JPS59130254A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はポリペプチドに関する。更に詳しくは、電気シ
ビレエイ（Ｔｏｒｐｅｄ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）　
　の発電器官に存在するプレアセチルコリン受容体ノ ーαのアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。

本発明者の一人は、最近、電気シビレエイのプレアセチ
ルコリン受容体−αが図１に示すアミノ酸配列を有する
ことを見い出した。該アミノ酸配列１ｄ、電気シビレエ
イの発電器官より抽出されたプレアセチルコリン受容体
−αのｍＲＮＡ　から得られたｃＤＮＡ　の塩基配列か
ら決定された。

一方、蛋白の二次構造（α−ヘリックス、β−シート、
折れ曲り構造等）、親水性部位等を考慮して、アミノ酸
配列中の抗原活性部位を予測、決定する方法が知られて
いる（たとえば、Ｈｏｐｐ　＆　Ｗｏｏｄの方法：　　
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、Ｖｏｌ、７Ｊ’、　３ｇ２１１−３１２
１（７９１７）　　オヨびＣｈ、□ｕ＆　Ｆａｓｍａｎ
の方法：　Ａｄｖ、Ｆｉｎｚｙｍ、、　１１７，１１３
−ｌ弘ｇ（ｔり７Ｋ））。

本発明者らは、この方法を用いて、特定のポリペプチド
がアセチルコリン受容体と類似の結合または免疫的活性
を有することを見い出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨は、下記式ａ）ｍ）で示される
アミノ酸配列を部分構造または全構造として有すること
を特徴とするポリペプチドおよび薬剤的に許容し得るそ
の酸伺加塩に存する。

ａ）　　／−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇｂ　）　　７４ｔ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−１１ｅ−ＡｒｇＣ）　　　７タ−Ａｒｇ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａ、５ｐｄ）　　タ４ｌ
−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐｅ
）　　＋＃＋／−Ｇｌｕ−８ｅｒ”Ａｓｐ”Ａｒｇ−ｐ
ｒｏ−Ａｓｐｆ）　　／７ターＬｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙｇ）　　２３７−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｅ
ｌｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｅｈ）　　ＪＪＯ−Ｌｙ
Ｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−６１ｅｒ−Ｌｙｓ−（）１ｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓｌ）３６ざ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓｊ）　
　３１７−Ｌｙｅ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
８ｅｒｋ）　　７／−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−工１ｅ−Ｌｙｓ１）　　　／９！−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−
Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　３− ｍ）　　３０／−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｈｉｓなお、アミノ酸残基の左端の数字はプレア
セチルコリン受容体−αのアミノ酸配列中のアミノ酸残
基の位置を示す（図１）。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に係るポリペプチドは、上記ａ）〜（６）のいず
れかのアミノ酸配列をその全部または一部として有する
。後者の場合において、このポリペプチドは次式　Ｘ−
Ａ−Ｙ　　を有する。

ここで、Ａは上記ａ）　−ｍｌのいずれかのアミノ酸配
列の残基を示し、各アミノ酸残基は通常り一体である。

Ｘば、低級アルキル、低級アシル、担体蛋白またはペプ
チドであり、該担体蛋白およびペプチドのアミノ酸残基
はＬ−またはＤ一体である。

Ｙはアミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミ
ノ、低級アルコキシ、担体蛋白またはペプチドであり、
担体蛋白およびペプチドのアミノ酸残基はＬ−またはＤ
一体である。

Ｘ及びＹは、結合して、ジスルフィド、ニー　４− チルまたはエステル結合を有する環を形成していてもよ
い。

は、ヒト又はウシアルブミン、コラーゲン、ヘモシアニ
ン、フィブリノーゲン、ヒトエリスロサイト、合成ポリ
アミノ酸（たとえばポリグルタミン酸、ポリリジン）等
が挙げられる。

また、Ｘおよ■ろだはＹにおけるペプチドとしては、プ
レアセチルコリン受容体−αの配列中のＡに隣接した部
分的なアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するもの
であってもよいし、異なったものであってもよい。

ＸおよびＹはもちろん、Ａで示される１以上のアミノ酸
配列を含むものであってもよい。

ＸおよびまたはＹがペプチドである場合、そのアミノ酸
残基数は通常／−１０程度好ましくはＳ、ｔＯ程度から
選ばれる。ＸおよびまたはＹは、常法によって合成ポリ
ペプチド（Ａ）と結合させることができる。

また、薬剤的に許容され得る酸付加塩も本発明のポリペ
プチドに包含される。核酸付加塩としては、塩酸塩、臭
化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩およびマレ
イン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、ベンジル酸塩、コノ・
り酸塩、マロン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩が
挙げられる。

次に本発明のポリペプチドの製造法について説明する。

本発明に係るポリペプチドは、ペプチド化学において用
いられる方法を適宜選択して製造することができる。す
なわち、固相法、液相法のいずれによっても得ることが
できる。

