu、His−Ser、His−Glu、His−Lys、H
is−Phe、His−Tyr、His−TrpおよびHis−Metである。
本発明の化合物は組み換えDNA法によつて調製すること
ができ、かつ調製するのが好ましい。これらを調製する
ため、生物学的に活性なポリペプタイドまたはタンパ
ク、および直接または間接的に結合したキレート結合す
るペプタイドの両方を含有する、目的のポリペプタイド
をコードするヌクレオチド配列を、その様な合成におけ
る常法に従つて調製する。当業界で周知のように、一般
的に、この方法は、目的の暗号配列のフラグメントおよ
びその相補配列の両方をコードしているオリゴヌクレオ
チドを調製することを含む。暗号配列の１つのフラグメ
ントに、相補足配列の２つのフラグメントが重なるよう
に、またその逆になる様、オリゴヌクレオチドを設計す
る。最終的に目的の遺伝子配列が生成されるよう、オリ
ゴヌクレオチドを、対にし、結合させる。
この配列を、該配列によつてコードされたペプタイド生
成物を発現する様なクローニングベクター中の場所に挿
入する。適当なクローニングベクターは、少なくとも遺
伝子の発現の制御（コントロール）配列の一部分を含有
する。
典型的な発現を制御する配列は、５つの要素で表わすこ
とができる。遺伝子中で現われる順序で言うと、この要
素は次のようである。すなわち、（ａ）プロモーター領
域、（ｂ）５′非翻訳領域、（ｃ）タンパクをコードし
ている配列、（ｄ）３′非翻訳領域、および（ｅ）転写
終止部位である。
遺伝子系でのこのような各要素の機能はよくわかつてい
る。プロモーター領域は、メツセンジヤーRNA（mRNA）
生産（転写）の開始に関与する。プロモーターは、
（１）外部制御のない状態（構成性）、（２）リプレツ
サー、すなわちそれが存在する時遺伝子の機能を制御す
る物質の制御下にあるか、または（３）インデユーサ
ー、すなわち遺伝子機能を誘起するのに必要な物質、の
制御下にあつてよい。たとえばリポタンパク質（lpp）
遺伝子は外部制御がなく、このため“構成性”と称され
る。
“転写開始部位”はプロモーター、またはその近くに位
置し、DNAの転写を開始するためにRNAポリメラーゼが結
合する部分である。一度転写が開始されると、mRNAが生
産される。生じるmRNAの構造は、前記の遺伝子要素
（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のDNA配列によつて決ま
る。
生じるmRNAはタンパク生成物への翻訳が可能な配列を有
する。翻訳可能な配列は、５′非翻訳領域から下流かつ
３′非翻訳領域から上流の部分に位置している。リボソ
ーム結合部位を示す、mRNAの５′非翻訳領域中に配列に
リボソームが結合することにより翻訳が仲介され、生成
物遺伝子配列の最初のコドンとして現われるアミノ酸メ
チオニン（Met）をコードしている翻訳開始コドン（AU
G）から翻訳が始まる。翻訳領域の末端に現われる、１
またはそれ以上の終止コドンで翻訳が終わる。
組み換えDNA技術を使用して、発現制御配列、すなわち
外因性のタンパクの生産を伴なう構造遺伝子に効果的に
結合したとき、これらの構造遺伝子の発現を制御および
調整するヌクレオチド配列を、ベクターに挿入すること
によつて、選択した外来性（外因性）タンパクの生産に
対して有用なクローニングベクターを調製することが可
能である。
前記の中で、“発現制御配列”という語句は、前記要素
の（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）を含有する。
より大きな“雑種”分子の一部として、あるいは直接的
に、本発明の化合物を発現させるために、組み換えDNA
法を使用することができる。直接発現様式では、発現産
物が、実質的な開始コドンの存在によりメチオニン（Me
t）残基が先行する目的生成物によつて、完全に構成さ
れるように、クローニングベクターを設計する。不必要
なMet残基は、この生成物を、シアノゲンブロマイドま
たはフエニルイソチオシアネートで、次いでトリフルオ
ロ酢酸のような強い無水酸で処理することによつて除去
することができる。
雑種分子発現様式では、発現する生成物が雑種タンパク
を含むように、クローニングベクターの発現制御配列
に、目的の生成物をコードしているDNA配列を挿入す
る。“雑種タンパク”とは、一般的には発現制御配列に
よつて生成される天然の（内生）タンパクの全部または
一部（たとえば、リポタンパク遺伝子におけるリポタン
パク）である外来性タンパクに、目的のタンパクすなわ
ち本発明の化合物が結合したタンパクから成る、組み換
えDNA生産物を指す。
組み換えDNA法によつて生成される適宜に設計した雑種
タンパクは、内生タンパク部分と目的の生成物の結合点
に切断部位を有する。この切断部位は、雑種タンパク生
成物を化学処理または酵素処理することによつて、成熟
生成物の生成を可能にする。有用性の高い選択的に切断
部位は、そのＣ−末端で化学的または酵素的に切断する
ことが可能なアミノ酸またはアミノ酸の配列をコードし
ているDNA配列を含有する。
タンパクの切断に有用な化学試薬の例は、シアノゲンブ
ロマイド、２−（２−ニトロフエニルスルフエニル）−
３−ブロモ−３′−メチルインドリニウム〔BNPS−スカ
トール（skatole）〕、ハイドロオキシルアミン等であ
る。シアノゲンブロマイドは、メチオニン残基のＣ−末
端でタンパクを切断する。従つて、選択的切断部位はメ
チオニン残基それ自身である。
ハイドロオキシルアミンは、−Asn−Ｚ−部分のＣ−末
端で切断する。ここでＺはGly、LeuまたはAlaである。
BNPS−スカトールは、トリプトフアン残基のＣ−末端で
切断する。
切断に有用な酵素試薬の例は、トリプシン、パパイン、
ペプシン、プラスミン、トロンビン、エンテロキナーゼ
等である。それぞれの試薬は、特定のアミノ酸配列認識
部分で切断をする。たとえば、エンテロキナーゼは、−
（Asp）ｎ−Lys−アミノ酸配列を認識する。ここでｎは
