DK171917B1 - Forbindelser, der kan anvendes til rensning af proteiner og fremgangsmåder, der anvender disse forbindelser - Google Patents

Forbindelser, der kan anvendes til rensning af proteiner og fremgangsmåder, der anvender disse forbindelser Download PDF

Info

Publication number
DK171917B1
DK171917B1 DK535285A DK535285A DK171917B1 DK 171917 B1 DK171917 B1 DK 171917B1 DK 535285 A DK535285 A DK 535285A DK 535285 A DK535285 A DK 535285A DK 171917 B1 DK171917 B1 DK 171917B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
protein
gly
peptide
proteins
column
Prior art date
Application number
DK535285A
Other languages
English (en)
Other versions
DK535285A (da
DK535285D0 (da
Inventor
Michele Ceceil Smith
Charles Pidgeon
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of DK535285D0 publication Critical patent/DK535285D0/da
Publication of DK535285A publication Critical patent/DK535285A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK171917B1 publication Critical patent/DK171917B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/223—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material containing metals, e.g. organo-metallic compounds, coordination complexes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3265—Non-macromolecular compounds with an organic functional group containing a metal, e.g. a metal affinity ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/40—Aspects relating to the composition of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/49—Materials comprising an indicator, e.g. colour indicator, pH-indicator
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/58—Use in a single column
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

DK 171917 B1 i Nærværende opfindelse angår en gruppe forbindelser, der omfatter et biologisk aktivt polypeptid eller protein kovalent bundet direkte eller indirekte til et immobili-serende metalionchelerende peptid og derudover en adskil-5 lelsesmetode for ovennævnte biologisk aktive polypeptid eller protein.
I 1975 introducerede Porath begrebet immobiliseret metal-ion-affinitetschromatografi (IMAC) til fraktionering af 10 proteiner J. Porath, J. Carlsson, i. Olsson og 6. Bel-frage, Nature (London) 258. 598-599 (1975). Ifølge dette arbejde består IMAC i at derivatisere en harpiks med imi-nodieddikesyre (IDA) at binde metalioner til den IDA-derivatiserede harpiks ved chelat-dannelse. Proteinerne 15 binder sig til metalionerene via ikke-besatte koordinationssteder og immobiliseres på kolonnen. Sidenhen har forskere anvendt andre ligander end IDA til at binde metalioner til harpikser ved chelat-dannelse. Undersøgelser med serumproteiner har vist, at IMAC er en ekstremt specifik 20 og selektiv separationsteknik (J. Porath og B. Olin, Biochemistry 22., 1621-1630 (1983)).
Visse aminosyrerester, såsom histidin, cystein, methio-nin, glutaminsyre, asparaginsyre, lysin og tyrosin, som 25 er til stede på aktive metalloprotein-sites, antages at være i det mindste delvist ansvarlige for den faktiske binding af frie metalioner til sådanne apoproteiner. De faktiske mekanismer, som giver anledning til at proteiner binder sig til frie metalioner, er kun i ringe grad for-30 stået, og de afhænger af et antal faktorer, som ikke mindst omfatter konformationen af det enkelte protein.
Når metalionerne imidlertid immobiliseres, kommer mindst tre andre begrænsende faktorer til at spille en rolle, nærmere bestemt det reducerede antal tilgængelige koordi-35 nationssites på metallet, det bundne metals begrænsede adgang til proteinets bindingssteder samt (i afhængighed DK 171917 B1 2 af den pågældende harpiks) proteinets begrænsede adgang til den immobiliserede metalion. Det er således særdeles vanskeligt på forhånd at fastslå hvilke proteiner, der vil udvise en affinitet over for immobiliserede metalio-5 ner, og hvilke proteiner der ikke vil.
Når først bindingen er indtruffet, kan proteinet imidlertid frigøres ved protonisering af den tilknyttede metalion-bindende ligand. En dissociation opnås ved at sænke 10 pH-værdien af det omgivende puffer-medium, hvilket er en særdeles velkendt metode til eluering af bundne proteiner.
Europæisk patentansøgning 122 969 (1984) beskriver en mo-15 dificeret matrix til selektivt at absorbere antibiotika, der knytter sig til den voksende cellevæg af bakterier.
Den modificerede matrix er karakteriseret ved en oligo-peptidkæde knyttet direkte, eller ved hjælp af spacerar-me, til en passende vanduopløselig bærer. Der er signifi-20 kante forskelligheder mellem den foreliggende opfindelse og det i den pågældende EP patentansøgning 122 969 beskrevne. Nærværende opfindelse omhandler et biologisk aktivt polypeptid eller protein kovalent knyttet til peptid. Opfindelsen i EP 122 969 angår derimod et uopløse-25 ligt materiale kovalent knyttet via en spacer til en kort polypeptidkæde, der er i stand til at binde forskellige antibiotika. De afgørende forskelle ifølge den foreliggende opfindelse er at denne kræver et biologisk aktivt polypeptid, medens EP 122 969 ikke kræver dette; den 30 foreliggende opfindelse kræver et kovalent knyttet peptid begrænset på den måde, at det skal være i stand til at chelere og immobilisere divalente metalioner og som har 2-5 aminosyrerester, hvoraf mindst en er histidin eller cystein. En sådan begrænsning forefindes ikke i EP 35 122 969.
DK 171917 B1 3 UK patentansøgning 2 097 279 (1982) omhandler en frem gangsmåde til affinitetskromatografisk adskillelse af mindst en biologisk substans fra en blanding, hvor den biologiske substans er bundet til et bindemateriale med 5 en ligand indeholdende mindst en af grupperne an-thraguinon, phthalocyanin eller aromatisk azo i nærværelse af en metalion. Fremgangsmåden kræver, at liganden indeholder særlige grupper, der ikke er en del af den foreliggende opfindelse, en matrix som kan være enten et po-10 lysaccharid såsom et tværbundet agarose, en polyacrylamid eller en siliciumoxid. Den foreliggende opfindelse kræver derimod ingen af disse begrænsninger, men angår derimod en fremgangsmåde til oprensning af et biologisk aktivt polypeptid eller protein i form af dets præcursor, som 15 omfatter at bringe præcursoren i kontakt med en harpiks indeholdende immobiliserede metalioner og eluere præcursoren fra harpiksen. Nævnte GB 2 097 279 kræver ikke en immobiliseret metalion for at chelere peptid.
Endelig omhandler US patentskrift nr. 4 476 116 (1984) en 20 næsespray omfattende et chelerende middel, et polypeptid og et farmaceutisk acceptabelt excipiens. Det chelerende middel anvendes for at chelere metalioner. Imidlertid er det chelerende middel ikke en afgørende del af polypepti-det fra US patentskriftet 4 476 116. Med hensyn til dette 25 er det forskelligt fra den foreliggende opfindelse, der kræver at det chelerende peptid skal være kovalent knyttet til et biologisk aktivt polypeptid eller protein.
Det har nu overraskende vist sig, at det er muligt at anvende begrebet immobiliseret metalion-affinitetschromato-30 grafi til reproducerbar og forudsigelig oprensning af et stort antal substanser, og denne opdagelse danner basis for den foreliggende opfindelse. Nærmere bestemt angår den foreliggende opfindelse (1) forbindelser, som er specifikt "skræddersyet" til korrekt oprensning (via IMAC) DK 171917 B1 4 fra blandinger indeholdende sådanne forbindelser, og (2) en fremgangsmåde til gennemførelse af en sådan oprensning, 5 Opfindelsen angår således en gruppe forbindelser, der omfatter et biologisk aktivt polypeptid eller protein kovalent knyttet direkte eller indirekte til et immobiliseret metalionchelerende peptid. Opfindelsen angår derudover en fremgangsmåde til at skille det biologisk aktive polypep-10 tid eller protein i form af dets præcursor fra en blanding indeholdende nævnte præcursor og andre urenheder. Forbindelserne er ejendommelige ved det i krav 1 angivne, og fremgangsmåden er ejendommelig ved det i krav 9 angivne.
15 Fremkomsten af rekombinant-DNA-metodikken og tilgængeligheden af potentielt ubegrænsede mængder af polypeptider og proteiner med forskellige strukturer har frembragt et behov for at udvikle metoder til forarbejdning og oprensning af de resulterende syntetiske produkter. Fremgangs-20 måden ifølge opfindelsen repræsenterer et svar på dette behov, idet den focuserer på den reproducerbare oprensning af proteiner og polypeptider, især sådanne produkter, som frembringes ved rekombinant-DNA-teknologi.
