CN102445500B - 一种检测注射用益气复脉中的大分子物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药学领域，涉及一种注射制剂的检测方法，具体涉及一种检测注射用益气复脉中的大分子物质的方法，本发明采用高效凝胶色谱法检测注射用益气复脉中的大分子物质，所述高效凝胶色谱条件为：色谱柱为Ultrahydrogel 250；流动相0.1mol·L^-1氯化钠溶液；流速0.3mL·min^-1；柱温30℃；示差折光检测器：40℃，进样量：20μL。

Description

一种检测注射用益气复脉中的大分子物质的方法

技术领域

本发明属于药学领域，涉及一种注射制剂的检测方法，具体涉及一种检测注射用益气复脉中的大分子物质的方法。

背景技术

中药制剂化学成分复杂，种类繁多，本身又多为大分子物质，这些大分子如蛋白质、多肽、糖、鞣质、果胶等既有免疫原性，又具有免疫反应性，因此具有致敏的可能性。中药注射剂直接作用于静脉，起效快，但是一旦有副作用，就会产生严重的后果。2009年7月，国家食品药品监督管理局出台了《中药注射剂安全性再评价质量控制要点》，明确要求对于具体品种的工艺条件下可能存在、而质量研究中未检出的大类成份，应建立排除性检查方法。必要时，应建立高分子量物质检查项。

本发明正是基于这一要求展开，建立了一种简便快捷的方法检测注射用益气复脉(冻干)中的大分子物质。

其中，所述注射用益气复脉(冻干)是由红参、麦冬、五味子制成的用于静脉滴注的中药复方制剂，具有益气复脉，养阴生津的疗效。主要用于冠心病劳累性心绞痛气阴两虚证，症见胸痹心痛，心悸气短、倦怠懒言、头晕目眩、面色少华、舌淡、少苔或剥苔，脉细弱或结代；冠心病所致慢性左心功能不全II、III级气阴两虚证，症见心悸、气短甚则气急喘促，胸闷隐痛，时作时止，倦怠乏力，面色苍白，动则汗出，舌淡、少苔或剥苔，脉细弱或结代。

注射用益气复脉(冻干)性状：本品为浅黄色的疏松块状物；有引湿性。取1瓶内容物，加水2～3ml溶解后，为棕红色澄明液体。用法用量：静脉滴注。每日1次，每次8瓶，用250ml～500ml 5％葡萄糖注射液或生理盐水稀释后静脉滴注。每分钟约40滴。疗程2周。

本发明采用高效凝胶色谱法，用来检测注射用益气复脉(冻干)中的大分子物质。本发明的检测方法操作上更加简便、快捷，而且准确性高，稳定性好。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测注射用益气复脉(冻干)中的大分子物质的方法。

本发明采用高效凝胶色谱法(HPGPC)检测注射用益气复脉(冻干)中的大分子物质。

本发明所述的检测注射用益气复脉中的大分子物质的方法，包括以下步骤：

1)对照品的制备

取右旋糖苷对照品，分子量分别为180，2500，4600，7100，10000，21400，41100，84400，133800，各自用氯化钠注射液配制成各自的溶液，其中水为重蒸水，氯化钠为分析纯；

2)供试品溶液的制备

称取注射用益气复脉，用氯化钠注射液溶解；

3)测定方法

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10-20ul注入凝胶色谱仪，记录色谱图。

其中，所述高效凝胶色谱条件为：

色谱柱为Ultrahydrogel 250 7.8*300mm；流动相0.1mol·L^-1氯化钠溶液；流速0.3mL·min^-1；柱温30℃；示差折光检测器：40℃，进样量：20μL。

依据凝胶色谱的分离原理：相同实验条件下，物质的分子量越大，保留时间越短；分子量越小，保留时间越长。示差折光检测器是高度稳定和灵敏的液相色谱和凝胶渗透色谱检测器，可用于检测在紫外光范围内吸光度不高的化合物，如聚合物、糖、有机酸和甘油三酸酯。示差折光检测器的偏转式设计，能够对那些具有低噪音和位移特性的化合物进行灵敏的检测。