２〜４の整数である。
最も好ましい選択的切断部位は、もし本発明の化合物が
メチオニンを欠いていれば特に、メチオニン残基であ
る。目的の生成物のＮ−末端に結合しているこの残基
は、シアノゲンブロマイドを使用する既知の方法によ
り、目的の生成物、すなわち本発明の化合物を生成する
ように、容易に切断される。
有用なクローニングベクターを構築するにあたつては、
いくつかの要素が必要になる。この必要要素の中の２つ
については、すべての有用なクローニングベクターに共
通する。第１に、ベクターは、機能的な複製起源を含有
するDNAセグメント（レプリコン）を有していなければ
ならない。プラスミドおよびフアージDNAは、宿主細胞
中での複製を円滑に行わせるレプリコンを本来含有して
いる。
第２に、ベクターは、非形質転換細胞から形質転換細胞
を選別するための有用な性質を、形質転換が可能な宿主
細胞に付与するためのDNAセグメントを有していなけれ
ばならない。広範囲な特性の中のいずれかを、この選別
の目的に使用することができる。最も一般的に使用され
る特性の１つは、抗生物質耐性、たとえば、テトラサイ
クリン耐性またはアンピシリン耐性である。
前記の２要素は、一般的に、容易に利用が可能、かつ既
知のクローニングベクター中に存在する。適当なクロー
ニングベクターの例は、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1を
含むE.coli（大腸菌）のプラスミド等の細菌性プラスミ
ド、RP4を含む広範囲宿主プラスミド、およびラムダの
ようなフアージDNA類等である。全部ではないが、前記
の既知ベクターのほとんどは、前記の性質を有してい
る。
第３の要素は発現制御配列である。たとえば、リポタン
パク遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、トリプトフ
アン遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子およびフアージラ
ムダ等に含まれる、広範囲な制御配列のいずれかを使用
することができる。
選択した発現制御配列を挿入して適当なクローニングベ
クターを生成させるために、常法を使用する。その部位
に特異的な制限エンドヌクレアーゼを使用して切断する
ことが可能な部位がクローニングベクター内に多数存在
する。このような部位のいずれかを、発現制御配列の挿
入に対して選択することができる。例を挙げると、詳し
く研究され、報告されているプラスミドpBR322では、い
くつかの適当な制限部位が存在し、いずれも挿入部位と
して使い得る。Pst I部位は、β−ラクタマーゼに対す
る遺伝子の中に位置する。特異的な暗号領域以外の、他
の部位にはEcoRIおよびPvu IIがある。このような部位
およびその他の部位については、当業界でよく知られて
いる。
これらの部位のいずれか、または他を利用して、発現制
御配列またはその本質的な部分を、ベクターの製造中に
おいて、容易に挿入することができる。
４番目の要素は、もちろん目的の生成物をコードしてい
るDNA配列である。前記したように、このDNA配列は、合
成的に、たとえば既知のホスホトリエステル法または他
のよく知られた方法を使用して組立てることができる。
適当なクローニングベクターを、広範囲の宿主生物内で
利用することができる。たとえば、大腸菌（Escherichi
a coli）、セラチア（Serratia）、シユードモナス（Ps
eudomonas）等のグラム陰性原核生物、バチルス（Bacil
lus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）等のグラ
ム陽性原核生物、およびサツカロマイセス（Saccharomy
ces）等の真核生物である。好適には、宿主生物はグラ
ム陰性原核生物である。グラム陰性原核生物の中でも、
E.coliが特に好ましい。たとえばRV308のようなE.coli
K−12株である。
よく知られた方法を使用して、適宜に調製したクローニ
ングベクターを用いて適当な宿主生物を形質転換し、こ
の生物中で増幅させ、そして、標準的な発酵条件下でタ
ンパク生成物を発現させる。
もし発現生成物が、前記のような雑種タンパクである場
合、始めに外因性（内生）の物質を切り離す試薬で生成
物を処理し、本発明の化合物を放出させることができ
る。しかし、もし生成物が直接発現によつて生じる場
合、その生成物が発現の開始を誘導するメチオニンを含
有しているという点においてのみ、該生成物は雑種タン
パクの切断によつて得られる物質と異なる。付加してい
るメチオニンは、通常、生成物を設定した目的に使用す
ること、すなわち固定化金属イオンアフイニテイクロマ
トグラフイーによつて不純物から分離すること、を阻害
しない。
前記のように、本発明の化合物は、生物学的に活性なポ
リペプタイドまたはタンパクと共有結合している、キレ
ート化ペプタイドを含有する。結合直接または間接的で
ある。もし間接的であるなら、この結合には、キレート
化ペプタイドを容易に除去し、目的の最終生成物を生成
するように、適宜に設計した選択的な切断部位を含有す
る。前記のアミノ酸残基または配列のいずれかは、他と
同様、選択的な切断部位として作用するに適当でであ
る。
キレート結合するペプタイドは小さい、すなわちジ、ト
リ、テトラまたはペンタペプタイドであるので、それら
は生物学的に活性なポリペプタイドまたはタンパクに直
結結合することができる。多くの場合、キレート結合す
るペプタイドは生物学的に活性なポリペプタイドまたは
タンパクに結合したままであり、この結果生じた分子は
非結合性の、生物学的に活性なポリペプタイドまたはタ
ンパクの活性のすべてまたはほとんどを保持する。それ
でも、もしキレート結合するペプタイドが生物学的に活
性なポリペプタイドまたはタンパクのアミノ末端に、直
接結合している時には、キレート係合するペプタイド
を、Ｎ−末端アミノ酸を１つづつ、連続的に除去するエ