固相法による本発明のポリペプチドの合成は、最初の樹
脂に結合させたアミノ酸からアミノ酸配列を構築する当
業者に一般に知られている方法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、　８ｏｃ。Ｊ！。

、ｚｉ鼾（７り６３））に従って行うことができる。

すなわち、保護基を有するアミノ酸をクロロメチル化ポ
リスチレン樹脂またはベンズヒドリルアミンポリスチレ
ン樹脂に付着させて、α−アミノ保護基をトリフルオロ
酢酸の塩化メチレン溶液により脱離する。この保護基の
脱離はＯＣ〜室温で行われる。他の保護基の脱離法とし
ては、Ｌｕｂｋｅの方法（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｊ、ｄｅｓ
″、／、　７．２−７３　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　／９乙り）が挙げられる。

アミン保護基脱離後は、保護基を有するつぎのアミノ酸
を樹脂に結合したアミノ酸配列と個別結合させる。ある
いは、小さいペプチド片を液相法で作り、所望の順序で
同相反応器に導入してもよい。各ペプチド片は過剰に導
入する。

結合反応は、ジメチルホルムアミドまだは塩化メチレン
あるいは両者の混合溶媒中で行われ、結合剤としてはジ
イソプロピルカルボジイミドを用いるのが好ましい。

所望のアミノ酸配列を有するポリペプチドが合成された
ら常法により担体樹脂から脱離する。

液相法により本発明のポリペプチドを合成する場合は、
遊離のアミノ基を有するアミノ酸を遊離のカルボキシル
基および保護基を有するアミン基を有するアミノ酸とを
縮合剤（例えば、　７− ／、３−ジシクロへキシルカルボジイミド等のカルボジ
イミド）の存在下結合させる。反応終了後、過剰分のカ
ルボジイミドは酸性化により対応する尿素とし、ｐＨを
中性付近に調節したのちｆ過により除去する。生成物は
、酸性化あるいは抽出によシ回収することができる。

更に、結合反応の際には、直接反応に関与しない官能基
を適当な保護基によって不活化し、結合すべきカルボキ
シル基またはアミノ基は活性化させておく必要がある。

反応に関与しないアミノ基の保護基としてはベンジルオ
キシカルボニル基（Ｚ）％　　ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル基（ｔ−Ｂｏａ）が好ましく、側鎖水酸基に対して
はベンジル基（Ｂｚｌ　）　、側鎖グアニジノ基に対し
てはトシル基が好ましい。

結合に関与するカルボキシル基を活性化するには、該カ
ルボキシル基を酸ハライド、酸アジド、活性化エステル
（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル）あるいは混合
酸無水物に変えておくのが望ましい。これらのアフル化
剤は、溶　８− 液の形で用いる方が便利であり、分離して用いる必要は
ない。

アミノ酸またはそのＮ−置換誘導体を混合酸無水物に変
えるには、該アミノ酸またはそのＮ−置換誘導体をトリ
ー低級アルキルアミンを含有するケトン溶媒に溶解し、
ＯＣ，，２０’ｌ：：で無水物形成試薬（例えば、クロ
ロギ酸の低級アルキルエステルまたはアリールエステル
）により処理するとよい。次いで、該混合酸無水物を−
ｒｏＣ−ｔｏＣでアミノ酸と反応させるとポリペプチド
が得られる。生成物は、反応混合物を酸性化した後、沈
殿させるか、あるいは、酢酸エチル、メチルイソブチル
ケトン等の有機溶媒により抽出することにより回収でき
る。

アミノ酸保護基は、トリフルオロ酢酸ｓ　　ｐ−トルエ
ンスルホン酸等の酸により脱離して、各々の酸付加塩と
なる。脱離法としては、他に、パラジウム、ラネーニッ
ケル、白金、ロジウム等の触媒を用いて水素化分解する
方法が挙げられる。一般に水素化分解は、水、メタノー
ル、テトラヒドロフラン、アセトン、酢酸等の溶媒中、
　ＯＣ−ｘ　ｏ′ｃ（好ましくは室温）にて行うのがよ
い。水素圧は、特に限定されず、大気圧以下でも以上で
もよい。

本発明で用いられる結合、保護および脱離の特定の方法
は、それぞれ当業者に知られており、特定の結合、保護
および脱離反応を行うための反応条件は、当業者にとっ
ては明らかである。

先に述べた結合反応は、Ａで示されるポリペプチドとＸ
およびＹで示される担体蛋白またはペプチドとの結合に
も適用される。

このようにして得られたポリペプチドは、常法により無
毒で薬剤的に許容し得る酸付加塩とすることができる。

該酸付加塩の酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リ
ン酸等の無機酸およびマレイン酸、酢酸、クエン酸、ベ
ンジル酸、コハク酸、マロン酸、アスコルビン酸等の有
機酸が挙げられる。