25 Opfindelsen omfatter således en proces til at separere biologisk aktive polypeptider og/eller proteiner fra urenheder. Ved "biologisk aktive polypeptider og proteiner" forstås sådanne polypeptider og proteiner, som i sig selv er biologisk aktive, eller polypeptider og protei-30 ner, som er nyttige til fremstilling af biologisk aktive polypeptider og proteiner.
De nævnte polypeptider og proteiner kan være naturligt forekommende eller syntetiske, og såfremt de er synteti-35 ske, kan de fremstilles ved klassiske teknikker i opløs- DK 171917 B1 5 ningsfase eller fast fase eller ved rekombinant-DNA-metodik. De involverede polypeptider og proteiner er fortrinsvis sådanne, som fremstilles via rekombinant-DNA-metodik.
5
De omhandlede forbindelser består af to komponenter, nemlig det tidligere nævnte biologisk aktive polypeptid eller protein og et peptid, som ved chelat-dannelse kan binde immobiliserede metalioner, og som er bundet direkte 10 eller indirekte til polypeptidet eller proteinet ved kovalent binding.
Ved et "peptid, der ved chelat-dannelse kan binde immobi-liserede metalioner" forstås en aminosyresekvens, som kan 15 danne chelater med immobiliserede divalente metalioner, hvor metallerne er valgt blandt cobalt, nikkel og kobber.
De metalioner, som foretrækkes til chelat-dannelse ifølge opfindelsen, er valgt blandt ioner af nikkel og kobber.
20 Af disse metaller er nikkel det mest foretrukne.
De essentielle karakteristika af det metalchelat-dannende peptid, som indgår i forbindelserne ifølge opfindelsen, er, (1) at det kan danne chelater med en immobiliseret 25 metalion, og (2) at dets chelat-dannende evne opretholdes, når det knyttes til et biologisk aktivt polypeptid eller protein. Mange peptider vil danne chelater med metalioner under betingelser, hvor hverken ionen eller pep-tidet er underlagt ydre hindringer. Når metalionen imid-30 lertid er immobiliseret, bliver dens tilgængelighed for chelat-dannelse meget begrænset, og hvis peptidet, som udviser en chelat-dannende evne, ydermere er knyttet til en anden enhed, eksempelvis et biologisk aktivt polypeptid eller protein, kan dette forhold indebære, at den 35 chelat-dannende evne formindskes. De chelat-dannende pep- DK 171917 B1 6 tider, som benyttes i forbindelserne ifølge opfindelsen, besidder begge de ovennævnte positive egenskaber.
Egnede og foretrukne peptider, der kan danne chelater med 5 immobiliserede metalioner, og som er nyttige ifølge opfindelsen, er de peptider, som indeholder mindst en aminosyre valgt blandt histidin og cystein. De mest foretrukne peptider, der kan danne chelater med immobiliserede metalioner, er de peptider, der indeholder histidin.
10
Den optimale længde af peptidet, der ved chelat-dannelse kan binde immobiliserede metalioner, afhænger først og fremmest af antallet af ikke-besatte koordinationssteder på den immobiliserede metalion. For eksempel kan iminodi-15 eddikesyre, hvorigennem metalionen er bundet til den anvendte harpiks, være tridentat. Det betyder, at der i afhængighed af det pågældende metal kan være op til 3 ledige og tilgængelige koordinationssteder på metalionen, som er bundet til harpiksen via iminodieddikesyre. Udvalgte 20 dipeptider kan derfor tjene som særdeles effektive tridentat ligander ved at tilvejebringe mindst tre potentielle donoratomer. De omhandlede chelat-dannende peptider vil derfor normalt indeholde mindst to og op til omkring fem aminosyrer.
25
Som eksempler på specifikke histidin-holdige peptider, der kan danne chelater med immobiliserede metalioner, kan anføres peptider med formlen
30 His-X
hvori X er valgt blandt -Gly-His, -Tyr, -Gly, -Trp, -Val, -Leu, -Ser, -Lys, -Phe, -Met, -Ala, -Glu, -Ile, -Thr, -Asp, -Asn, -Gin, -Arg, -Cys og -Pro.
35 DK 171917 B1 7
En foretrukken undergruppe af de ovennævnte peptider er His-Trp, His-Tyr, His-Gly-His og His-Phe, blandt hvilke His-Trp, His-Tyr og His-Gly-His er de mest foretrukne.
5 En anden klasse af histidin-holdige peptider, der kan danne chelater med immobiliserede metalioner, kan angives ved formlen Y-His 10 hvori Y fortrinsvis er Gly-, Ala- eller Tyr-.
En tredie klasse af histidin-holdige peptider, der kan danne chelater med immobiliserede metalioner, har den al-15 mene formel
Met-His-X
hvori X har den ovenfor angivne betydning.
20
Hvilket chelat-dannende peptid, der anvendes i den enkelte situation, afhænger naturligvis af et antal faktorer, blandt hvilke man kan nævne identiteten af metalionen.
Hvis for eksempel metalionen er Ni(II), foretrækker man 25 således de følgende histidin-holdige peptider, som kan danne chelater med immobiliserede metalioner: His-Gly-His, His-Tyr, His-Trp, His-Gly, His-Val, His-Leu, His-Ser, His-Lys, His-Met, Gly-His og Ala-His. Hvis metalionen er Cu(II), foretrækkes de følgende histidin-30 holdige chelat-dannende peptider: His-Gly, His-gly-His,
His-Ala, His-Val, His-Leu, His-Ser, His-Glu, His-Lys, His-Phe, His-Tyr, His-Trp og His-Met.
Forbindelserne ifølge opfindelsen kan fremstilles via re-35 kombinant-DNA-metodik, og denne fremstillingsmetode foretrækkes. Ved denne metode fremstiller man en nucleotid- DK 171917 B1 8 sekvens, der koder for det ønskede polypeptid, som både indeholder det biologisk aktive polypeptid eller protein og det direkte eller indirekte bundne chelat-dannende peptid, idet man anvender rutinemetoder til sådanne syn-5 teser. Som det vil være velkendt for fagmanden, involverer disse metoder sædvanligvis en fremstilling af oligo-nucleotider, som både koder for fragmenter af den ønskede kodningssekvens og for dennes komplementære sekvens. Oligonucleotiderne er designet til at tilvejebringe over-10 lapning af et fragment af kodningssekvensen med to fragmenter af den komplementære sekvens og vice versa. Disse oligonucleotider parres og sammenknyttes, hvilket slutteligt fører til den ønskede gen-sekvens.
15 Sekvensen indføres i en klonningsvektor på et sted, som gør det muligt for peptid-produktet, for hvilket sekvensen koder, at blive udtrykt. En egnet kloningsvektor indeholder i det mindste en del af udtrykkelseskontrolse-kvensen af et gen.
20
En typisk udtrykkelseskontrolsekvens kan beskrives pågrundlag af fem elementer. Der er tale om følgende elementer, anført i den rækkefølge, i hvilken de optræder i genet: (a) promotor-regionen, (b) den 5'-ikke-translate- 25 rede region, (c) den protein-kodende sekvens, (d) den 3'-ikke-translaterede region og (e) afslutningsstedet for transkriptionen.
Funktionen af hvert af disse elementer i gen-systemer er 30 velkendt. Promotor-regionen bevirker en igangsættelse af messenger-RNA (mRNA) produktionen (transkription). Promotoren kan være (1) fri for ekstern kontrol (konstitutiv), (2) under kontrol af en repressor, dvs. en substans, der, når den er til stede, undertrykker gen-funktionen, eller 35 (3) under kontrol af en induktor, som er en substans, der kræves for at inducere gen-funktionen. F.eks. er lipopro- DK 171917 B1 9 tein-genet (lpp) uden ekstern kontrol og betegnes således som "konstitutivt".
Lokaliseret lige ved eller i nærheden af promotoren fin-5 des "transkriptions-begyndelsesstedet", som er et punkt, hvortil RNA-polymerase binder sig for at igangsætte DNA-transkriptionen. Når denne transkription er iværksat, produceres der mRNA. Strukturen af det resulterende mRNA bestemmes udfra DNA-sekvenserne af de ovennævnte gen-10 elementer (b), (c) og (d).
Det resulterende mRNA bærer en sekvens, som kan transla-teres til et protein-produkt. Den translaterbare sekvens er lokaliseret efter den 5'-ikke-translaterede region og 15 før den 3'-ikke-translaterede region. Translationen formidles ved binding af ribosomer til en sekvens i mRNA'ets 5'-ikke-translaterede region, som benævnes det ribosomale bindingssted, og translationen påbegyndes ved translati-on-start-codon'et (AUG), som viser sig som det første co-20 don i produktets gen-sekvens, og som også koder for aminosyren methionin (Met). Translationen slutter ved et eller flere afslutnings-codon'er, der viser sig ved enden af translations-regionen.