ドマン（Edman）分解によつて除去することができる。
必要とするエドマン分解の回数は、もちろんキレート結
合するペプタイドの長さに依存する。
前記で暗に述べたように、キレート結合するペプタイド
は、生物学的に活性なポリペプタイドまたはタンパクの
どちらかの末端に、直接または間接的に結合していてよ
い。しかし、キレート結合するペプタイドは、生物学的
に活性なポリペプタイドまたはタンパクのアミノ末端に
位置することが好ましい。
本発明において遊離に利用することができる、生物学的
に活性なポリペプタイドまたはタンパクの典型例は、イ
ンシユリンＡ鎖、インシユリンＢ鎖、プロインシユリ
ン、成長ホルモン、インシユリン様成長因子、グルカゴ
ン、ソマトスタチンおよび成長ホルモン遊離因子等であ
る。
固定化金属イオンアフイニテイクロマトグラフイー（IM
AC）のカラムを作る際に有用な樹脂は、市販品を利用す
ることができる。イミノジ酢酸（IDA）誘導の樹脂の典
型的は、キレート化セフアロース6B〔フアーマシア（Ph
armacia）〕、固定化イミノジ酢酸ＩおよびII〔ピアー
ス（Pierce）〕およびチエレツクス（Chelex）100〔バ
イオーラツド（Bio−Rad）〕である。さらに、ポレイス
は、セフアロース6B上にトリス（カルボキシメチル）エ
チレンジアミンを固定化し〔ポレイスおよびオーリン
〔J.Porath and B.Olin〕、バイオケミストリー（Bioch
emistry）、22、1621−1630頁（1983）〕、それを血清
タンパク分画のために使用した。他の報告によれば、ト
リスアクリルGF2000およびシリカをIDA、TEDまたはアス
パラギン酸で誘導することができ、その結果生じた物質
をIMAC本体を作るのに使用可能であることが示唆されて
いる〔スチール他（Small et al.）アフイニテイ・クロ
マトグラフイー・アンド・バイオロジカル・リコグニシ
ヨン（Affinity Chromatography）and Biological Reco
gnition）、アカデミツク・プレス・インコーポレーシ
ヨン（Academic Press,Inc.）、267−268頁（1983）；
ビジヤヤラクシユミ（Vijayalakshmi）、アフイニテイ
・クロマトグラフイー、アンド・バイオロジカル・リコ
グニシヨン（Affinity Chromatography and Biological
Recognition）、アカデミツク・プレス・インコーポレ
ーシヨン（Academic Press,Inc.）、269−273頁、（198
3）；およびモロウクス他（Moroux et al.）、アフイニ
テイ・クロマトグラフイー・アンド・バイオロジカル・
リコグリニシヨン（Affinity Chromatography and Biol
ogical Recognition）、アカデミツク・プレス・インコ
ーポレーシヨン（Academic Press,Inc.）275−278頁（1
983）〕。
本発明方法の要点は、選択的吸着に続いてIMACカラムか
ら生物学的に活性なポリペプタイドまたはタンパクの先
駆体を溶出させることである。一般的には、２つの既知
溶出法のどちらかを使用することができる。緩衝液のpH
を低くするかまたは置換配位子を緩衝液に加えるかのい
ずれかである。
前者の場合、pHを低下させることによつて、ポリペプタ
イドまたはタンパク上の配位基、すなわちヒスチジンの
イミダゾール環を水素化する。生じた水素化配位子は固
定化金属イオンと配位共有結合を形成することができな
い。このような配位子を含有するポリペプタイドまたは
タンパクを低pH緩衝液を使用してカラムから洗い出す。
緩衝液に置換配位子を加えることにより、固定化金属イ
オンから、ポリペプタイドおよびタンパクの解離が生じ
る。この方法は、目的のポリペプタイドまたはタンパク
が低pH環境に耐えられない場合、特に有効である。もし
金属イオンに対する配位子の親和力が、結合しているポ
リペプタイドまたはタンパクの親和力により大きけれ
ば、配位子はポリペプタイドまたはタンパクと競合し、
置換される。このような置換配位子の例はエチレンジア
ミンテトラ酢酸（EDTA）である。ある種の配位子は、結
合しているポリペプタイドまたはタンパクの結合親和力
に比べ、その結合親和力が実質的に大きくない場合であ
つても、結合しているポリペプタイドまたはタンパクに
比べて大過剰に存在する場合には、置換することができ
る。このような配位子の例は、グリシン、ヒスチジンお
よびアンモニア等である。
次の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、こ
れは本発明を限定するものではない。
実施例１ IMACカラムの調製 金属を含まないキレート化樹脂〔セフアロース6B（ID
A）、フアーマシア；セフアロース4B（IDA）およびセフ
アデツクスG25（IDA）、ピアース〕は、エタノールまた
はアジ化ナトリウムのいずれかを安定剤として含有する
水性懸濁液として供給されている。安定剤を含有する懸
濁液を低回転数で遠心した後、樹脂を蒸留水中に再懸濁
させるという操作を繰り返し（３〜５回）、安定剤を除
去する。安定剤を含有しない樹脂の、75％スラリーを１
×10cmエコノカラム（Econo−Column）に投入し、３−
５倍カラム量の蒸留水で樹脂を洗浄する。
カラムの約75％が着色金属イオンで満たされるまで、50
mMの金属塩化物または金属硫酸化物水溶液を1ml単位で
加えることにより、カラムに選択した金属イオン〔Ni
（II）、Co（II）またはCu（II）〕を仕込む。たとえば
Ni（II）の場合、50mMのNiCl2溶液3mlを加えれば、金属
を含有しないカラムが底の方に25％残り、いずれかの解
離したNi（II）をトラツプするのに利用できる。金属イ
オンを含有するカラムを、蒸留水で洗浄し、次いで高pH
緩衝液〔100mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl（pH7.