对于中药注射剂中的大分子物质的排除性检测方法的确立，目前尚无法规性的方法可参照，本研究中的方法学验证以《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅧ中药质量标准分析方法验证指导原则为基础确立的。

本发明发现，图谱中样品出峰时间高于30分钟，可判断样品中无大分子物质或含量极低。

因此通过本发明提供的测定方法，通过保留时间的长短，可判断注射用益气复脉(冻干)中是否含有大分子物质。

本发明所述的检测方法，具有操作简便，灵敏度高，检测速度快，准确性强，专属性强，重复性好等诸多优点。

附图说明

图1、9个不同分子量右旋糖酐对照品及空白对照的液相图谱

图2、不同浓度2中右旋糖苷最低检测限对照品色谱图(A.右旋糖酐M4600，B.右旋糖酐M10000)

图3、5批注射用益气复脉(冻干)的测定色谱图

图4、样品在辅助注射液中的稳定性

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、检测方法

仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪，G1310A单元泵，G1322A在线脱气机，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1362A示差检测器，Mettle Toledo XS105电子天平。

试药

右旋糖苷对照品(Dextran Standard，分子量分别为180，2500，4600，7100，10000，21400，41100，84400，133800。中国药品生物制品检定所，批号2000-01)。水为重蒸水，氯化钠为分析纯。

供试品 注射用益气复脉(冻干)5批(批号分别为20080201、20080402、20080702、20090204、20090302、天津天士力之骄药业有限公司提供)，氯化钠注射液(批号：9G71C、中国大冢制药有限公司，市售)。

含量测定方法 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10-20ul注入凝胶色谱仪，记录色谱图。

色谱条件

色谱柱为Ultrahydrogel 250(7.8*300mm)；流动相0.1mol·L^-1氯化钠溶液；流速0.3mL·min^-1；柱温30℃；示差折光检测器：40℃。进样量：20μL。

实施例2、

专属性和线性考察

精密称取上述9份对照品用氯化钠注射液配制成各约1mg·mL^-1的溶液，同时取氯化钠注射液作空白对照溶液，分别进样，按上述条件测试，图谱如图1所示。以保留时间t_R为横坐标，右旋糖酐分子量的为纵坐标进行回归处理，得线性回归方程为：r＝0.991，测定结果见表1。

        表1 9钟不同分子量右旋糖酐对照品的保留时间

结果表明：空白对照溶液在相应的保留时间处均无干扰，右旋糖苷标准溶液在分子量180～133800范围内分子量与保留时间呈良好的线性关系。

精密度考察

精密称量分子量为4600和10000的右旋糖酐对照品，分别用氯化钠注射液溶解定容，得浓度为1.96mg·mL^-1和2.07mg·mL^-1的溶液，分别连续进样6次，测定保留时间，计算RSD，结果分子量为4600的右旋糖酐保留时间的RSD为0.83％，分子量为10000的RSD为1.06％。表明此方法的精密度良好。

最低检出限

取上述配制的右旋糖苷4600和1000对照品溶液，分别稀释至10倍、100倍、200倍、400倍、500倍，进样分析，色谱图如图2所示。

结果表明，二者在稀释到500倍时，样品峰消失，故可判断右旋糖苷对照品的最低检出限为约4μg·mL^-1。

稳定性考察

取上述两种右旋糖酐对照品溶液，分别在放置0小时、2小时、4小时和8小时后按上述条件进样测定，计算保留时间的RSD，结果分子量为4600的右旋糖酐保留时间的RSD为0.57％，分子量为10000的RSD为0.72％。表明此方法的稳定性良好。

样品测定

分别取5批注射用益气复脉(冻干)用氯化钠注射液配制成浓度约为1.0mg·mL^-1的溶液，0.45μm微孔滤膜滤过，20μL进样测定。样品色谱图如图3所示。

从谱图中看出所测5批注射用益气复脉(冻干)样品的出峰时间均高于30分钟，可判断样品中无大分子物质或含量极低。

样品稳定性考察

精密称取批号为20080201注射用益气复脉(冻干)，用氯化钠注射液溶解并定容至0.65mg·mL^-1。分别考察在0小时、2小时、4小时和8小时放置后样品在注射用氯化钠注射液中的稳定性。所测液相图谱见图4。