25 Ved anvendelse af rekombinant DNA-teknik er det muligt at fremstille kloningsvektorer, som er nyttige ved fremstilling af udvalgte fremmede (exogene) proteiner ved i sådanne vektorer at indføre en udtrykkelseskontrolsekvens, dvs. en sekvens af nucleotider, som kontrollerer og regu-30 lerer udtrykkeisen af strukturelle gener under produktion af exogene proteiner, når de bindes operativt til disse gener.
På baggrund af det foregående omfatter betegnelsen 35 "udtrykkelseskontrolsekvens" de ovennævnte elementer (a), (b), (d) og (e).
DK 171917 B1 10
Man kan anvende rekombinant DNA-metodik til at udtrykke forbindelser ifølge opfindelsen, enten som en del af et større "hybrid-molekyle" eller ved direkte udtrykkelse.
Når man anvender direkte udtrykkelse, udformes klonings-5 vektoren på en sådan måde, at udtrykkelsesproduktet udelukkende består af det ønskede produkt, som følger efter en methionin-rest (Met), der hidrører fra tilstedeværelsen af det vigtige start-codon. Denne overflødige Metrest kan fjernes ved at behandle produktet med cyanbromid 10 eller med phenylisothiocyanat efterfulgt af en stærk vandfri syre, såsom trifluoreddikesyre.
Når man foretager udtrykkeisen via et hybrid-molekyle, indfører man en DNA-sekvens, der koder for det ønskede 15 produkt, i udtrykkelseskontrolsekvensen af en kloningsvektor på et sådant sted, at det udtrykte produkt omfatter et hybrid-protein. Ved "hybrid-protein" forstås et rekombinant DNA-produkt, som består af et fremmed protein samt generelt hele det naturlige (endogene) protein eller 20 en del heraf, som frembringes af udtrykkelseskontrolse-kvensen (for eksempel lipoprotein i lipoprotein-genet), hvortil der er knyttet det ønskede protein, dvs. en forbindelse ifølge opfindelsen.
25 Det passende konstruerede hybrid-protein, som frembringes ved rekombinant-DNA-metodik vil indeholde et spaltningssted i overgangen imellem den endogene protein-del og det ønskede produkt. Dette spaltningssted muliggør dannelse af et modent produkt ved kemisk eller enzymatisk behand-30 ling af hybrid-protein-produktet. Særligt nyttige selektive spaltningssteder omfatter en DNA-sekvens, som koder for en aminosyre eller en sekvens af aminosyrer, der kan spaltes kemisk eller enzymatisk ved dens C-terminal.
35 Som eksempler på kemiske midler, der er nyttige til spaltning af proteiner, kan anføres cyanbromid, 2-(2- DK 171917 B1 11 nitrophenylsulfenyl)-3-brom-3'-methylindolinium (BNPS-skatol), hydroxylamin og lignende. Cyanbromid spalter proteiner ved C-terminalen af en methionin-rest. Derfor er det selektive spaltningssted en methionin-rest i sig 5 selv.
Hydroxylamin spalter ved C-terminalen af gruppen -Asn-Z-, hvori Z er Gly, Leu eller Ala.
10 BNPS-skatol spalter ved C-terminalen af en tryptophan-rest.
Som eksempler på enzymatiske midler, der er anvendelige ved spaltningen, kan anføres trypsin, papain, pepsin, 15 plasmin, thrombin, enterokinase og lignende. Hvert af disse midler bevirker spaltning ved en bestemt genkendt aminosyresekvens. Enterokinase genkender for eksempel aminosyresekvensen -(Asp)„-Lys-, hvori n er et helt tal mellem 2 og 4.
20
Det mest foretrukne selektive spaltningssted, især hvis forbindelserne ifølge opfindelsen mangler methionin, er en methionin-rest. Denne rest, som er knyttet til N-terminalen af det ønskede produkt, lader sig let fraspal-25 te ved kendte metoder under anvendelse af cyanbromid, hvorved man opnår det ønskede produkt, som er en forbindelse ifølge opfindelsen.
Til konstruktion af nyttige kloningsvektorer kræves flere 30 elementer. To af de krævede elementer er fælles for alle anvendelige kloningsvektorer. For det første må vektoren indeholde et DNA-segment, der indeholder et funktionelt origin for replikation (replicon). Plasmider og phag-DNA indeholder af natur replicon'er, som letter replikationen 35 i en værtscelle.
DK 171917 B1 12
For det andet må vektoren indeholde et DNA-segment, som bibringer en transformerbar værtscelle en egenskab, der kan anvendes til at udvælge de transformerede celler fra de ikke-transformerede celler. En lang række forskellige 5 egenskaber kan anvendes til udvælgelsesformål. En af de hyppigst anvendte egenskaber er antibiokum-resistens, eksempelvis tetracyclin-resistens eller ampicillin-resi-stens.
10 De ovenfor nævnte to elementer er sædvanligvis til stede i let tilgængelige og anerkendte kloningsvektorer. Som eksempler på egnede kloningsvektorer kan nævnes bakterielle plasmider, såsom plasmider fra E. coli, herunder pBR322, pMB9, ColEl og pCRl, plasmider med bredere værts-15 område, herunder RP4, phag DNA'er, såsom lambda, og lignende. De fleste af de ovennævnte anerkendte vektorer (hvis ikke dem alle) besidder de i det foregående beskrevne karakteristika.
20 Et tredie element er udtrykkelseskontrolsekvensen. Man kan anvende en lang række forskellige sådanne kontrolsekvenser, herunder eksempelvis kontrolsekvenserne fra lipoprotein-genet, beta-gallactosidase-genet, tryptophan-genet, beta-lactamase-genet, phag lambda og lignende.
25
Ved fremstillingen af en egnet kloningsvektor ved indføring af den udvalgte udtrykkelseskontrolsekvens anvender man rutinemetoder. Kloningsvektorer indeholder forskellige steder, hvor man kan foretage spaltninger under anven-30 delse af en restriktions-endonuclease, som er specifik for det pågældende sted. Ethvert af disse steder kan udvælges til indføring af udtrykkelseskontrolsekvensen. Som et eksempel herpå eksisterer der i det velkendte og dokumenterede plasmid pBR322 flere egnede restriktionssteder, 35 der hver for sig kan anvendes som indføringssteder. Et Pstl-sted er lokaliseret inden for genet for beta- DK 171917 B1 13 lactamase. Andre steder, som ligger uden for de specifikke kodningsregioner, er EcoRI og PvuII. Disse og andre steder vil være velkendte for fagmanden.
5 Idet man udnytter et hvilket som helst af disse steder, kan man let foretage en indføring af en udtrykkelseskon-trolsekvens eller en væsentlig del deraf til frembringelse af vektorer.
10 Et fjerde element er naturligvis den DNA-sekvens, der koder for det ønskede produkt. Som tidligere bemærket kan denne DNA-sekvens konstrueres syntetisk, eksempelvis ved anvendelse af den velkendte phosphortriester-metode eller en anden anerkendt metode.
15
Passende kloningsvektorer kan anvendes i en lang række værtsorganismer, for eksempel gram-negative prokaryote organismer såsom Escherichia coli, Serratia, Pseudomonas og lignende, gram-positive prokaryote organismer såsom 20 Bacillus, Streptomyces og lignende samt eukaryote organismer såsom Saccharomyces og lignende. Fortrinsvis er værtsorganismen en gram-negativ prokaryot organisme. Af de gram-negative prokaryote organismer er E. coli særligt foretrukken, for eksempel E. coli K12 stammer såsom 25 RV308.
Idet man anvender velkendt metodik, benytter man passende fremstillede kloningsvektorer til at transformere egnede værtsorganismer, hvori kloningsvektorerne amplifikeres, 30 og protein-produktet udtrykkes under anvendelse af standard- fermenteringsbetingelser.
Hvis udtrykkelseproduktet som tidligere beskrevet er et hybrid-protein, kan man først behandle produktet med et 35 middel til fraspaltning af det fremmede (endogene) materiale, hvilket efterlader en forbindelse ifølge opfindel- DK 171917 B1 14 sen. Hvis produktet imidlertid er et resultat af en direkte udtrykkelse, vil det udelukkende afvige fra det materiale, der opnås ved spaltning af hybrid-proteinet, ved at det indeholder en ledende methionin-gruppe, der hidrø-5 rer fra udtrykkeisens start. Denne ekstra methionin-gruppe vil normalt ikke forhindre, at produktet anvendes til sit "skræddersyede" formål, nemlig en separation fra urenheder ved immobiliseret metalion-affinitetschromato-grafi.