本発明のポリペプチドは、アセチルコリン受容体と類似
の抗原活性を有し、アセチルコリン受容体抗体に対し特
異な親和性を有する。

本発明のポリペプチドの抗原活性を高めるために、Ｘ及
び７間を、ジスルフィド、エステルまたはエーテル結合
によって結合することができる。ジスルフィド結合は、
ＸおよびＹ中に含まれるシスティン間で形成することが
でき、エステル結合は、ＸおよびＹ中に含まれるヒドロ
キシル基およびカルボキシル基間で形成される。

このような環状化も常法により行なわれる。

本発明のポリペプチドは、アセチルコリン受容体抗体ま
たはその類似ポリペプチドの製造および精製に有用であ
り、また、アセチルコリン受容体に対する自己免疫反応
（アセチルコリン受容体に対する抗体の産生）による神
経筋伝達障害に起因するとされる重症筋無力症の診断お
よび治療にも有用である。診断の目的に用いる場合は、
ＸまたはＹ中に含まれる１個以上のアミノ酸を３Ｈ′、
１３Ｓ％１４０または３２Ｓによって標識化する。Ｘと
して、チロシン、ヒドロキシフェニルグロビオニル基、
ヒスチジン又はシステ１１− インを含む場合は、１２５工または１３１工により好適
に標識化される。また、本発明に係るポリペプｌ＋１ 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例により限
定されるものではない。

実施例１ （］）　　Ｚ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−８ｅｒ−ＯＨ（分
子量：　！ｊｉＦ７）（１） Ｚ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（Ｔ、Ｈａｙａｋａｗａ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｕｌｌ。

（：！ｈｅｍ、ｓｏｃ、Ｊａｐａｎｊり、３り／（／９
４４））（、ｔＪＪ％、／、ｔｎｉｎｏｌｅ）のテトラ
ヒドロフラン（２０ｍｌ）溶液にＮ−メチルモルホリン
（／、３３ｍ１）　　およびクロロギ酸インブチル（１
，り１ｒｙｎｌ）　　を−ｌｊＣにて攪拌上添加した。

この混合物にＨＯ８ｕ　（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミ
ド）　（３，ｌｌｊ　ｆ）　　のテトラヒドロフラン（
ｉｏ　ｔｔｔり溶液を一１ｓｔ３にて攪拌上添加し、更
に−ｔｓＣで３θ分間、ＯＣにて３０分間攪拌した。得
られた混合物にトリエチル１２− アミン（１１，２ｍｌ　）を含む水（／、！；ｍｌ）中
Ｈ−８ｅｒ−ＯＨ（３，／　ｊ　ｆ　、　３０　ｍｍｏ
ｌｅ　）の溶液をｏ１３にて攪拌上添加し、更にｏ’６
で２時間、室温で７５時間攪拌した。有機溶媒を除去後
、？ 残留物を酢酸エチルで３回抽出し、逐次、ｌＮクエン酸
および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄、硫酸ナトリウ
ムで乾燥した。溶媒を留去後、エーテルを添加して残留
物を固体化し、Ｒｆ’：　０．芹（χ−ブタノールー酢
酸−水（グ：／：ｊ）） Ｒｆ’：　０．７０　（１−ブタノール−ピリジン−酢
酸−水（３０：コ（７１：ｊ４Ｌ）） ［０１）　　：　　１０１１−１０．ｆＣ〔α）２．７
　：　＋３．７°（Ｃ：／、／λ　メタノール）元素分
析値： 計算値（０２３Ｈ２ｇ　Ｎ２０ｇとして）　：　　Ｃ，
Ａｏ、２６；Ｈ，ｊｔ、ｔｊ；Ｎ、ｉ／／ 実測値　　　　：　Ｃ，ｔＯ，３３，Ｈ，！ｒ、ｔｊ”
、Ｎ、ｊｆ、りｊ（２）　　Ｚ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−
Ｇｌｕ−８ｅｒ−ＯＩ（（分子量：　３ｇ７ｊり）（１
） 物質（１）　（２，２０７、！、ｆ　Ｏｍｍｏｌｅ　）
をメタノール（５０ｍｌ　）および水（２０ｍｌ　）中
でｌ！時間パラジウムと接触させて水素化分解した。ｆ
過後、溶媒を留去し、エーテルにより残渣を固体化した
。（Ｒｆ　、　０．ＩＩ、Ｒｆ　、　０．２６）Ｚ−Ｇ
ｌｕ（ＯＢｚｌ）ＯＨ（ｌ、Ａ７　ｉｉ４，７．２ｍｍ
ｏｌｅ）のＮ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ｉｓｍｔ
＞溶液に、Ｎメチルモルホリン（０，７３ｔｎｌ）およ
びクロロギ酸インブチル（Ｏ，タタｍ／）を−ｌ夕Ｃに
て攪拌上添加した。