5）〕で、さらに低pH緩衝液〔100mMリン酸ナトリウム、
100mM NaCl（pH4.3）〕で洗浄する。次いでカラムにフ
ローアダプターを取り付け、ぜん動ポンプを使用して高
pH緩衝液で平衡化する。
このカラムは、再生することなく約10回使用することが
できる。10回またはそれ以上の低pHサイクルを繰り返し
たカラムはクロマトグラフイー的挙動に再現性がなくな
る。0.5MのEDTA（pH8）２〜4mlでカラムの金属イオンを
取り去り、水で十分に洗浄し、前記のように新鮮なカラ
ムを調製して、新しいカラムを再生する。
実施例２ ヒスチジンを含有するペプタイドの結合および溶出 いくつかのヒスチジンを含有するジまたはトリペプタイ
ドの保存溶液を、高pH緩衝液中でほゞ1mg/mlの濃度に調
製する。ぜん動ポンプを使用して、各保存溶液を200μ
単位で、金属イオンアフイニテイクロマトグラフイー
カラムに入れる。次いで、非結合の物質がすべて溶出す
るまで、または試料がカラムに結合した場合には、カラ
ム量の10倍の緩衝液がカラムを通過するまで、高pH緩衝
液でカラムを洗浄する。次に、結合した物質がすべて溶
出するまで低pH緩衝液でカラムを洗浄する。ブツチラー
・フラクトースキヤン・モニター（Buchler Fracto−Sc
an moniter）を使用し、カラム溶出物を210nmで監視
し、50滴のフラクシヨン（約1.6ml）毎に、ギルソン（G
ilson）・フラクシヨン・コレクターを使用して集め
る。各フラクシヨンのpHを測定し、３種類の固定化金属
イオンカラムのそれぞれから、ヒスチジンを含有する小
ペプタイドのそれぞれが溶出したpHを、次第Ｉ表に示
す。溶出pH7.5は、特定の固定化金属イオンへの結合が
ないことを示している。
実施例３ 混合タンパクの結合特性 実施例１に記載のように調製したNi（II）セフアデツク
スG25およびセフアロース4Bカラム、および実施例２に
記載の方法を用いて、Ni（II）IMACカラムでのタンパク
類の溶出pHを測定した結果を第II表に示す。
ａのタンパクはカラムに結合するが、酸性pH下で沈降し
てこない。プロインシユリンＳ−スルホネートはEDTAで
溶出する。
ｂのタンパクは表中の溶出pH範囲を有する、３つの重な
つたピークで溶出する。
ｃのタンパクはほぼ60/40の割合の２つのピークで溶出
する。表中には両溶出pHピークを示す。
n.d.＝測定せず 使用したセフアデツクスG25カラムの分子量放出限界の
上限は、約5000である。従つて、前記のタンパクの結合
が認められなかつたのは異常なことではない。
セフアロース4Bカラム（分子量排出限界の上限がもつと
大きいもの）を使用して、先行技術のIMAC分離技術の予
想できなかった性質を確認する。この問題は、本発明の
方法によつて解決される。
実施例４ ４つの近似ペプタイドの結合および溶出特性の比較 次式： で示される４種のペプタイドについて、前記のセフアデ
ツクスG25（IDA）Ni（II）カラムを使用して、個々に試
験する。ペプタイドＡ、ＣおよびＤのそれぞれは、固定
化Ni（II）に結合しない。Ｎ−末端His−Trpの、キレー
ト結合するペプタイドを含有するペプタイドＢは強固に
結合したので低pH緩衝液を使用してpH4.7でカラムから
溶出した。
実施例５ キレート結合するペプタイドおよびその他のペプタイド
およびタンパクの複合混合物からの、キレート結合する
ペプタイドの分離 100μの各タンパク保存溶液（約1mg/ml）と30μの
各ペプタイド保存溶液（約1mg/ml）とを混合して、タン
パクおよびペプタイドの混合物を調製する。この混合物
中に含有されるタンパクは、実施例３でＡ−Ｏと命名し
たタンパクである。また、ペプタイドは、Gly−His−Gl
y、His−Ala、His−Glu、Met−His、Gly−Gly−His、Le
u−HisおよびHis−Gly−NH2である。
複合タンパク−ペプタイド混合物の一部（約500μ）
をHis−Trp保存溶液100μに加える。実施例１に記載
の方法と同様にして調製したNi（II）セフアデツクスG2
5（IDA）カラムで、実施例２に記載の条件下で、混合物
を処理する。1.6ml毎にフラクシヨンで集める。タンパ
クはpH7.5で、フラクシヨン10までに完全に溶出し、キ
レート結合しないペプタイドはフラクシヨン10−13近辺
で溶出する。対照的に、His−Trpはカラム上に残存す
る。フラクシヨン65近辺から、pH4.3の緩衝液を使用し
て溶出液のpHを低下させると、フラクシヨン70−75近辺
でHis−Trpが溶出する。
実施例６ キレート結合するペプタイドに共有結合しているポリペ
プタイド、およびその他のペプタイドおよびタンパクの
複合混合物からの、該ポリペプタイドの分離 実施例５に記載の方法に従つて混合物を調製する。混合
物が含有するものは、ポリペプタイドHis−Trp−Ser−T
yr−Gly−Leu−Arg−Pro−Gly−NH2、実施例３のＡ−
Ｆ、Ｈ、Ｉ、ＫおよびＭ−Ｏと命名したタンパク、およ
びメタロテイニン（metallo−theinin）およびペプタイ
ド（１）Gly−His−Gly、（２）His−Ala、（３）His−
Glu、（４）Met−His、（５）Gly−Gly−His、（６）Le
u−His、（７）His−Gly−NH2、（８）Ala−His、
（９）His−Lys、（10）His−Met、（11）Tyr−His、
（12）His−Tyr、（13）His−Val、（14）His−Ser、
（15）His−Leu、（16）His−Gly、（17）His−Phe、お
よび（18）Gly−Hisである。混合物を、実施例５に記載
の方法および条件に従つて分離する。このような条件下
では、タンパクおよび（１）−（７）のペプタイドはフ
ラクシヨン20までに溶出する。フラクシヨン50を開始点
として、pHを低下させる。（８）−（18）のペプタイド
はフラクシヨン50−55近辺で溶出し、His−Trp末端のキ
レート結合するペプタイドを含有する選択したポリペプ
タイドは、フラクシヨン58−67近辺で単独で溶出する。
実施例７ 構造的相関性を有するペプタイドの混合物から、キレー
ト結合するペプタイドに共有結合したポリペプタイドの
分離 次式： （１）His−Trp−Ser−Tyr−Gly−Leu−Arg−Pro−GlyN
H2 （２） Trp−Ser−Tyr−Gly−Leu−Arg−Pro−GlyN
H2 （３） Ser−Tyr−Gly−Leu−Arg−Pro−GlyN
H2 で示されるべきペプタイドの混合物を、実施例５に記載
の方法に従つて調製する。
実施例５に記載の方法および条件に従つて混合物を分離
する。ペプタイド（３）はフラクシヨン５−10近辺で、
ペプタイド（２）はフラクシヨン11−20近辺で溶出す
る。フラクシヨン40近辺を開始点として、pHを低下さ
せ、キレート結合するペプタイドを含有するペプタイド
（１）がフラクシヨン47−54近辺で溶出する。
実施例８ メチオニン化したヒスチジン含有ペプタイドの結合およ
び溶出 Ｎ−末端がメチオニン残基であるヒスチジン含有ペプタ
イドのいくつかの保存溶液を、実施例２と同様にして調
製する。使用するセフアロース4B（IDA）Ni（II）カラ
ムは、実施例３に記載したように、各試料毎に新たに調
製する。。このような４種類のカラムのそれぞれから、
それぞれのペプタイドが溶出してくるpH、および対応す
るヒスチジン末端のペプタイドとの比較を第III表に示
す。最も好ましいキレート結合するペプタイドに対して
Ｎ−末端メチオニン残基を付加することが、本発明にお
いてそのようなキレート結合するペプタイドを使用する
ことに実質的に影響しないことを、結果が示している。
実施例９ キレート結合するペプタイドに共有結合していないタン
パクから、キレート結合するペプタイドに共有結合して