结果表明：样品溶解于氯化钠注射液中后在8小时测定内没有出现大分子物质，样品在此辅助注射溶剂中稳定性良好。

实验结果

依据凝胶色谱的分离原理：相同实验条件下，物质的分子量越大，保留时间越短；分子量越小，保留时间越长。示差折光检测器是高度稳定和灵敏的液相色谱和凝胶渗透色谱检测器，可用于检测在紫外光范围内吸光度不高的化合物，如聚合物、糖、有机酸和甘油三酸酯。示差折光检测器的偏转式设计，能够对那些具有低噪音和位移特性的化合物进行灵敏的检测。从HPLC图谱中可知所测5批注射用益气复脉(冻干)样品出峰时间高于30分钟，可判断注射用益气复脉(冻干)中无大分子物质。

对照品溶液和供试品溶液选用实施例1中的溶液。

实施例3、

对于中药注射剂中的大分子物质的排除性检测方法的确立，目前尚无法规性的方法可参照，本研究中的方法学验证以《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅧ中药质量标准分析方法验证指导原则为基础。

实施例4、

中药注射剂致机体过敏物质很多，一般分为完全抗原和半抗原两种，完全抗原多为大分子物质，分子量大于10000，如动物蛋白、多肽等，进入人体内能直接使人体致敏；半抗原为小分子化学物质，而大多数中药为低分子量化合物，进入人体后必须先与某些大分子物质如蛋白质等作为载体相结合，才能形成半抗原-载体复合物，引起机体对该种药物的特异性免疫反应[5]。故本发明中选择分子量为5000(实际为4600)和10000的两个右旋糖酐对照品做方法学验证。

实施例5、

因为是大分子物质的排除性检测，故在本发明中对精密度、最低检测限和稳定性的考察均用对照品的相应测定表示。

实施例6、

注射用益气复脉(冻干)在临床使用时规定用氯化钠注射液做辅助注射剂，故本发明中选择用氯化钠注射液做相应溶剂和空白对照。

实施例7、

本发明分别比较了0.1mol·L^-1氯化钠溶液、0.7％硫酸钠溶液作流动相之后，在以氯化钠注射液做溶剂时0.1mol·L^-1氯化钠溶液做流动相效果更好。

实施例8、

本发明还考察了一下样品在辅助注射剂中溶解之后的稳定性，以说明样品在用氯化钠注射液中溶解后8小时内没有发生聚凝和沉淀等变化。

Claims (6)

1.一种检测注射用益气复脉中的大分子物质的方法，包括以下步骤：

1)对照品的制备

取右旋糖苷对照品，分子量分别为180，2500，4600，7100，10000，21400，41100，84400，133800，各自用氯化钠注射液配制成各自的溶液，其中水为重蒸水，氯化钠为分析纯；

2)供试品溶液的制备

称取注射用益气复脉，用氯化钠注射液溶解；

3)测定方法

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10-20μL注入凝胶色谱仪，记录色谱图，其中色谱条件为：色谱柱为Ultrahydrogel2507.8*300mm；流动相0.1mol·L^-1氯化钠溶液；流速0.3mL·min^-1；柱温30℃；示差折光检测器：40℃，进样量：20μL。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，对照品的制备如下：精密称取9份对照品用氯化钠注射液配制成各1mg·mL^-1的溶液。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，供试品溶液的制备如下：取注射用益气复脉用氯化钠注射液配制成浓度为1.0mg·mL^-1的溶液，0.45μm微孔滤膜滤过。

4.权利要求1的检测方法在测定注射用益气复脉中是否含有大分子物质中的应用。

5.权利要求4的应用，其特征在于，通过测定供试品溶液的保留时间判定其中是否含有大分子物质。

6.权利要求5的应用，其特征在于，保留时间大于30分钟能够判定不存在大分子物质。