10
Som bemærket ovenfor omfatter forbindelserne ifølge opfindelsen et chelat-dannende peptid, som er kovalent bundet til et biologisk polypeptid eller protein. Denne binding kan være direkte eller indirekte. Hvis bindingen er 15 indirekte, vil den normalt inkludere et passende udformet selektivt spaltningssted, som vil muliggøre en let fjernelse af det chelat-dannende peptid under samtidig dannelse af det ønskede slutprodukt. En hvilken som helst af de ovenfor beskrevne aminosyrerester eller -sekvenser 20 (såvel som andre) kan anvendes som selektive spaltningssteder.
Eftersom det chelat-dannende peptid er lille, nærmere bestemt et di-, tri-, tetra- eller pentapeptid, kan det let 25 bindes til det biologisk aktive polypeptid eller protein.
I mange tilfælde kan det chelat-dannende peptid forblive knyttet til det biologisk aktive polypeptid eller protein, og det resulterende molekyle vil bibeholde hele den aktivitet (eller størstedelen deraf), som kendetegner det 30 ikke-bundne biologisk aktive polypeptid eller protein.
Ikke desto mindre kan det chelat-dannende peptid, hvis det er knyttet direkte til det biologisk aktive polypeptid eller protein ved sidstnævntes amino-terminal, fjernes ved Edman-omdannelse som sekvensvis fjerner enkelte 35 N-terminale aminosyrer. Det antal gennemførte Edman- DK 171917 B1 15 omdannelser, som er nødvendigt, vil naturligvis afhænge af længden af det chelat-dannende peptid.
Som det fremgår implicit af det foregående, kan det che-5 lat-dannende peptid knyttes enten direkte eller indirekte til en vilkårlig ende af det biologisk aktive polypeptid eller protein. Det foretrækkes imidlertid, at det chelat-dannende peptid er anbragt ved amino-terminalen af det biologisk aktive polypeptid eller protein.
10
Som typiske eksempler på biologisk aktive polypeptider og proteiner, som med fordel kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, kan nævnes insulin A-kæde, insulin B-kæde, proinsulin, væksthormon, insulin-lignende 15 vækstfaktorer, glucagon, somatostatin, frigivelsesfakto ren for væksthormon og lignende.
De harpikser, der er nyttige til fremstilling af kolonner til immobiliseret metalion-affinitetschromatografi 20 (IMAC), er kommercielt tilgængelige. Typiske eksempler på harpikser, der er derivatiseret med iminodieddikesyre (IDA), er chelat-dannende Sepharose 6B (Pharmacia), immo-biliseret iminodieddikesyre I og II (Pierce) og Chelex 100 (bio-Rad). Desuden har Porath immobiliseret 25 tris(carboxymethylJethylendiamin (TED) på sepharose 6B J. Porath og B. Olin, Biochemistry 22, 1621-1630 (1983) og benyttet det til at fraktionere serumproteiner. Andre litteratursteder foreslår, at trisacryl GF2000 og silica kan derivatiseres med IDA, TED eller asparagin-30 syre, hvorefter de resulterende materialer kan anvendes til at frembringe IMAC-substanser (Small et al., Affinity Chromatography and Biological Recognition, Academic Press, Inc., 267-268 (1983); Vejayalakshmi, Affinity
Chromatography and Biological Recognition, Academic 35 Press, Inc., 269-273 (1983), og Moroux et al.. Affinity DK 171917 B1 16
Chromatography and Biological Recognition, Academic Press, Inc., 275-278 (1983)).
Af afgørende betydning for fremgangsmåden ifølge opfin-5 delsen er elueringen af præcursoren for det biologisk aktive polypeptid eller protein fra IMAC-kolonnen efter den selektive adsorption. Sædvanligvis kan man anvende to forskellige anerkendte elueringsmetoder: Pufferens pH- værdi kan sænkes, eller der kan sættes en forskydende 10 ligand til pufferen. Ved den førstnævnte metode vil den sænkede pH-værdi protonisere de koordinerende grupper, eksempelvis histidinets imidazol-ring på polypeptidet eller proteinet. De resulterende protoniserede ligander er ude af stand til at danne koordinerende kovalente bindin-15 ger med de immobiliserede metalioner. Polypeptiderne og proteinerne, som indeholder disse ligander, kan således vaskes fra kolonnen under anvendelse af en puffer med lav pH-værdi.
20 Hvis man sætter en fortrængende ligand til pufferen, fremkalder man en dissociation af polypeptiderne og proteinerne fra de immobiliserede metalioner. Denne metode er særligt nyttig, hvis det pågældende polypeptid eller protein ikke kan tåle omgivelser med lave pH-værdier.
25 Liganden udkonkurrerer og fortrænger polypeptidet eller proteinet på metalionens koordinationssteder, hvis den har en større affinitet for metalionen end det bundne po-lypeptid eller protein. Et eksempel på en sådan fortrængende ligand er ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Vis-30 se ligander kan fremkalde en sådan fortrængning, selv om deres bindingsaffinitet ikke er væsentligt større end affiniteten af det bundne polypeptid eller protein, hvis liganderne er til stede i et passende stort overskud i forhold til det bundne polypeptid eller protein. Som ek-35 sempler på sådanne ligander kan anføres glycin, histidin, ammoniak og lignende.
DK 171917 Bl 17
Opfindelsen, illustreres nærmere ved de følgende eksempler.
EKSEMPEL 1 5
Fremstilling af en IMAC-kolonne
Metalfri chelat-dannende harpikser (Sepharose 6B IDA, Pharmacia; Sepharose 4B IDA og Sephadex G25 IDA, Pierce) 10 leveres som vandige suspensioner, der indeholder enten ethanol eller natriumazid som konserveringsmiddel. Man fjernede konserveringsmidlet ved flere gange (3 til 5 gange) at resuspendere harpiksen i destilleret vand efter rotation af den konserveringsmiddel-holdige suspension 15 med langsom hastighed i en centrifuge. En 75% opslæmning af den konserveringsmiddel-fri harpiks blev fyldt på en 1 x 10 cm Econo-kolonne, hvorefter harpiksen blev vasket med 3 til 5 koloiinevoluminer destilleret vand.
20 Kolonnen blev fyldt med den valgte metalion Ni(II), Co(II) eller Cu(II) ved tilsætning af 1 ml af en vandig opløsning af 50 mM metalchlorid eller metalsulfat, indtil ca. 75% af kolonnen var mættet med farvet metalion. Eksempelvis for Ni(II) bevirkede en tilsætning af 3 ml af 25 en 50 nM NiCl2-opløsning, at de nederste 25% af kolonne forblev metalfri og tilgængelige for opsamling af dissocieret Ni(II). Den metalion-holdige kolonne blev vasket med destilleret vand og derefter med en puffer med høj pH-værdi (100 nM natriumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,5) og 30 en puffer med lav pH-værdi (100 mM natriumphosphat, 100 mM NaCl, pH 4,3). Kolonnen blev derefter forsynet med et strømningsregulerende mellemstykke og ækvilibreret med en puffer med høj pH-værdi, idet der anvendtes en peristal-tisk pumpe.
35 DK 171917 B1 18
Disse kolonner kan benyttes omkring 10 gange, uden at det er nødvendigt at regenerere kolonnen. Den chromatografi-ske ydeevne er ikke reproducerbar, efter at kolonnen har været udsat for mindst 10 cycler ved lave pH-værdier. Nye 5 kolonner blev frembragt ved stripning af kolonnen for metalioner med 2 til 4 ml 0,5 M EDTA, pH 8, efterfulgt af en ekstensiv udvaskning med vand. Derefter fremstilledes den friske kolonne som beskrevet ovenfor.
10 EKSEMPEL _2
Binding og eluerina af histidinholdige peptider
Stamopløsninger af flere histidinholdige di- og tripepti-15 der blev fremstillet i koncentrationer på omkring 1 mg/ml i en puffer med høj pH-værdi. En prøve på 200 μΐ af hver stamopløsning blev separat pumpet igennem en metalion-affinitetschromatografisk kolonne under anvendelse af en peristaltisk pumpe. Kolonnen blev derefter vasket med en 20 puffer med høj pH-værdi, indtil hele mængden af ikke-bundet materiale var blevet elueret eller, i de tilfælde hvor prøven havde bundet sig til kolonnen, indtil 10 ko-lonnevoluminer af pufferen havde passeret igennem ko-lonnnen. Derefter blev kolonnen vasket med en puffer med 25 lav pH-værdi, indtil hele mængden af bundet materiale var blevet elueret. Den udstrømmende væske fra kolonnen blev overvåget ved 2210 nm ved anvendelse af en Fracto-Scan monitor. Fraktioner på hver 50 dråber (omkring 1,6 ml) blev opsamlet ved hjælp af en Gilson fraktionsopsamler.