得られた混合物に、ＨＯ８ｕ（／　、６ｊｆ）のＮ、Ｎ
’　−ジメチルホルムアミド（７ｍｌ　）溶液を一／ｊ
Ｃにて攪拌上添加し、更に、−ｔｊＣで３０分間％ｏｒ
３で３０分間攪拌した。得られた混合物に、上記で得ら
れた保護基を脱離したジペプチドのトリエチルアミン（
／、Ｊｕｌｌ）　　を含むＮ、Ｎ’−ジメチルホルムア
ミド（１３ｍｌ）および水（！　ｍｅ　）溶液をｏ’６
にて攪拌上添加し、更に、０υで２時間、室温で／ｊ時
間攪拌した。

溶媒を除去後、残留物を酢酸エチルで３回に／ 分けて溶解し、逐次、ＺＮ　　クエン酸および飽和塩化
ナトリウム水溶液で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。

溶媒を留去後、エーテルを添加して残留物を固体とし、
メタノール−エーテルから再沈殿すると、物質（１１）
が、２．．２０ｆｌ−（ＶＬＯ係）得られた。

Ｒｆｌ：　　０，７グ　、　　　　Ｒｆｆｆ：　　θ、
ｔりｍｐ　：　／６６−／Ａ７　Ｃ （α）”　：　−／３．１”（Ｃ＝７．０３メタ／−ル
）元素分析値： 計算値（０２１１Ｈ３３ＮＯ３０１１として）：Ｃ，ｊ
７．コ弓Ｈ，ｊ’、Ａ＆；Ｎ、７．ｔｓ 実測値　　　　　　　　　”、Ｃ，３７，Ｉｔ’、Ｈ，
３，！／；Ｎ、７．ｏｒ （３）Ｚ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−８ｅ
ｒ−ＯＨ（分子量ニア０２．６７７）（■） 物質（ＩＩ）　（ｔ、ｔざ７．ｚ、Ｏｍｍｏｌｅ）をメ
タノール１５− （ＩＩ　Ｏｍｌ　）および水（／　Ｏｍｌ　）中で／ｊ
ｆ時間パラジウムと接触させて水素化分解した。

ｆ過後、溶媒を留去して、エーテル添加により残留物を
固体化した。（Ｒｆ’　：ｏ、ｔｔｒ、Ｒｆｌｌ：ｏ、
２ｐ）Ｚ−Ａ８ｐ（ＯＢＺＩ）ＯＲ（：ｆ：Ｍ、　　Ｄ
ａｖｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ。

Ｃｂｅｍ、８ｏｃ、、　！！ｊ　（／９；Ａ））　（ｔ
、１Ｉ３ｆ、１１．Ｏｍｍｏｌｅ）のＮ、Ｎ’−ジメチ
ルホルムアミド（／　！　ｍｌ　）溶液にＮ−メチルモ
ルホリン（ｏ、ｔｔｉｍｔ）　　およびクロロギ酸イソ
ブチル（ＯＪ３ｍｌ）を−ｌよＣにて攪拌上添加する。

得られた混合物にＨＯ８ｕ（ｏ、ｔｙ、）　　のＮ、Ｗ
−ジメチルホルムアミド（７ｍｌ　）枦溶液を−ｌｊＣ
にて攪拌上添加し、更に−ｌｊＣで３０分間、ｏＣで３
０分間攪拌した。

次いで、この混合液に上記で得られた保護基を脱離した
トリペプチドのトリエチルアミン（ｏ、ｔｒｔｈｔ　）
を含むＮＩＷ−ジメチルホルムアミド（１０ｒａｌ）お
よび水（ｊ　ｔｅｌ　）溶液をｏＣにて攪拌しながら添
加し、更にｏＣで２時間室温でｔＳ時間攪拌した。溶媒
除去後、４′Ｎり１６− エン酸添加により残留物を固体化し、水で洗浄した。メ
タノール−エーテルにより再沈殿すると化合物（ＩＩＩ
）が／、／Ｉｆｆ　（１／、１％）得うレタ。

Ｒｆ　、　０．６９　　、　　Ｒｆ　、　０．ｔＯ〔α
）：４ニー＋２ｔ、ｔ°（ａ＝ｔ、ｏｒ　　メタノール
）（４１’　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｂｅｒ−ＯＭｅ　（分
子量：　ｓｔｓ、ｓｔり）（■）Ｚ−ＬｙＢ（Ｚ）０８
ｕ　（１３，Ｃｈｌａｄｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｏ１
１ｅｃｔ。

Ｃｚｅｃｈ、Ｃｈｅｍ、Ｃ！ｏｍｍｕｎ、、３３．　　
Ｌ２タタ　（ｌりｇ、ｒ））（／、ｊｆＯｆ、２．り３
ｍｍ０１ｅ）ノテトラヒトロフラン（１３ｍｌ）溶液に
）Ｔ−８ｅｒ−ＯＭｅ−ＨＯｌ（０，ｌＩｌ、ｇ−，２
，り３ｍｍｏｌｅ）　　のトリエチルアミン（ｏ、グ／
ｍｌ）を含むＮ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド（１０ｍ
ｌ）溶［−０Ｃで攪拌下に添加した。混合物をｏＣで２
時間、室温でｔｒ時間攪拌した。溶媒を除去後、残留物
を酢酸エチルで３回に分けて溶解／ し、逐次、４Ｎ　　クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム
水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄、硫酸す
）　ＩＪウムで乾燥した。溶媒を留去後、エーテル添加
により、残留物を固体化し、メタノール−エーテルから
再沈殿すると物質（ＩＶ）が／、／９　ｆ　（７ｒＪ　
％）得られた。