いる同一のタンパクの分離 0.1Mリン酸ナトリウム、0.1M NaCl、7M尿素（pH7.5）の
200μ中に、プロインシユリンＳ−スルホネートおよ
びHis−Trp−プロインシユリンＳ−スルホネートを各10
0μｇ含有する混合物を、実施例３に記載のように新た
に調製して予め同一の緩衝液で平衡化しておいた、セフ
アロース4B（IDA）Ni（II）カラムに注入する。次い
で、非結合の物質がすべて溶出するまで、高pH尿素緩衝
液でカラムを洗浄する。フラクシヨンを、2ml毎に集め
プロインシユリンに対するHPLCおよびRIAによつて分析
する。さらに、最終pHが6.4の低pH緩衝液（０％から35
％まで）〔0.1Mリン酸ナトリウム、0.1M NaClおよび7M
尿素（pH2.6）〕のFPLC（高速タンパク液体クロマトグ
ラフイー）で行なわれる、２段階勾配法でカラムを洗浄
する。２段目に行なう勾配は、最終pHが5.3から4.9の低
pH緩衝液を使用して35％から44％までである。プロイン
シユリンＳ−スルホネートおよびHis−Trp−プロインシ
ユリンＳ−スルホネートの溶出はpHは、それぞれ6.5お
よび5.5である。
フロントページの続き (56)参考文献 ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２ （１） （ＪＡＮ．1984）Ｐ．76−81 ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ 60 （２） （1984）Ｐ．183−188 ＥＵＲ．Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ 119（１) （1981）Ｐ．183−188

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】固定化金属イオンとキレート結合するペプ
    タイドと、このペプタイドに共有結合した生物学的に活
    性なポリペプタイドまたはタンパクからなる化合物。
  2. 【請求項２】固定化金属イオンとキレート結合するペプ
    タイドが、ヒスチジンおよびシステインからなる群から
    選択される少なくとも１つのアミノ酸を含有している第
    （１）項記載の化合物。
  3. 【請求項３】固定化金属イオンとキレート結合するペプ
    タイドが式： His−Ｘ ［式中、Ｘは−Gly−His、−Tyr、−Gly、−Trp、−Va
    l、−Leu、−Ser、−Lys、−Phe、−Met、−Ala、−Gl
    u、−Ile、−Thr、−Asp、−Asn、−Gln、−Arg、−Cys
    または−Proである］ で示されるものである第（２）項記載の化合物。
  4. 【請求項４】Ｘが−Trp、−Tyr、−Gly−Hisおよび−Ph
    eからなる群から選択される第（３）項記載の化合物。
  5. 【請求項５】固定化金属イオンとキレート結合するペプ
    タイドが式： Ｙ−His ［式中、Ｙは−Gly、−Alaまたは−Tyrである］ で示されるものである第（１）項または第（２）項記載
    の化合物。
  6. 【請求項６】固定化金属イオンとキレート結合するペプ
    タイドが式： Met−His−Ｘ ［式中、Ｘは第（３）項または第（４）項の定義に同
    じ］ で示されるものである第（１）項または第（２）項記載
    の化合物。
  7. 【請求項７】固定化金属イオンとキレート結合するペプ
    タイドが、生物学的に活性なポリペプタイドまたはタン
    パクのアミノ末端に、選択的切断部位を介して間接的に
    共有結合している第（１）項記載の化合物。
  8. 【請求項８】固定化金属イオンとキレート結合するペプ
    タイドが、ニッケル、コバルトまたは銅イオンとキレー
    ト結合する第（１）項記載の化合物。
  9. 【請求項９】生物学的に活性なポリペプタイドまたはタ
    ンパクが、インシュリンＡ鎖、インシュリンＢ鎖、プロ
    インシュリンまたは成長ホルモンのアミノ酸配列を持っ
    ている第（１）項〜第（８）項のいずれかに記載の化合
    物。
  10. 【請求項１０】前駆体の形の生物学的に活性なポリペプ
    タイドまたはタンパクを、該前駆体と不純物を含有して
    いる混合物から分離する方法であって、固定化金属イオ
    ンとキレート結合するペプタイドと、このペプタイドに
    共有結合した生物学的に活性なポリペプタイドまたはタ
    ンパクからなる該前駆体を固定化金属イオンを含有して
    いる樹脂に接触させて該樹脂に前駆体を結合させ、次い
    で前駆体を樹脂から選択的に溶出させることを特徴とす
    る方法。
  11. 【請求項１１】生物学的に活性なポリペプタイドまたは
    タンパクの製造方法であって、第（10）項記載の方法に
    よってポリペプタイドまたはタンパクをその前駆体の形
    で分離し、次いでそれを生物学的に活性なポリペプタイ
    ドまたはタンパクに変換することからなる方法。
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Families Citing this family (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5279960A (en) * 1984-07-05 1994-01-18 Enzon Corp. 25 KD coccidial antigen of eimeria tenella
US4732974A (en) * 1986-03-05 1988-03-22 Mallinckrodt, Inc. Metal ion labeling of carrier molecules
US5047513A (en) * 1986-07-10 1991-09-10 Hoffmann-La Roche Inc. Metal chelate resins
CA1340522C (en) * 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
GB8706599D0 (en) * 1987-03-19 1987-04-23 Hoffmann La Roche Plasmodium falciparum merozoite antigen peptides
EP0316695B1 (de) * 1987-11-16 1993-03-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Rekombinante HIV-2 Polypeptide
US5780038A (en) * 1987-11-16 1998-07-14 Roche Diagnostic Systems, Inc. HIV-2 envelope polypeptides
JPH084519B2 (ja) * 1987-12-25 1996-01-24 エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー ハイブリッド形成用担体およびその調整方法
US4927879A (en) * 1988-02-25 1990-05-22 Purdue Research Foundation Method for solid phase membrane mimetics
US4931498A (en) * 1988-02-25 1990-06-05 Purdue Research Foundation Immobilized artificial membranes
US4952321A (en) * 1988-10-07 1990-08-28 Brigham Young University Process of removing and concentrating desired ions from solutions
US5169936A (en) * 1989-04-14 1992-12-08 Biogen, Inc. Protein purification on immobilized metal affinity resins effected by elution using a weak ligand
US5115102A (en) * 1989-07-21 1992-05-19 Monsanto Company Variant proteins and polypeptides possessing enhanced affinity for immobilized-metal affinity matrices
US6683046B1 (en) * 1989-12-22 2004-01-27 Hoffmann-La Roche Inc. Purification and characterization of cytotoxic lymphocyte maturation factor and monoclonal antibodies thereto
US5182369A (en) * 1990-02-28 1993-01-26 Monsanto Company Method for purifying somatotropin monomers
US5136025A (en) * 1990-04-04 1992-08-04 California Biotechnology Inc. Method to purify basic fibroblast growth factor
US5594115A (en) * 1990-04-09 1997-01-14 Pharmacia & Upjohn Company Process of purifying recombinant proteins and compounds useful in such process
AU7685791A (en) * 1990-04-09 1991-10-30 Upjohn Company, The Improved process of purifying recombinant proteins and compounds useful in such process
US5972337A (en) * 1990-11-01 1999-10-26 Cancer Research Fund Of Contra Costa 46 kilodalton human milk fat globule (HMFG) antigen, fragments and fusion protein
SK60893A3 (en) * 1990-12-13 1993-10-06 Upjohn Co Fusion polypeptides
AU1332992A (en) * 1991-01-25 1992-08-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antigen recognized by patients with antibody associated cerebellar degeneration, dna encoding same and uses thereof
US5439829A (en) * 1991-01-30 1995-08-08 Eli Lilly And Company Immobilization of biologically active molecules by changing the Oxidation state of a chelated transition metal ion
EP0505151A3 (en) * 1991-03-19 1993-04-07 Eli Lilly And Company Preparation of the penicilline binding protein 2a from staphylococcus aureus 27r, purification and use in a resistant-assay
US6602861B1 (en) 1992-04-16 2003-08-05 Research Corporation Technologies, Inc. Acylated phospholipid drugs
EP0583894A3 (en) * 1992-07-29 1995-09-06 Hybritech Inc Method of immobilizing and orienting molecules by use of metal chelating moieties to facilitate atomic force microscopy of proteins and molecular scale manipulation
US7105159B1 (en) 1992-11-05 2006-09-12 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antibodies to prostate-specific membrane antigen
US7070782B1 (en) * 1992-11-05 2006-07-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US6569432B1 (en) * 1995-02-24 2003-05-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen and uses thereof
SE9303822D0 (sv) * 1993-11-18 1993-11-18 Kabi Pharmacia Ab Method for purification
US5449758A (en) * 1993-12-02 1995-09-12 Life Technologies, Inc. Protein size marker ladder
DE4433980C2 (de) * 1994-09-23 1996-08-22 Boehringer Ingelheim Int Verfahren und Biosensorhit zur Untersuchung der Wechselwirkung von Biomolekülen mittels Oberflächen-Plasma-Resonanz
US5837520A (en) * 1995-03-07 1998-11-17 Canji, Inc. Method of purification of viral vectors
US5753206A (en) * 1995-06-07 1998-05-19 Immunomedics, Inc. Radiometal-binding analogues of luteinizing hormone releasing hormone
US20040253246A1 (en) * 1996-02-23 2004-12-16 Israeli Ron S. Prostate-specific membrane antigen and uses thereof
ES2108652B1 (es) * 1996-04-19 1998-07-16 Antibioticos Sa Un procedimiento para modificar la enzima 7/3-(4-carboxibutanamido) cefalosporinacilasa y purificarla en un solo paso cromatografico.
ES2218622T3 (es) 1996-07-26 2004-11-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada.
US6544769B1 (en) * 1996-12-13 2003-04-08 Schering Corporation Compostions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations
US20080261289A1 (en) * 1996-12-13 2008-10-23 Schering-Plough Corporation Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations
US6136557A (en) * 1996-12-13 2000-10-24 Eli Lilly And Company Strepococcus pneumoniae gene sequence FtsH
US6261823B1 (en) 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
AU6020998A (en) 1997-01-08 1998-08-03 Life Technologies, Inc. Methods for production of proteins
US5932102A (en) * 1998-01-12 1999-08-03 Schering Corporation Immobilized metal, affinity chromatography
US7026456B1 (en) * 1998-01-23 2006-04-11 Hoffman-La Roche, Inc. Antibodies against human IL-12
US6008329A (en) * 1998-03-06 1999-12-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Method for purifying cholera toxin
WO1999057992A1 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Clontech Laboratories, Inc. Compositions and methods for protein purification based on a metal ion affinity site
DE19825447A1 (de) * 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
US7176298B2 (en) 1998-09-25 2007-02-13 Clontech Laboratories, Inc. Polynucleotides encoding metal ion affinity peptides and related products
US7070937B1 (en) 1998-10-02 2006-07-04 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
US7449338B2 (en) * 1998-10-02 2008-11-11 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US20050142613A1 (en) * 1998-10-02 2005-06-30 David Bar-Or Test for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US20030215359A1 (en) * 1998-10-02 2003-11-20 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US7297544B2 (en) * 1998-10-02 2007-11-20 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US6475743B1 (en) 1998-10-02 2002-11-05 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
US6479300B1 (en) 1999-03-15 2002-11-12 Millipore Corporation Metal loaded ligand bound membranes for metal ion affinity chromatography
US6379903B1 (en) 1999-10-08 2002-04-30 Sigma-Aldrich Co. Purification of recombinant proteins fused to multiple epitopes
WO2001028569A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 Canji, Inc. Targeted vectors
US6521111B1 (en) 2000-04-10 2003-02-18 Invitrogen Corporation Methods and articles for labeling polymer gels
US6623655B1 (en) * 2000-04-24 2003-09-23 Sigma-Aldrich Co. Metal chelating compositions
WO2002014371A1 (de) * 2000-08-11 2002-02-21 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Fv-konstrukte mit beeinflussbarer affinität zu einer zu bindenden substanz
DE10040179A1 (de) * 2000-08-17 2002-02-28 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen Pflanzen
US20040180415A1 (en) * 2001-05-15 2004-09-16 Tchaga Grigoriy S. Methods and compositions for protein purification
JP4283666B2 (ja) 2001-06-21 2009-06-24 クローンテック ラボラトリーズ インク． 水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ組成物、およびその使用方法
US6902914B2 (en) * 2001-09-28 2005-06-07 Sigma-Aldrich, Co. Recombinant DNA processes using a dNTP mixture containing modified nucleotides
US7799561B2 (en) * 2002-06-12 2010-09-21 Sigma-Aldrich, Co. Affinity peptides and method for purification of recombinant proteins
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) * 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
WO2004047871A2 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 Nobex Corporation Modified naturetic compounds, conjugates, and uses thereof
ITMI20030755A1 (it) * 2003-04-11 2004-10-12 Bottega Verde S R L Peptidi e loro derivati quali inibitori di fenomeni degradativi e composizioni contenenti gli stessi.
CN1813059A (zh) * 2003-05-02 2006-08-02 西格玛-奥尔德利希公司 固相细胞裂解和捕获平台
JP4078247B2 (ja) * 2003-05-02 2008-04-23 キヤノン株式会社 磁性体−生体物質複合体型構造体、磁性体に対して結合能を有するアミノ酸配列を有するペプチド断片及びその遺伝子、ならびに磁性体−生体物質複合体型構造体の製造方法
US20040224425A1 (en) * 2003-05-08 2004-11-11 Gjerde Douglas T. Biomolecule open channel solid phase extraction systems and methods
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US7187286B2 (en) 2004-03-19 2007-03-06 Applera Corporation Methods and systems for using RFID in biological field
WO2006026248A1 (en) 2004-08-25 2006-03-09 Sigma-Aldrich Co. Compositions and methods employing zwitterionic detergent combinations
WO2006042263A2 (en) * 2004-10-12 2006-04-20 Clontech Laboratories, Inc. Phosphoprotein affinity resins and methods for making and using the same
JP2008520616A (ja) * 2004-11-24 2008-06-19 アプラーゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 固相ペプチド合成および精製方法
WO2006069403A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Genentech, Inc. Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins
US20080207505A1 (en) * 2005-01-12 2008-08-28 James Kenneth D Bna Conjugates and Methods of Use
JP2006239661A (ja) * 2005-03-07 2006-09-14 Pentax Corp 吸着剤、吸着剤の製造方法、吸着装置および吸着装置の製造方法
US7229769B2 (en) * 2005-03-25 2007-06-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity
US7741053B2 (en) * 2005-05-13 2010-06-22 Sigma-Aldrich Co. Processes for purification of recombinant proteins
US7265213B2 (en) * 2005-07-28 2007-09-04 Kpl, Inc. Methodology of conjugating chelators to biomolecules
CN101300355A (zh) * 2005-10-13 2008-11-05 威瑞克斯医药公司 包含丙型肝炎病毒多肽和用于引起免疫应答的Fc片段的嵌合抗原
ATE496133T1 (de) * 2006-02-08 2011-02-15 Usv Ltd Affinitätspolypeptid zur reinigung von rekombinanten proteinen
GB0604187D0 (en) * 2006-03-02 2006-04-12 Fusion Antibodies Ltd Peptide and uses thereof
WO2007120999A2 (en) * 2006-03-06 2007-10-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Chelating monomers and polymers
EP1878739A1 (en) * 2006-07-14 2008-01-16 LEK Pharmaceuticals D.D. One step IMAC (MCAC) purification of proteins
US20110053225A1 (en) * 2008-01-24 2011-03-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Multifunctional tags
JP5265762B2 (ja) 2008-05-13 2013-08-14 ユニバーシティ・オブ・カンザス 金属抽出ペプチド（ｍａｐ）タグおよび関連する方法
NZ597804A (en) 2009-07-24 2013-10-25 Immune Design Corp Lentiviral vectors pseudotyped with a sindbis virus envelope glycoprotein
AU2012217723A1 (en) 2011-02-15 2013-08-29 Immune Design Corp. Methods for enhancing immunogen specific immune responses by vectored vaccines
AU2012243039B2 (en) 2011-04-08 2017-07-13 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
WO2013067448A2 (en) 2011-11-03 2013-05-10 Vca Antech Inc. Compositions and methods to detect various infectious organisms
EP2831095B1 (en) 2012-03-30 2018-11-28 Immune Design Corp. Lentiviral vector particles having improved transduction efficiency for cells expressing dc-sign
HU230585B1 (hu) 2012-05-30 2017-01-30 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas lantanida fémionokkal komplexált hordozók
WO2013181461A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 University Of Kansas Metal abstraction peptide with superoxide dismutase activity
BR112016018521A2 (pt) 2014-02-14 2017-10-17 Immune Design Corp composição, e, kit.