30 Man målte pH i hver fraktion, og i den efterfølgende tabel I er angivet de pH-værdier, ved hvilke hvert af de små histidinholdige peptider blev elueret fra hver af tre kolonner indeholdende immobiliserede metalioner. En elue-rings-pH-værdi på 7,5 indikerer en manglende binding til 35 den pågældende immobiliserede metalion.
TABEL I
DK 171917 B1 19
Elhatina-PH
Esptid Nim) CaLIXI Cu( 111
Gly-His 5,9 7,5 7,5 5 Gly-His-Gly 7,5 7,5 7,5
Gly-Gly-His 7,5 7,5 7,5
His-Gly 5,4 7,5 4,5
His-GlyNH2 7,5 7,5 4,6
His-Gly-His 4,8 5,9 4,4 10 Ala-His 5,8 7,5 7,5
His-Ala 7,5 7,5 4,6
His-Val 5,4 7,5 4,4
Leu-His 7,5 7,5 7,5
His-Leu 5,4 7,5 4,5 15 His-Ser 5,4 7,5 4,5
His-Glu 7,5 7,5 4,6
His-Lys 5,4 7,5 4,6
His-Phe 7,5 7,5 4,5
Tyr-His 5,7 7,5 7,5 20 His-Tyr 5,2 7,5 4,4
His-TyrNH2 4,7 6,4 4,4
His-Trp 4,9 6,4 4,4
Met-His 7,5 77,5 7,5
His-Met 5,3 7,5 4,6 25 EKSEMPEL 3
Bindincrskarakteristika for forskellige proteiner 30 Idet man anvendte en Ni(II) Sephadex G25 og Sepharose 4B kolonne som fremstillet i eksempel 1 og benyttede de i eksempel 2 beskrevne metoder, opnåede man de i nedenstående tabel II angivne data:
TABEL I
DK 171917 B1 20
Eluering-pH
Peptid Ni( IIV Cq( XI) Cu( IXJL
Gly-His 5,9 7,5 7,5 5 Gly-Hxs-Gly 7,5 7,5 7,5
Gly-Gly-His 7,5 7,5 7,5
His-Gly 5,4 7,5 4,5
His-GlyNH2 7,5 7,5 4,6
His-Gly-His 4,8 5,9 4,4 10 Ala-His 5,8 7,5 7,5
His-Ala 7,5 7,5 4,6
His-Val 5,4 7,5 4,4
Leu-His 7,5 7,5 7,5
His-Leu 5,4 7,5 4,5 15 His-Ser 5,4 7,5 4,5
His-Glu 7,5 7,5 4,6
His-Lys 5,4 7,5 4,6
His-Phe 7,5 7,5 4,5
Tyr-His 5,7 7,5 7,5 20 His-Tyr 5,2 7,5 4,4
His-TyrNH2 4,7 6,4 4,4
His-Trp 4,9 6,4 4,4
Met-His 7,5 77,5 7,5
His-Met 5,3 7,5 4,6 25 EKSEMPEL 3
Bindingskarakteristika for forskellige proteiner 30 Idet man anvendte en Ni(II) Sephadex G25 og Sepharose 4B kolonne som fremstillet i eksempel 1 og benyttede de i eksempel 2 beskrevne metoder, opnåede man de i nedenstående tabel II angivne data:
TABEL II
DK 171917 B1 21
Elueringsværdier for proteiner i Ni(II) IMAC-kolonner
Ni(II) IMAC eluerings-pH
5 Protein Sepharose 4B_Seohadex Q25.
A. Okseserumalbumin 6,05 7.5 B. Kulsyreanhydrase (okse) 4,95 10 7,5 C. Carboxypeptidase A (okse) 4,95 7.5 D. Cathepsin D (okse) n.d.
7.5 15 E. Ceruloplasmin (okse) 4,7-5,7b 7.5 F. Conalbumin (kylling) 7,5 7.5 G. Cytochrom c (hest) 7,5 20 7,5 H. Ferritin (hest) 7,5; 6,lc 7.5 I. γ-Globulin (kanin) 5,5 7.5 25 J. Insulin (svin) 3,65 7.5 K. Ovalbumin (kylling) 7,5 7.5 L. Pancreatisk trypsin-in- 30 hibitor (okse) 7,5 7.5
M. Thyroglobulin (okse) 7,5; 6,0C
7.5 N„ Transferrin (human) 5,05 35 7,5 DK 171917 B1 22 O. Tyrosinase (svamp) 6,0 7.5 P. Pancreatisk polypeptid (okse) n. d.
5 7,5 Q. Chymotrypsinogen A (okse) 7,5 7.5 R. Met-væksthormon (human) 6,05 7.5 10 S. Insulin A-kæde (S-CM) 7,5 7.5 T. Insulin B-kæde (S-CM) 5,05 7.5 U. Myoglobin (hest) 5,25 15 7,5 V. Proinsulin (human) 4,9 7.5 W. Superoxid-dismutase (okse) 7,5; 4,95c 7.5 20 X. Gær-lysat n.d.
7.5 Y. Alkohol-dehydrogenase) (bagegær) a n.d.
25 Z. Alkohol-dehydrogenase (hest) 7,5 n.d.
TABEL II (fortsat) 30
Elueringsværdier for proteiner i Ni(II) IMAC-kolonner
Ni(II) IMAC eluerings-pH
Protein Sepharose 4B_Sephadea G25 35 AA. Kulsyreanhydrase DK 171917 Bl 23 (human) 7,5 n.d.
BB. Cathepsin C (okse) 5,65 n.d.
5 CC. Ceruloplasmin (human) 5,6 n.d.
DD. Cytochrom c (tun) 7,5 n.d.
EE. Immunoglobulin G (human) 5,35 10 n.d.
FF. Lactalbumin (okse) 7,5 n.d.
GG. Lysozym (kylling) 7,5 n.d.
15 HH. Myoglobin (kaskelothval) 4,85 n.d.
II. Proinsulin S-sulfonat a n.d.
JJ. Ribonuclease A (okse) 7,5; 5,95c 20 n.d.
"Proteinet binder sig til kolonnen, men fælder ud ved surt pH. Proinsulin S-sulfonat blev elueret med EDTA.
25 bProteinet eluerer som tre overlappende toppe med det omgivne eluerings-pH-område.
cTo protein-toppe eluerer med en fordeling på ca. 60/40, således at begge eluerings-pH-værdier tages i betragt-30 ning.
n.d. = ikke bestemt.
DK 171917 Bl 24
Den anvendte Sephadex G25 kolonne har en øvre molekylvægtbaseret udelukkelsesgrænse på omkring 5000. Det er derfor ikke usædvanligt, at man ikke er i stand til at observere nogen binding af de ovenstående proteiner.
5
De resultater, som opnås ved anvendelse af Sepharose 4B kolonnen (stor øvre molekylvægtbaseret udelukkelse), bekræfter den uforudsigelige natur af de hidtil anvendte IMAC-separationer. Dette problem overvindes ved frem-10 gangsmåden ifølge opfindelsen.
EKSEMPEL 4
Sammenligning af bindings- og elueringskarakteristika 15 for fire beslægtede peptider
De følgende fire peptider blev undersøgt individuelt ved anvendelse af den ovenfor beskrevne Sephadex G25 IDA Ni(II) kolonne.
20 A. p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 B. His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 C. Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 D. Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 25
Peptiderne A, C og D undlod hver især at binde sig til det immobiliserede Ni(II). Peptidet B, som indeholder det N-terminale chelat-dannende His-Trp-peptid, bandt sig derimod tæt og lod sig eluere fra kolonnen ved pH 4,7 un-30 der anvendelse af pufferen med lav pH-værdi.
EKSEMPEL 5
Separation af et chelatdannende peptid fra en kompleks 35 blanding af det chelatdannende peptid og andre peptider og proteiner.
DK 171917 B1 25
Man fremstillede en protein- og peptidholdig blanding ved at blande 100 μΐ af hver proteinstamopløsning (omkring 1 mg/ml) med 30 μΐ af hver peptidstamopløsning (omkring 1 mg/ml). De proteiner, der er til stede i den resulterende 5 blanding, er de, der er betegnet A-0 i eksempel 3. De tilstedeværende peptider er følgende:
Gly-His-Gly, His-Ala, His-Glu, Met-His, Gly-Gly-His, Leu-His og His-Gly-NH2.