Ｒｆ　、　ＯＪＩ　　、　　Ｒｆ　、　０．ざ乙ｍｐ　
：　ｌ２０−／、２／　’Ｑ　。

〔α〕ミ９ニー７Ｊ’　（Ｃ−／、０３メタノ一ル〕元
素分析値： 計算値（０２ａ　Ｈ３−ＡＮｓ　Ｏｓとして）　：　Ｏ
ｊＯ，ｊ７；Ｈ，＆、μｊ；ＮＪ、／ｊ 実測値　　　　　　　　　：　Ｃ，ｔＯ，ｔｔ；Ｈ，ｔ
、ｌ１２；ＮＪ、／／ （５）　　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｅｅｒ−Ｎ２Ｈ３（分子
量：　ｓｔｓ、ｔＡ７）　ｆｆ）物質（■）　（／、０
！　ｆｆ−，２，０１１ｒｎｒｎｏ１ｅ）　　をメタノ
ール（２０ｍｌ）に溶解し、ヒドラジン−水和物（０，
タタｍｌ）をｏＣにて攪拌下添加した。この混合物を室
温で２０時間放置した。得られた沈殿物を濾過し、エー
テルで洗浄後、メタノール−エーテルにより再沈殿する
と物質（Ｖ）が／、０／ｆ／−（りｔ、ｏチ）得られた
。

Ｒｆ　　、　　０，７！　　　、　　　Ｒｆ　　、　　
０．７りｍｐ　：　／Ａ、ｆ−／Ｉ！＋Ａ　’Ｑ。

（α）”７：　−７１，ｉ”　（Ｃ＝／、ＯＦ酢酸）元
素分析値： 計算値（（４５ｌ３３　ｔＪｓｏ７としテ）　：　Ｃ！
、ｔ、ｌ’、、２Ｆ；Ｈ，Ａ、Ｌｔ；Ｎ、ｉ３．オｇ 実測値　　　　　　　　　ＨＣ，ｓｇ、ｏ、ｒ、Ｈ，島
４ｔｌ；Ｎ、／Ｊ、、！／ （６１Ｚ−Ｌｙｓ（Ｚ）−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−８ｅｒ−ＯＨ（分子量：ｇ７≠、どｔ７）　　（
Ｖｒ）物質（■）　（０，７０ｇ−、／、Ｏｍｍｏｌｅ
）　　をメタノール（ｊＯｍｌ）およびタチ酢酸（ｊＯ
ｍｌ）中で／、ｆ時間パラジウムと接触させて水素化分
解した。

ｆ過後、溶媒を留去して、エーテル添加により残留物を
固体化した。（Ｒｆ’　：０．／！ｒ、Ｒｆ”　：０．
／り）。

Ｚ　　Ｌｙｓ（Ｚ）　　Ｓｅｒ　　Ｎ２Ｈ３（Ｖ’）（
０，乙２ｆ、　　／　、２ｍｍｏｌｅ）のＮ、Ｎ’−ジ
メチルホルムアミド溶液（ｊＯｍｌ）［ＡＮ塩酸／ジオ
キサン（ｏ、乙０ｍ１）を−ｔＩＣにて攪拌下添加した
。この混合物に亜硝酸イソアミル（０，７６ｍ１）　　
を加え、トリエチルアミンで中和した。

このようにして得られたアジド溶液は、上記で得られた
保護基を脱離したテトラペプチ１９− ドのトリエチルアミン（ＯｊＡ　ｍｌ）を含むＮ　、　
Ｎ’２時間、≠ＣでｔＳ時間攪拌する。溶媒除去／ 後、ＺＮ　　クエン酸添加により残留物を固体化し、水
で洗浄し、メタノール−酢酸エチルで再沈殿すると、物
質（、ＶＴ）が０．ｔ３ｇ−（７２，０係）得られた。

Ｒｆ　、　０，３３　　、　　Ｒｆ　、　０．グア〔α
〕ミ４ニー２２．０°　（（３＝／、０３　　メタノー
ル）（７）　　Ｈ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａ、５ｐ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ−８ｅｒ−ＯＨ（分子量：乙り３．ｔ７）　　
（■） 物質（■）（０，３３ｆ、０．３１ｒｎｍｏ１ｅ）をメ
タノール（３０ｍｌ　）および１０ｑ６酢酸（ｊＯｍｌ
）中でｌ５時間パラジウムと接触させて水素化分解した
。

濾過、溶媒を留去後、酢酸エチル添加により残留物を固
体化し、再沈殿すると物質（■）が０．２２ｆ　（１３
，タチ）得られた。

Ｒｆ　、　０．０≠、　　Ｒｆ　、　０．／ｊｍｐ　：
　／’７ｔ’Ｑ、　（α）：２ニー３／、２°（ｃ＝ｔ
、ｔ３酢酸）２Ｏ− ＨＰＬＣ：　ＲＴ＝夕、５分（溶媒：　０．７Ｍ塩酸−
メタノール（７１，２）） 実施例コ （１）　　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｂ＋）ｃ）−８ｅｒ−ＯＭｅ　
（分子量：　ｐｙｌ、、ｔｔ）（ｌＶ’）Ｚ−Ｌｙｅ（
Ｂｏｃ）−ＯＨのＤＣ！ＨＡ塩（３，３７ｐ、Ａｍｍｏ
ｌｅ　）から調製されたＺ７Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの
テトラヒドロフラン（ｊＯｍｌ）溶液にＮ−メチルモル
ホリン（０，！／ｍｌ）およびクロロギ酸イソブチル（
２，３２ｍ１）を−ｌｊＣで攪拌下に添加した。この混
合物にＨ−８ｅｒ−ＯＭｅ　−ＨｏＩ　（０、７１ｆ、
　、ｔｍｍｏｌｅ　）のトリエチルアミン（０，７０ｍ
１）を含むＮ、Ｉ−ジメチルホルムアミド（ｊＯｍｌ）
溶液を−ｌｊＣで攪拌下に添加し、更に、−１ｓＣで３
０分間、／ けて溶解し、逐次ＪＮ　　クエン酸、飽和炭酸水素ナト
リウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫
酸ナトリウムで乾燥した。

蒸留後、石油エーテルの添加により残留物を固体化した
。酢酸エチル−石油エーテルにより再沢殿すると物質（
ｒｖ′）が２．／夕Ｐ　（ｆ２．３チ）得られた。

Ｒｆ　、　０．１／　、　Ｒｆ　、　０３ｔｍｐ　：　
１０／−１０３’Ｑ 元素分析値： 計算値（Ｃ２３Ｈ３５Ｎ３０ｇとして）：Ｃ９！７．３
７：Ｈ，７，３３；Ｎ、！、７３ 実測値　　　　　　　　　：Ｃ！、ｊ７．タタ；Ｈ９７
，３３；Ｎ、ど、乙、！ （２）　　　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−８ｅｔ−Ｎ２Ｈ３
（分子量：ｔｔ−ｇｔ３４Ｌす（Ｖ′）物質（ｆｆ）（
／、りＪｇ−４，０７ｍｍｏｌｅ）をメタノール（／！
ｍｌ）に溶解し、ＯＣでヒドラジン−水和物（１，タタ
ｍｌ）を添加した。この混合物を室温で、２０時間放置
した。得られた沈殿物を１過し、エーテルで洗浄した。

メタノール−エーテルにより再沈殿すると物質ｍが／　
、Ｉｆｆ（２７，４を係）得られた。

Ｒｆ　、　０．７６、　　Ｒｆ　、　０．１１ｍｐ　　
：　　／タデ−２０，２１： 元素分析値： 計算値（０２２Ｎ３５　Ｎ５０７として）：Ｏ，ｊｊ、
１７：Ｈ，７，３３；Ｎ、／弘、ｊψ 実測値　　　　　　　　　：　Ｏ，ｊｊ、／７；Ｈ，７
ｊ＆；Ｎ、１４ｔ、１３ （３１Ｚ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−８ｅｒ−Ａ、５ｐ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−ＯＨ（分子量：　７．２７．り／
り）　　　（Ｖｌつ前記実施例／（３）で得られた物質
（Ｉｌｌ）　（０，！！ｒｆ　、　０．７７ｍｍｏｌｅ
）　　をメタノール（，２０ｍ１）および１係酢酸（１
０ｍｌ）中で／ｊｔ時間パラジウムと接触させて水素化
分解した。ｆ過後、溶媒を留去し、エーテル添加により
残留物を固体化した　（Ｒｆ　、　０．１０．　Ｒｆ　
、　０．２／）。

Ｚ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｎ２Ｈ３（■’）（０，１１！
ｆ、　　０．り弘ｍｍｏｌｅ）のＮ、Ｗ−ジメチルホル
ムアミド（１０ｍｌ）溶液に６Ｎ塩酸／ジオキサン（ｏ
、６ｍ１）を−ｌ夕Ｃで攪拌下に添加した。この混合物
に亜硝酸イソアミル（０，７２ｍ１）を加え、トリエチ
ルアミンでトリエチルアミン（０、ｌ／４ｍ１）を含む
Ｎ、Ｎ’−ジメ２３− 合物を−ｔｓＣで２時間、弘Ｃで７５時間攪拌した。溶
媒除去後、残留物をｎ−ブタノールでｊ回に分けて溶解
し、逐次水で洗浄した。