JP2017522312A (ja) 2014-07-15 2017-08-10 イミューン デザイン コーポレイション Ｔｌｒ４アゴニストアジュバント及びレンチウイルスベクターを用いたプライム・ブーストレジメン
US11135283B2 (en) 2015-11-09 2021-10-05 Immune Design Corp. Retroviral vector for the administration and expression of replicon RNA expressing heterologous nucleic acids
MX2018005467A (es) 2015-11-09 2018-12-11 Immune Design Corp Composiciones que comprenden vectores lentivirales que expresan interleucina-12, y metodos de uso de las mismas.
WO2019152563A1 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Life Technologies Corporation Instruments, devices and consumables for use in a workflow of a smart molecular analysis system
CN113993548A (zh) * 2019-06-18 2022-01-28 马克思—普朗克科学促进协会公司 标记物和/或载体与靶分子例如带His-标签的蛋白质通过金属配合物试剂的位点特异性动力学惰性缀合
US20230076768A1 (en) 2020-01-14 2023-03-09 Synthekine, Inc. IL2 Orthologs and Methods of Use
WO2022032040A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Il2rb/il2rg synthetic cytokines
KR20230065254A (ko) 2020-08-05 2023-05-11 신테카인, 인크. IL27Rα 결합 분자 및 사용 방법
EP4192852A2 (en) 2020-08-05 2023-06-14 Synthekine, Inc. Il10ra binding molecules and methods of use
EP4192489A2 (en) 2020-08-05 2023-06-14 Synthekine, Inc. Il2rb binding molecules and methods of use
CA3204162A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 Robert Kastelein Compositions and methods related to receptor pairing
WO2024086739A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Synthekine, Inc. Methods and compositions of il12 muteins and il2 muteins

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1048150B (it) * 1973-10-31 1980-11-20 O T I Officina Terapeutica Ita Metodo per l isolamento delle transferine da materiali biologici
US4172072A (en) * 1977-10-20 1979-10-23 Ashmead H H Buffered enzymatically produced metal proteinates
US4216143A (en) * 1977-10-20 1980-08-05 Ashmead H H Soluble non-ferrous metal proteinates
US4216144A (en) * 1977-10-20 1980-08-05 Ashmead H H Soluble iron proteinates
JPS5562902A (en) * 1978-11-07 1980-05-12 Toray Ind Inc Separation of endotoxin
JPS55148098A (en) * 1979-05-10 1980-11-18 Toray Ind Inc Concentration and purification of interferon
JPS5835157A (ja) * 1981-08-24 1983-03-01 Otsuka Pharmaceut Co Ltd ヒトリムホブラストイドインターフェロンのｎ末端ペプチド
GB2097279B (en) * 1981-04-27 1984-08-01 Health Lab Service Board Affinity chromatography in presence of metal ions
US4472509A (en) * 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
JPS59130254A (ja) * 1982-10-18 1984-07-26 Mitsubishi Chem Ind Ltd ポリペプチド
US4476116A (en) * 1982-12-10 1984-10-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Polypeptides/chelating agent nasal compositions having enhanced peptide absorption
GB8308483D0 (en) * 1983-03-28 1983-05-05 Health Lab Service Board Secretion of gene products
GB8311136D0 (en) * 1983-04-25 1983-06-02 Lepetit Spa Immobilised oligopeptides
JPS59206342A (ja) * 1983-05-10 1984-11-22 Mitsubishi Chem Ind Ltd ペプチド類

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ２（１）（ＪＡＮ．１９８４）Ｐ．７６−８１
ＥＵＲ．Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ１１９（１）（１９８１）Ｐ．１８３−１８８
ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ６０（２）（１９８４）Ｐ．１８３−１８８

Also Published As

Publication number Publication date
DK535285A (da) 1986-06-06
AU5024085A (en) 1986-06-12
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CA1252948A (en) 1989-04-18
IL77104A (en) 1990-03-19
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IE852913L (en) 1986-06-05
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HK39192A (en) 1992-06-04
DE3585147D1 (de) 1992-02-20
IL77104A0 (en) 1986-04-29
US4569794A (en) 1986-02-11
HUT39462A (en) 1986-09-29
DK535285D0 (da) 1985-11-20
AU588840B2 (en) 1989-09-28
SG25792G (en) 1992-05-15
IE58501B1 (en) 1993-10-06
HU208025B (en) 1993-07-28
EP0184355B1 (en) 1992-01-08
EP0184355A2 (en) 1986-06-11

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