10
En prøve (omkring 500 μΐ) af den komplekse protein-peptid-blanding blev sat til 100 μΐ af His-Trp-stamopløsningen. Blandingen blev behandlet i en Ni(II) Sephadex G25 IDA kolonne fremstillet som beskrevet i ek-15 sempel 1, idet man anvendte de i eksempel 2 beskrevne betingelser. Man opsamlede fraktioner på hver 1,6 ml. Proteinerne blev fuldstændigt elueret ved pH 7,5 inden fraktion 10, mens de ikke-chelatdannende peptider blev elueret omkring fraktionerne 10-13. I modsætning hertil for-20 blev His-Trp i kolonnen, idet elueringen af His-Trp foregik omkring fraktionerne 70-75, efter at elueringsmidlets pH var blevet sænket under anvendelse af pufferen med en pH-værdi på 4,3 omkring fraktion 65.
25 EKSEMPEL 6
Separation af et polypeptid, der er kovalent bundet til et chelatdannende peptid, fra en kompleks blanding af et sådant polypeptid og andre peptider og proteiner.
30
Man fremstillede en blanding ved anvendelse af den i eksempel 5 beskrevne metode. Blandingen indeholdt polypep-tidet His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, proteinerne betegnet A-F, Η, I, K og M-0 i eksempel 3 og metal-35 lotheinin samt peptiderne (1) Gly-His-Gly, (2) His-Ala, (3) His-Glu, (4) Met-His, (5) Gly-Gly-His, (6) Leu-His, DK 171917 B1 26 (7) His-Gly-NH2, (8) Ala-His, (9) His-Lys, (10) His-Met, (11) Tyr-His, (12) His-Tyr, (13) His-Val, (14) His-Ser, (15) His-Leu, (16) His-Gly, (17) His-Phe og (18) Gly-His.
5 Blandingen blev separeret i overensstemmelse med den metode og de betingelser, der er beskrevet i eksempel 5. Under disse betingelser blev proteinerne og peptiderne 1-7 elueret før fraktion 20. Ved fraktion 50 blev pH sænket. Peptiderne 8-18 blev elueret omkring fraktionerne 10 50-55, og det udvalgte polypeptid, som indeholdt det
His-Trp-terminale chelatdannende peptid, blev elueret alene omkring fraktionerne 58-67.
EKSEMPEL ? 15
Separation af et polypeptid, der er kovalent bundet til et chelatdannende peptid, fra en blanding af strukturelt beslægtede peptider_ 20 Man fremstillede en blanding af de følgende peptider under anvendelse af den i eksempel 5 beskrevne metode: (1) His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 (2) Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 25 (3) Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2
Blandingen blev separeret i overensstemmelse med de i eksempel 5 beskrevne metoder og betingelser. Peptidet 3 blev elueret omkring fraktionerne 5-10, og peptidet 2 30 blev elueret omkring fraktionerne 11-20. Man sænkede pH omkring fraktion 40, hvorefter peptidet 1, som indeholdt det chelatdannende peptid, lod sig eluere omkring fraktionerne 47-54.
35 DK 171917 B1 27 EKSEMPEL 8
Binding og eluering af methionyl-histidinholdige peptider 5 Stamopløsninger af flere histidinholdige peptider med N-terminale methioninrester blev fremstillet som beskrevet i eksempel 2. Den anvendte Sepharose 4B IDA Ni(II) kolonne blev frisk fremstillet for hver prøve som beskrevet i eksempel 3. I den efterfølgende tabel III er angivet de 10 pH-værdier, ved hvilke hvert peptid blev elueret fra hver af disse fire kolonner, og de er sammenlignet med de tilsvarende histidin-terminale peptider. Disse resultater viser, at tilsætningen af en N-terminal methioninrest til det mest foretrukne chelatdannende peptid ikke i væsent-15 lig grad påvirker anvendelsen af sådanne chelat-dannende peptider i forbindelse med den foreliggende opfindelse.
DK 171917 B1 28
TabeUii
Sammenligning af chelatdannende peptider med methionylholdige peptider 5
Peptid Eluerings-pH
Co(II) Ni (II) Ni (II)a Cu(II) 10 His-Gly-His 5,9 4,8 4,55 4,4
Met-His-Gly-His 7,5 5,3 4,95 4,7
His-Phe 7,5 7,5 7,5 4,5
Met-His-Phe 7,5 7,5 7,5 7,5 15
His-Tyr-NH2 6,4 4,7 4,25 4,4
Met-His-Tyr-NH2 7,5 4,85 4,80 7,5
His-Trp 6,4 4,9 4,6 4,4 20 Met-His-Trp-NH2 7,5 4,8;3,75 5,15 7,5
“Sepharose 4B
EKSEMPEL 9 25
Separation af et protein, der er bundet kovalent til et chelatdannende peptid fra det samme protein, der ikke er bundet kovalent til et chelatdannende peptid.
30 En blanding indeholdende 100 μΐ af hver af bestanddelene proinsulin S-sulfonat og His-Trp-proinsulin S-sulfonat i 200 μΐ 0,1 M natriumphosphat, 0,1 M NaCl og 7 M urinstof (pH 7,5) blev indsprøjtet i en Sepharose 4B IDA Ni(II) kolonne, som var frisk fremstillet som beskrevet i eksem-35 pel 3, og som på forhånd var blevet ækvilibreret med den samme puffer. Derefter blev kolonnen vasket med urinstof- DK 171917 Bl 29 pufferen med høj pH-værdi, indtil hele mængden af ikke-bundet materiale var blevet elueret. Fraktioner på hver 2 ml blev opsamlet og analyseret for proinsulin ved HPLC og RIA. Derefter blev kolonnen vasket med en totrinsgradi-5 ent, frembragt på FPLC'en (hurtig protein-væskechromato-grafi), bestående af en puffer med pH-værdi (fra 0-35%)(0,1 M natriumphosphat, 0,1 M NaCl og 7 M urinstof, pH 2,6) med en slut pH-værdi på 6,4. Gradienten i andet trin gik fra 35 til 44%, idet man anvendte pufferen med 10 lav pH-værdi, og med en slut pH-værdi på mellem 5,3 og 4,9. Eluerings-pH-værdierne for proinsulin S-sulfonat og His-Trp-proinsulin S-sulfonat var henholdsvis 6,5 og 5,5.
t
DK535285A 1984-12-05 1985-11-20 Forbindelser, der kan anvendes til rensning af proteiner og fremgangsmåder, der anvender disse forbindelser DK171917B1 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67860284 1984-12-05
US06/678,602 US4569794A (en) 1984-12-05 1984-12-05 Process for purifying proteins and compounds useful in such process

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK535285D0 DK535285D0 (da) 1985-11-20
DK535285A DK535285A (da) 1986-06-06
DK171917B1 true DK171917B1 (da) 1997-08-11

Family

ID=24723484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK535285A DK171917B1 (da) 1984-12-05 1985-11-20 Forbindelser, der kan anvendes til rensning af proteiner og fremgangsmåder, der anvender disse forbindelser

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4569794A (da)
EP (1) EP0184355B1 (da)
JP (1) JPH0788400B2 (da)
AU (1) AU588840B2 (da)
CA (1) CA1252948A (da)
DE (1) DE3585147D1 (da)
DK (1) DK171917B1 (da)
HK (1) HK39192A (da)
HU (1) HU208025B (da)
IE (1) IE58501B1 (da)
IL (1) IL77104A (da)
SG (1) SG25792G (da)

Families Citing this family (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5279960A (en) * 1984-07-05 1994-01-18 Enzon Corp. 25 KD coccidial antigen of eimeria tenella
US4732974A (en) * 1986-03-05 1988-03-22 Mallinckrodt, Inc. Metal ion labeling of carrier molecules
US5047513A (en) * 1986-07-10 1991-09-10 Hoffmann-La Roche Inc. Metal chelate resins
CA1340522C (en) * 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
GB8706599D0 (en) * 1987-03-19 1987-04-23 Hoffmann La Roche Plasmodium falciparum merozoite antigen peptides
US5780038A (en) * 1987-11-16 1998-07-14 Roche Diagnostic Systems, Inc. HIV-2 envelope polypeptides
ES2054769T3 (es) * 1987-11-16 1994-08-16 Hoffmann La Roche Polipeptidos hiv-2 recombinantes.