溶媒留去後、残留物をエーテル添加により残留物を固体
化した。メタノール−酢酸エチルにより再沈殿すると物
質（■′）がｏ３μ７（７３，１１係）得られた。

Ｒｆ、０．夕＋２．　　Ｒｆ、０．、ｔｒｍｐ：／９ｊ
’Ｑ（分解） 元素分析値： 計算値（０３９Ｎ５７　Ｎ７０１９としテ）　：　Ｃ，
ｊｔＯ，ｌＩｒ；Ｈ，ｔ、／９Ｎ、１０３７ 実測値　　　　　　　　　　：　Ｃ，！−０，００；Ｈ
，ｔ、２グＮ、／（７，≠６ アミノ酸分析：　　Ｇｌｕ　、２．０．ｆ（２）、　Ｆ
３ｅｒ　／、７／（，２）。

Ａｓｐ　　Ｏ，タタ（１） （４）　　３ＨＰＰ−Ｍｅｔ−Ｎ２Ｈ３（分子量：　３
／／、１／−０ｊｆ）　　　　（■つ３−（ｐ−ヒドロ
キシフェニル）プロピオン酸２４− （３ＨＰＰ）　（０，７ｊ７，４’、ｊｍｍｏｌｅ）よ
り調整されたＨＰＰ−Ｏ８ｕのＮ　、　Ｎ’−ジメチル
ホルムアミド（２０ｍｌ）溶液にＨ＝Ｍｅｔ−ＯＭｅ−
ＨＯＡ　（０，りｏｙ−、ａ、ｓ。

ｍｍｏｌθ）のトリエチルアミン（０，Ａ３ｍ１）を含
むＮ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）溶液を
ＯＣで攪拌下に添加した。混合物をＯＣで１時間、室温
で１３時間攪拌した。溶媒除去後、残留物を酢酸エチル
で３回に分けて溶解し、逐次、ｌＮ　　クエン酸、飽和
炭酸水素す）　ＩＪウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水
溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後
、残留物を五酸化リンで乾燥した。得られた物質をメタ
ノール（１０ｍｌ）に溶解し、ヒドラジン−水利物０．
ｔｏｍｌ）をｏ’ｒ３で添加した。この混合物を室温で
２０時間放置した。得られた沈殿物をｆ過し、エーテル
で洗浄した。メタノール−エーテルにより再沈殿すると
物質（■つが０Ｊ７ｆ　（乙コ、／％）得られた。

Ｒｆ　、　０．７／　、　Ｒｆ　、　０．７ｇ元素分析
値： 計算値（０１４Ｎ２１　Ｎ３０３Ｓとして）：Ｃ９夕弘
、ｏｏ；Ｈ，乙３゜；Ｎ、／３．ゲタ 実測値　　　　　　　　　　：　Ｃ，ｊ３Ｊ？；Ｈ，ｔ
、７４ｔ；Ｎ、／、？、３Ｊ’ （５）　、　ＪＨＰＰ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−ＯＨ（分子ｉ：ｔｏ７３
．ｔ３り）　　　（ｖｒ）物質（Ｗ）　（０，３３ｆ、
　０　、Ｊｊｍｍｏｌｅ）をメタノール（２０ｍｌ）お
よび水（／！ｍｌ）中でｌ夕晴間パラジウムと接触させ
て水素化した。濾過後、溶媒を留去し、エーテル添加に
より残留物を固体化した（Ｒｆ’：　０．＃、、Ｒｆ”
、θ、グｔ）。

３ＨＰＰ−Ｍｅｔ−Ｎ２Ｈ３（■’）（０，２２ｇ−，
０，７ｍｍｏｌｅ）のＮ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド
（／ｊｍｌ＞溶媒に＆Ｎ塩酸／ジオキサン（０，３３ｍ
１）を−ｔｓＣで攪拌しながら添加した。この混合物に
亜硝酸イソアミル（０，０７クコ）を添加し、トリエチ
ルアミンで中和した。得られたアジド溶液を上記で得ら
れた保護基を脱離したヘキサペプチドのトリエチルアミ
ン（０、２０ｍ１）を含むＮ、Ｎ’−ジメチルホルムア
ミド（／ｊｍｌ）および水（−３ｍｌ）溶液と混合し、
−／夕Ｃで２時間、グＣでｌ５時間攪拌して結合させた
。溶媒除去後、残留物をｎ−ブタノールで５回に分けて
溶解し、逐次、水で洗浄した。溶媒留去後、残留物を酢
酸エチルで固体化した（０．３ｔｆ、’／、ｆ、Ｉ％）
。

得られたこの組物質をクロマトグラフィーじ５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　ＣＨ−２０”　、溶出溶媒＝　ｊ多水性ジメチ
ルホルムアミド）にかけた。両分を集め蒸留し残留物を
酢酸エチルにより固体化した（２２０ｍ９．７　／　、
　７％）。得られた物質（０，２２ｙ−）をエタンジチ
オール（０，／ｍｌ）を含むトリフルオロ酢酸（３ｍｌ
　）に溶解し、室温で２０分間放置した。乾燥エーテル
で沈殿させ、五酸化リンおよび水酸化カリウムで乾燥し
た。得られた物質をクロマトグラフィーじ５ｅｐｈａｄ
ｅｘＧ−１０”、溶出溶媒：　０．０８エタンチオール
含ノ 有＆Ｍ酢酸）にかけ、主画分を集めて凍結乾燥すると目
的物質（％１１’）が６弘、３ｍ９得られた。

ｆ＜ｆ　、　０＋２．！ｒ　　、　　Ｒｆ　、　０．Ｉ
ｌｌ２７− 元素分析値： 計算値（Ｃ４ｏＨａｏＮｓＯ＋ｇＳ−２ＨｚＯとして）
：　Ｃ１弘ｑ、ｔｔ；Ｈ，ｂ、３り；Ｎ、／（７，７Ｊ
実測値　：　Ｃ，１１７，２７；Ｈ，ｔ、０７；Ｎ、／
／、／／アミノ酸分析：　　ＭｅｔＯ，り５（ｔ）、　
Ｇｌｕ２．”２（２）＋Ｅｌｅｒ　／、７／（＋２）、
　Ａｓｐ　／、００（１）。

ＬｙｓＯ，り５（ｉ）

【図面の簡単な説明】

図／（ａおよびｂ）は、電気シビレエイのプレーアセチ
ルコリン受容体−αのアミノ酸配列を示す図である。 出　願　人　　三菱化成工業株式会社 代　理　人　　弁理士　長谷用　　　−ほか１名 −２９−４９０− ２８− 佃　　　１−Ｕ）Ｏ−Ｈ こ　　　　　　　　　　　σ ｉ０Φ　−−０−００ 効への　ＩＱ　〜く　寸」 １ 旧　　　の　　　　フ　　　　の　　　　Ｃｒ−？＋１
＋Ｉ　　　　　　　　ｎ□ 筺ゴ　　　　　　＼　　　　　　　Ｑ）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　＋−ｑ　　　　　　　　　　Ｉ
ＪＩ　　　　　　　　　ｕ　　　　　　　　　４□□す ＜＜〉 −ト　　　く　　　Ｈ ＣＤ　　　　　ＣＤ　　　　　Ｈ（、Ｄ手続補正口（方
式） 昭和５９年２月２１日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 昭和５８年特許願第１９５００９号 ２　発明の名称 ポリペプチド ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 （５９６）三菱化成工業株式会社 ４代理人　〒ｉｏ。 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三菱化成工業株式会社内 ５　補正命令の日付　昭和５９年１月３１日（発送日）
６　補正の対象 ４９４−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　下記式ａ）〜ｍ）で示されるアミノ酸配列を
   部分構造または全構造として有することを特徴とするポ
   リペプチドおよび薬剤的に許容し得るその酸付加塩。 ａ）　８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｒ
   ｇｂ’）　Ｇｌｙ−工’１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−工１８
   −Ａｒｇｃ）　Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａ’
   ５ｐ＝Ａｓｐｄ）　Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−
   Ｇｌｙ−Ａｓｐｅ）　、Ｇｌｕ−Ｅｌｅｒ−Ａｓｐ−Ａ
   ｒｇ−Ｐｒｏ＝Ａｓｐｆ）　ＬｙＳ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−
   Ａｒｇ−Ｇ１７ｇ、）　Ｔｈｒ−Ａｓｐ−９ｅｒ−Ｇｌ
   ｙ−Ｇ’ｌｕ−Ｌｙｇｈ）　Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−
   ８ｅｒ−ＬｙＳ−Ｇｌｕ−Ｌ％−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓ
   ｎ−Ｌｙｓｉ　）　Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａ８１）
   −Ｖａｌ−１１Ｊ７１１！ｊ）　Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａｓ
   ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−８ｅｒｋ）　　　Ａｓｐ−Ｔｙｒ
   −（ｌｙ−Ｇ’ｌｙ−工１ｅ−Ｌｙｓ１）　Ａｓｐ−Ｔ
   ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔ、ｙｒ＝Ｌｅｕ−Ａｓｐｍ）　　Ａｒ
   ｇ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ（２）　
   　下記式： （上記式中で、Ａは、特許請求の範囲第１項のａ）〜ｍ
   ）で示されるアミノ酸配列の残基を示し、各アミノ酸残
   基はＬ体であり；Ｘは、低級アルキル基、低級アシル基
   、担体蛋白またはペプチドを表わし、該担体蛋白および
   ペプチドのアミノ酸残基はＬ−またはＤ一体であり；Ｙ
   は、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキル
   アミノ基、低級アルコキシ基、担体蛋白またはペプチド
   を表わし、該担体蛋白およびペプチドのアミノ酸残基は
   Ｌ−またはＤ一体であり；ＸおよびＹは、結合してジス
   ルフィド、エーテル捷たはエステル結合を含む環を形成
   してもよい。） で示される特許請求の範囲＠１項記載のポリペプチド。