JPH084519B2 (ja) * 1987-12-25 1996-01-24 エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー ハイブリッド形成用担体およびその調整方法
US4927879A (en) * 1988-02-25 1990-05-22 Purdue Research Foundation Method for solid phase membrane mimetics
US4931498A (en) * 1988-02-25 1990-06-05 Purdue Research Foundation Immobilized artificial membranes
US4952321A (en) * 1988-10-07 1990-08-28 Brigham Young University Process of removing and concentrating desired ions from solutions
US5169936A (en) * 1989-04-14 1992-12-08 Biogen, Inc. Protein purification on immobilized metal affinity resins effected by elution using a weak ligand
US5115102A (en) * 1989-07-21 1992-05-19 Monsanto Company Variant proteins and polypeptides possessing enhanced affinity for immobilized-metal affinity matrices
US6683046B1 (en) * 1989-12-22 2004-01-27 Hoffmann-La Roche Inc. Purification and characterization of cytotoxic lymphocyte maturation factor and monoclonal antibodies thereto
US5182369A (en) * 1990-02-28 1993-01-26 Monsanto Company Method for purifying somatotropin monomers
US5136025A (en) * 1990-04-04 1992-08-04 California Biotechnology Inc. Method to purify basic fibroblast growth factor
US5594115A (en) * 1990-04-09 1997-01-14 Pharmacia & Upjohn Company Process of purifying recombinant proteins and compounds useful in such process
DK0527778T3 (da) * 1990-04-09 1996-10-21 Upjohn Co Forbedret fremgangsmåde til rensning af rekombinante proteiner og forbindelser, som er anvendelige ved en sådan fremgangsmåde
US5972337A (en) * 1990-11-01 1999-10-26 Cancer Research Fund Of Contra Costa 46 kilodalton human milk fat globule (HMFG) antigen, fragments and fusion protein
SK60893A3 (en) * 1990-12-13 1993-10-06 Upjohn Co Fusion polypeptides
AU1332992A (en) * 1991-01-25 1992-08-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antigen recognized by patients with antibody associated cerebellar degeneration, dna encoding same and uses thereof
US5439829A (en) * 1991-01-30 1995-08-08 Eli Lilly And Company Immobilization of biologically active molecules by changing the Oxidation state of a chelated transition metal ion
EP0505151A3 (en) * 1991-03-19 1993-04-07 Eli Lilly And Company Preparation of the penicilline binding protein 2a from staphylococcus aureus 27r, purification and use in a resistant-assay
US6602861B1 (en) * 1992-04-16 2003-08-05 Research Corporation Technologies, Inc. Acylated phospholipid drugs
EP0583894A3 (en) * 1992-07-29 1995-09-06 Hybritech Inc Method of immobilizing and orienting molecules by use of metal chelating moieties to facilitate atomic force microscopy of proteins and molecular scale manipulation
US7070782B1 (en) * 1992-11-05 2006-07-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US7105159B1 (en) 1992-11-05 2006-09-12 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antibodies to prostate-specific membrane antigen
US6569432B1 (en) 1995-02-24 2003-05-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen and uses thereof
SE9303822D0 (sv) * 1993-11-18 1993-11-18 Kabi Pharmacia Ab Method for purification
US5449758A (en) * 1993-12-02 1995-09-12 Life Technologies, Inc. Protein size marker ladder
DE4433980C2 (de) * 1994-09-23 1996-08-22 Boehringer Ingelheim Int Verfahren und Biosensorhit zur Untersuchung der Wechselwirkung von Biomolekülen mittels Oberflächen-Plasma-Resonanz
US5837520A (en) * 1995-03-07 1998-11-17 Canji, Inc. Method of purification of viral vectors
US5753206A (en) * 1995-06-07 1998-05-19 Immunomedics, Inc. Radiometal-binding analogues of luteinizing hormone releasing hormone
US20040253246A1 (en) * 1996-02-23 2004-12-16 Israeli Ron S. Prostate-specific membrane antigen and uses thereof
ES2108652B1 (es) * 1996-04-19 1998-07-16 Antibioticos Sa Un procedimiento para modificar la enzima 7/3-(4-carboxibutanamido) cefalosporinacilasa y purificarla en un solo paso cromatografico.
PT821006E (pt) 1996-07-26 2004-09-30 Aventis Pharma Gmbh Derivados de insulina com ligacao a zinco aumentada
US20080261289A1 (en) * 1996-12-13 2008-10-23 Schering-Plough Corporation Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations
US6261823B1 (en) 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
USH2071H1 (en) * 1996-12-13 2003-07-01 Eli Lilly And Company Streptococcus pneumoniae gene HI0454
US6544769B1 (en) * 1996-12-13 2003-04-08 Schering Corporation Compostions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations
ES2308800T3 (es) 1997-01-08 2008-12-01 Invitrogen Corporation Metodos para la produccion de proteinas.
US5932102A (en) * 1998-01-12 1999-08-03 Schering Corporation Immobilized metal, affinity chromatography
US7026456B1 (en) * 1998-01-23 2006-04-11 Hoffman-La Roche, Inc. Antibodies against human IL-12
US6008329A (en) * 1998-03-06 1999-12-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Method for purifying cholera toxin
WO1999057992A1 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Clontech Laboratories, Inc. Compositions and methods for protein purification based on a metal ion affinity site
DE19825447A1 (de) * 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
US7176298B2 (en) 1998-09-25 2007-02-13 Clontech Laboratories, Inc. Polynucleotides encoding metal ion affinity peptides and related products
US7070937B1 (en) 1998-10-02 2006-07-04 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
US6475743B1 (en) 1998-10-02 2002-11-05 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
US20030215952A1 (en) * 1998-10-02 2003-11-20 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US20030215359A1 (en) * 1998-10-02 2003-11-20 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US7449338B2 (en) * 1998-10-02 2008-11-11 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US20050142613A1 (en) * 1998-10-02 2005-06-30 David Bar-Or Test for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US6479300B1 (en) 1999-03-15 2002-11-12 Millipore Corporation Metal loaded ligand bound membranes for metal ion affinity chromatography
US6379903B1 (en) 1999-10-08 2002-04-30 Sigma-Aldrich Co. Purification of recombinant proteins fused to multiple epitopes
US6635476B1 (en) 1999-10-15 2003-10-21 Canji, Inc. Targeted vectors
US6521111B1 (en) 2000-04-10 2003-02-18 Invitrogen Corporation Methods and articles for labeling polymer gels
US6623655B1 (en) 2000-04-24 2003-09-23 Sigma-Aldrich Co. Metal chelating compositions
WO2002014371A1 (de) * 2000-08-11 2002-02-21 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Fv-konstrukte mit beeinflussbarer affinität zu einer zu bindenden substanz
DE10040179A1 (de) * 2000-08-17 2002-02-28 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen Pflanzen
US20040180415A1 (en) * 2001-05-15 2004-09-16 Tchaga Grigoriy S. Methods and compositions for protein purification
CA2447594A1 (en) 2001-06-21 2003-01-03 Clontech Laboratories, Inc. Water-soluble polymeric metal ion affinity compositions and methods for using the same
US6902914B2 (en) * 2001-09-28 2005-06-07 Sigma-Aldrich, Co. Recombinant DNA processes using a dNTP mixture containing modified nucleotides
US7799561B2 (en) * 2002-06-12 2010-09-21 Sigma-Aldrich, Co. Affinity peptides and method for purification of recombinant proteins
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
PL377813A1 (pl) * 2002-11-26 2006-02-20 Biocon Limited Modyfikowane związki natriuretyczne, ich koniugaty oraz zastosowania
ITMI20030755A1 (it) * 2003-04-11 2004-10-12 Bottega Verde S R L Peptidi e loro derivati quali inibitori di fenomeni degradativi e composizioni contenenti gli stessi.
JP4078247B2 (ja) * 2003-05-02 2008-04-23 キヤノン株式会社 磁性体−生体物質複合体型構造体、磁性体に対して結合能を有するアミノ酸配列を有するペプチド断片及びその遺伝子、ならびに磁性体−生体物質複合体型構造体の製造方法
JP2006525807A (ja) * 2003-05-02 2006-11-16 シグマ−アルドリッチ・カンパニー 固相細胞溶解および捕捉プラットフォーム
US20040224425A1 (en) * 2003-05-08 2004-11-11 Gjerde Douglas T. Biomolecule open channel solid phase extraction systems and methods
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US7187286B2 (en) 2004-03-19 2007-03-06 Applera Corporation Methods and systems for using RFID in biological field
WO2006026248A1 (en) 2004-08-25 2006-03-09 Sigma-Aldrich Co. Compositions and methods employing zwitterionic detergent combinations
US7294614B2 (en) * 2004-10-12 2007-11-13 Clontech Laboratories, Inc. Phosphoprotein affinity resins and methods for making and using the same
WO2006056443A2 (en) * 2004-11-24 2006-06-01 Aplagen Gmbh Method for solid-phase peptide synthesis and purification
CA2592390A1 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Genentech, Inc. Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins
WO2006076471A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
JP2006239661A (ja) * 2005-03-07 2006-09-14 Pentax Corp 吸着剤、吸着剤の製造方法、吸着装置および吸着装置の製造方法
US7229769B2 (en) * 2005-03-25 2007-06-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity
US7741053B2 (en) * 2005-05-13 2010-06-22 Sigma-Aldrich Co. Processes for purification of recombinant proteins
US7265213B2 (en) * 2005-07-28 2007-09-04 Kpl, Inc. Methodology of conjugating chelators to biomolecules
AU2006301846A1 (en) * 2005-10-13 2007-04-19 Akshaya Bio Inc. Chimeric antigen containing hepatitis C virus polypeptide and FC fragment for eliciting an immune response
US20090239262A1 (en) * 2006-02-08 2009-09-24 Laxmi Srinivas Rao Affinity Polypeptide for Purification of Recombinant Proteins
GB0604187D0 (en) * 2006-03-02 2006-04-12 Fusion Antibodies Ltd Peptide and uses thereof
WO2007120999A2 (en) * 2006-03-06 2007-10-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Chelating monomers and polymers
EP1878739A1 (en) * 2006-07-14 2008-01-16 LEK Pharmaceuticals D.D. One step IMAC (MCAC) purification of proteins
US20110053225A1 (en) * 2008-01-24 2011-03-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Multifunctional tags
CN102088991A (zh) 2008-05-13 2011-06-08 堪萨斯大学 金属提取肽标签和相关方法
PT2456786E (pt) 2009-07-24 2014-03-25 Immune Design Corp Vetores lentivirais pseudotipados com uma glicoproteína do envelope do vírus sindbis
AU2012217723A1 (en) 2011-02-15 2013-08-29 Immune Design Corp. Methods for enhancing immunogen specific immune responses by vectored vaccines
CA2832307A1 (en) 2011-04-08 2012-10-18 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
US10100092B2 (en) 2011-11-03 2018-10-16 Vca, Inc. Compositions and methods to detect various infectious organisms
KR102070472B1 (ko) 2012-03-30 2020-01-29 이뮨 디자인 코포레이션 Dc-사인을 발현하는 세포에 대해 개선된 형질도입 효능을 갖는 렌티바이러스 벡터 입자
HU230585B1 (hu) 2012-05-30 2017-01-30 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas lantanida fémionokkal komplexált hordozók
WO2013181461A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 University Of Kansas Metal abstraction peptide with superoxide dismutase activity
CA2939093A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Immune Design Corp. Immunotherapy of cancer through combination of local and systemic immune stimulation
US20170196954A1 (en) 2014-07-15 2017-07-13 Immune Design Corp. Prime-boost regimens with a tlr4 agonist adjuvant and a lentiviral vector
AU2016354000A1 (en) 2015-11-09 2018-05-17 Immune Design Corp. Compositions comprising lentiviral vectors expressing IL-12 and methods of use thereof
KR20180074699A (ko) 2015-11-09 2018-07-03 이뮨 디자인 코포레이션 이종 핵산을 발현하는 rna 레플리콘의 발현 및 투여를 위한 레트로바이러스 벡터
CN117599868A (zh) 2018-01-30 2024-02-27 生命技术公司 用于智能分子分析系统的工作流中的仪器、装置和消耗品
EP3986465A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften E. V. Site-specific, kinetically inert conjugation of labels and/or carriers to target molecules such as his-tagged proteins via metal complex reagents
US20230076768A1 (en) 2020-01-14 2023-03-09 Synthekine, Inc. IL2 Orthologs and Methods of Use
WO2022031871A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Compositions and methods related to il27 receptor binding
EP4192880A2 (en) 2020-08-05 2023-06-14 Synthekine, Inc. Il10 receptor binding molecules and methods of use
US20230272090A1 (en) 2020-08-05 2023-08-31 Sandro Vivona Il2rb binding molecules and methods of use
CA3190415A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Il2rb/il2rg synthetic cytokines
JP2024504923A (ja) 2021-01-11 2024-02-02 シンセカイン インコーポレイテッド 受容体ペア形成に関する組成物および方法
WO2024086739A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Synthekine, Inc. Methods and compositions of il12 muteins and il2 muteins

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1048150B (it) * 1973-10-31 1980-11-20 O T I Officina Terapeutica Ita Metodo per l isolamento delle transferine da materiali biologici
US4172072A (en) * 1977-10-20 1979-10-23 Ashmead H H Buffered enzymatically produced metal proteinates
US4216143A (en) * 1977-10-20 1980-08-05 Ashmead H H Soluble non-ferrous metal proteinates
US4216144A (en) * 1977-10-20 1980-08-05 Ashmead H H Soluble iron proteinates
JPS5562902A (en) * 1978-11-07 1980-05-12 Toray Ind Inc Separation of endotoxin
JPS55148098A (en) * 1979-05-10 1980-11-18 Toray Ind Inc Concentration and purification of interferon
JPS5835157A (ja) * 1981-08-24 1983-03-01 Otsuka Pharmaceut Co Ltd ヒトリムホブラストイドインターフェロンのｎ末端ペプチド
GB2097279B (en) * 1981-04-27 1984-08-01 Health Lab Service Board Affinity chromatography in presence of metal ions
US4472509A (en) * 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
JPS59130254A (ja) * 1982-10-18 1984-07-26 Mitsubishi Chem Ind Ltd ポリペプチド
US4476116A (en) * 1982-12-10 1984-10-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Polypeptides/chelating agent nasal compositions having enhanced peptide absorption
GB8308483D0 (en) * 1983-03-28 1983-05-05 Health Lab Service Board Secretion of gene products
GB8311136D0 (en) * 1983-04-25 1983-06-02 Lepetit Spa Immobilised oligopeptides
JPS59206342A (ja) * 1983-05-10 1984-11-22 Mitsubishi Chem Ind Ltd ペプチド類

Also Published As

Publication number Publication date
JPS61148197A (ja) 1986-07-05
IE58501B1 (en) 1993-10-06
SG25792G (en) 1992-05-15
IL77104A (en) 1990-03-19
AU588840B2 (en) 1989-09-28
IE852913L (en) 1986-06-05
HU208025B (en) 1993-07-28
CA1252948A (en) 1989-04-18
HUT39462A (en) 1986-09-29
EP0184355B1 (en) 1992-01-08
AU5024085A (en) 1986-06-12
HK39192A (en) 1992-06-04
JPH0788400B2 (ja) 1995-09-27
DK535285A (da) 1986-06-06
IL77104A0 (en) 1986-04-29
EP0184355A2 (en) 1986-06-11
DE3585147D1 (de) 1992-02-20
EP0184355A3 (en) 1987-04-08
DK535285D0 (da) 1985-11-20
US4569794A (en) 1986-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK171917B1 (da) Forbindelser, der kan anvendes til rensning af proteiner og fremgangsmåder, der anvender disse forbindelser
JP4975895B2 (ja) 高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法
US5231178A (en) Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1
Hochuli Large-scale chromatography of recombinant proteins
JP4519646B2 (ja) プレプロインスリンの精製方法
Hopp et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification
US20100317827A1 (en) Method of Purifying a Peptide
JPH07108916B2 (ja) インヒビンおよびその精製法
CA2315306A1 (en) Process for the preparation in pure form of the protease activating blood clotting factor vii, its proenzyme or a mixture of both proteins by means of ion-exchange chromatography
US5446024A (en) Purification of insulin-like growth factor
Beitle et al. One-step purification of a model periplasmic protein from inclusion bodies by its fusion to an effective metal-binding peptide
US20220009958A1 (en) Methods of purification of albumin fusion proteins
Ueda et al. Ni (II)-based immobilized metal ion affinity chromatography of recombinant human prolactin from periplasmic Escherichia coli extracts
CN113416722A (zh) 一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺
US7771970B2 (en) Process for preparation of polypeptides of interest from fusion polypeptides
JP3576161B2 (ja) 固定化金属アフィニティ担体に対して増強されたアフィニティを有する変異蛋白質類およびポリペプチド類
Haymore et al. Introducing strong metal-binding sites onto surfaces of proteins for facile and efficient metal-affinity purifications
JP3346563B2 (ja) 組換え蛋白類を精製する改良方法および該方法で有用な化合物類
JP2021511785A (ja) 組換えポリペプチド生産用ｎ末端融合パートナーおよびこれを用いた組換えポリペプチドの生産方法
CN116429950B (zh) 多肽pd-dp-005的有关物质分析方法
AU685035B2 (en) A purification process of a human growth hormone
CN115819608A (zh) 一种纯化融合蛋白的方法
Hancock et al. Biochemical applications of preparative liquid chromatography
TWI612056B (zh) 自非乙醯化蛋白質分離乙醯化蛋白質
Wagner Recombinant production of amidated peptides

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired