CN104730167A - 一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法及其质量控制标准 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法及其质量控制标准，属于药物分析技术领域。为了准确反映盐酸氯卡色林原料药中对映异构体的含量，可以为质量标准的制定提供合理的依据，以便能够更好的控制和掌握产品质量，从而提高临床用药的安全性，本发明提供一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法及其质量控制标准。该检测方法具有较高的准确度和精密度，耐用性强，适合工业上用于盐酸氯卡色林对映异构体的检查及质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法及其质量控制标准，属于药物分析技术领域。
背景技术
肥胖已经成为一个世界性的问题，2/3的美国成人肥胖或超重，根据世界卫生组织的统计，2008年中国20岁以上人群中有25.4％的人体重超重，额外的体重可增加高血压、糖尿病、高脂血症、卒中、心脏病、骨关节炎的风险。由美国Arena公司开发的盐酸氯卡色林(lorcaserin hydrochloride，BelviqTM)是一种新型治疗肥胖的药物，于2012年6月27日被美国FDA批准上市，作为肥胖或合并至少1项体重相关并发症的超重的成人在低热量饮食和运动基础上的辅助治疗。盐酸氯卡色林是选择性5-羟色胺2C(5-HT2C)受体激动剂，是1999年之后FDA批准的首个减肥药物，其疗效确切，心血管安全性良好。其化学名称为(R)-8-氯-l-甲基-2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮杂卓盐酸盐，结构式如下所示：
氯卡色林是新型的5-HT2C选择性激动剂，通过5-羟色胺通路减少食物摄入，从而减轻体重。临床研究显示，盐酸氯卡色林单用或联合生活方式干预，对肥胖和超重的人群可有效减轻体重，并改善肥胖相关的代谢指标，如血糖、血压和血脂等。一项为期12周随机、双盲、安慰剂对照的平行组研究，对氯卡色林在肥胖患者中的有效性和安全性进行了评估。该研究排除了有需要治疗的慢性疾病的患者(稳定的高血压和/或血脂异常的治疗者除外)，排除患糖尿病、医院焦虑和抑郁量表≥12分(总分34分)、有减重手术史、既往使用过芬氟拉明或右芬氟拉明以及4周内饮食与活动发生显著变化的受试者。该研究纳入469例年龄在18～65岁之间，体重指数(BMI)在30～45kg/m2的肥胖受试者，随机分为4组，分别服用氯卡色林10mgqd，15mgqd，10mgbid和安慰剂，治疗期间维持平时的饮食和活动。治疗12周后，与安慰剂组相比，氯卡色林组的减重效果显著，各组体重分别下降1.8，2.6和3.6kg，而安慰剂组仅下降0.3kg。此外，氯卡色林组的受试者体重较基础体重下降达到5％的比例分别是12.8％，19.5％和31.2％，而安慰剂组仅2.3％。
氯卡色林化合物溶解性和通透性都非常好，是生物药剂学分类系统中的Ⅰ类药物。总体而言，盐酸氯卡色林在患者和健康志愿者中都有很好的耐受性。许多报道的与氯卡色林治疗相关副反应均为作用于5-羟色胺而引起的常见且轻微或中度副反应。体内试验表明，氯卡色林对大鼠肝脏中的CYP酶有诱导作用，但体外试验显示，氯卡色林对于人体肝细胞的CYP酶最多是一个弱的诱导剂，仅超治疗浓度20μM。临床试验中没有出现肝毒性。综合3期试验的安全性数据，发现用药10mg BID组的AST、ALT和碱性磷酸酶出现小而明显的减少。由于氯卡色林是单一对映体，控制其原料药中的杂质含量特别是其对映异构体的含量对于降低其不良反应具有重要的意义。基于此，本发明提供一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法及其质量控制标准。
发明内容
为了准确反映盐酸氯卡色林原料药中对映异构体的含量，可以为质量标准的制定提供合理的依据，以便能够更好的控制和掌握产品质量，从而提高临床用药的安全性，本发明提供一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法及其质量控制标准。该检测方法具有较高的准确度和精密度，耐用性强，适合工业上用于盐酸氯卡色林对映异构体的检查及质量控制。
本发明通过下述技术方案实现上述目的的：
盐酸氯卡色林是选择性5-羟色胺2C(5-HT2C)受体激动剂，其化学名称为(R)-8-氯-l-甲基-2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮杂卓盐酸盐。本发明所述的盐酸氯卡色林对映异构体与盐酸氯卡色林呈镜像对称，其化学式为C11H14ClN·HCl，其化学名称为(S)-8-氯-l-甲基-2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮杂卓盐酸盐。本发明所提供的一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法，其包括如下步骤：
1)系统适用性试验溶液的制备：取盐酸氯卡色林对映异构体使用乙醇为溶剂配制成0.5mg/ml的异构体储备溶液；另取盐酸氯卡色林对照品,并按照质量体积比为5︰1的比例加入异构体储备溶液，使用乙醇溶解至盐酸氯卡色林浓度为0.5mg/ml，作为系统适用性溶液；
2)对映异构体对照品溶液的制备：取盐酸氯卡色林对映异构体对照品使用乙醇为溶剂稀释至盐酸氯卡色林对映异构体的浓度为0.25mg/ml；精密量取上述溶液，以乙醇为溶剂并以1︰100的稀释比稀释后作为盐酸氯卡色林对映异构体对照品溶液；
3)供试品溶液的制备：精密称取盐酸氯卡色林使用乙醇为溶剂配制成盐酸氯卡色林浓度为0.5mg/ml的溶液，作为供试品溶液。
4)色谱条件与系统适用性试验：采用手性柱(CHIRALPAK IF 4.6×250mm)，正己烷-乙醇-乙醇胺为流动相，流量1.0ml/min，检测波长为222nm，其中理论塔板数按盐酸氯卡色林峰计应不低于2000，系统适应性试验中的盐酸氯卡色林峰与其对映异构体峰的分离度应符合规定；
5)盐酸氯卡色林对映异构体测定：取上述对映异构体对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量。
上述所述的一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法，其具体包括如下步骤：
1)系统适用性试验溶液的制备：取盐酸氯卡色林对映异构体对照品25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，精密移取10ml置200ml容量瓶中，用乙醇稀释定容至刻度，作为异构体储备溶液；另取盐酸氯卡色林对照品25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加入异构体储备液5ml，用乙醇溶解并稀释至刻度，作为系统适用性溶液；
2)对映异构体对照品溶液的制备：取盐酸氯卡色林对映异构体对照品25mg,精密称定，置100ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为盐酸氯卡色林对映异构体对照品溶液；
3)供试品溶液的制备：取盐酸氯卡色林25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
4)色谱条件与系统适用性试验：采用手性柱(CHIRALPAK IF 4.6×250mm)，正己烷-乙醇-乙醇胺(90/10/0.1，V/V/V)为流动相，流量1.0ml/min，检测波长为222nm；理论塔板数按盐酸氯卡色林峰计应不低于2000，系统适应性试验中的盐酸氯卡色林峰与其对映异构体峰的分离度应符合规定；
5)盐酸氯卡色林对映异构体测定：取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，盐酸氯卡色林与盐酸氯卡色林对映异构体的分离度应符合要求；取上述对映异构体对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液图谱中如显与对照溶液图谱中对映异构体峰相应保留时间的峰，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量。
本发明还提供一种盐酸氯卡色林对映异构体的质量控制标准，其中盐酸氯卡色林对映异构体的含量测定上述所述的检测方法。采用上述检测方法测定时，所述盐酸氯卡色林对映异构体的含量不得超过0.5％。为更加严格的控制产品质量，保证用药安全性，并结合进口质量标准及药典标准，将对映异构体检查的标准提高为不得过0.2％。
实验例1检测方法中流动相筛选
参考有关文献对盐酸氯卡色林对映异构体检查的流动相进行了筛选。试验结果见表1。
表1 盐酸氯卡色林对映异构体检查色谱条件选择
实验结果发现，当流动相为正己烷-乙醇-乙醇胺(90:10:0.1，V/V/V)时，所获的得HPLC图谱中主峰峰型好，保留时间合适，且主峰与杂质峰的分离达到了较好的效果。因此将正己烷-乙醇-乙醇胺(90:10:0.1，V/V/V)确定为盐酸氯卡色林异构体杂质检查的最终流动相条件。
实验例2检测波长选择
取盐酸氯卡色林及盐酸氯卡色林对映异构体对照品适量，分别用乙醇溶解并稀释成浓度约为10μg/ml的溶液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录ⅣA)，分别在200～400nm波长范围内扫描。扫描结果发现，盐酸氯卡色林及其对映异构体在222nm波长处有最大吸收，因此选择222nm为异构体杂质检查的检测波长。
附图说明
图1为盐酸氯卡色林与其对映异构体的分离度色谱图，其中tR为7.895的为盐酸氯卡色林的对映异构体，tR为9.376的为盐酸氯卡色林。检测器A通道1的检测波长为222nm
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述技术领域人员应能知晓，所述的实施例并不以任何方式限定本发明，本发明的技术保护范围以权利要求书为准。
实施例1本发明所述的盐酸氯卡色林对映异构体检测方法的方法学考察
1.1方法专属性试验
分离度试验：取盐酸氯卡色林与其对映异构体对照品适量，分别用乙醇配成一定浓度的溶液，在选定色谱条件下进样20μl，记录色谱图；再配制两者的混合溶液，在上述色谱条件下进样，记录色谱图。色谱如附图1所示，结果盐酸氯卡色林峰与其对映异构体峰的分离度为5.8，分离度良好。
1.2准确度试验
取盐酸氯卡色林原料，按三个梯度水平加入盐酸氯卡色林异构体对照品，按拟定的异构体测定方法进行测定。具体方法如下：
取盐酸氯卡色林对映异构体对照品约25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，精密移取10ml置200ml容量瓶中，用乙醇稀释定容至刻度，摇匀，作为异构体储备溶液；称取盐酸氯卡色林原料约25mg共三份，精密称定，置三个50ml量瓶中，分别加入上述对映异构体对照品储备液4ml、5ml和6ml制成80％、100％和120％的三个浓度水平，分别用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为回收率测定供试品溶液，每个浓度水平重复三次。称取盐酸氯卡色林对映异构体对照品约25mg，置100ml量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对映异构体对照品溶液；另取盐酸氯卡色林原料25mg，置50ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品对照溶液。
依色谱条件，分别取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，据测得量和实际加入量计算回收率。试验结果见表2。结论：本法准确度良好，符合测试要求。
表2 盐酸氯卡色林对映异构体准确度试验
1.3精密度试验
1.3.1.重复性试验
取盐酸氯卡色林对映异构体对照品约25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，精密移取10ml置200ml容量瓶中，用乙醇稀释定容至刻度，作为异构体储备溶液；取盐酸氯卡色林样品约25mg，共6份，精密称定，置6个50ml容量瓶中，分别加入异构体储备液5ml，用乙醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；另精密称取异构体杂质对照品25mg，置100ml容量瓶中，精密移取1ml至100ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，作为对映异构体对照品溶液；分别精密量取对映异构体对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪中，记录色谱图，对结果进行评价。试验结果见表3。结论：6次测量结果的RSD％为1.07％，符合验证方案要求，证实该方法具有一定的精密度。
表3 盐酸氯卡色林对映异构体重复性试验
1.3.2.进样精密度
取盐酸氯卡色林对映异构体对照品约25mg，精密称定，置100ml容量瓶中，用乙醇溶解定容至刻度，精密移取1ml该溶液置100ml容量瓶中，用乙醇定容至刻度，配制成浓度为2.5μg/ml的溶液，依法测定，连续进样5次，每次20μl，记录峰面积，并对结果进行评价，试验结果见表4。结论：本法精密度良好，符合测试要求。
表4 盐酸氯卡色林对映异构体进样精密度试验结果
1.4线性与范围
取盐酸氯卡色林对映异构体对照品适量，精密称定，用乙醇溶解并稀释制成浓度范围为0.05μg/ml～10.01μg/ml的溶液作为系列标准溶液。依色谱条件，分别精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度C(μg/ml)为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，并计算回归方程和相关系数。试验结果见表5。
表5 盐酸氯卡色林对映异构体线性与范围试验结果
结果表明：在0.05μg/ml～10.01μg/ml的范围内，y＝93598.8077x+2476.7017，R2＝0.9996，盐酸氯卡色林对映异构体的线性关系良好。
1.5定量限和检测限
调节仪器灵敏度，用乙醇配制成一定浓度的盐酸氯卡色林对映异构体溶液，逐步稀释后进样20μl，使主峰高为基线噪音的3倍左右，记录色谱图，得盐酸氯卡色林对映异构体的最小检测限为0.2ng。
调节仪器灵敏度，用乙醇配制成一定浓度的盐酸氯卡色林对映异构体溶液，逐步稀释后进样20μl，使主峰高为基线噪音的10倍左右，记录色谱图，得盐酸氯卡色林对映异构体的最小定量限为1.0ng。
1.6溶液稳定性试验
1.6.1.盐酸氯卡色林对映异构体标准溶液稳定性
取盐酸氯卡色林异构体对照品约25mg，精密称定，置100ml容量瓶，用乙醇定容稀释至刻度，精密移取1ml该溶液到100ml容量瓶用乙醇定容至刻度,作为标准溶液。分别于0、2、4、8、12、24小时，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表6。
表6 标准溶液稳定性
结论：盐酸氯卡色林对映异构体的乙醇溶液室温放置24小时，稳定性良好。
1.6.2.盐酸氯卡色林供试品溶液稳定性
称取盐酸氯卡色林原料约25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用乙醇稀释定容至刻度，配制成浓度约为2.5μg/ml的供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24小时，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表7。结论：盐酸氯卡色林供试品的乙醇溶液室温放置24小时，稳定性良好。
表7 盐酸氯卡色林供试品溶液稳定性
1.7耐用性试验
通过改变流动相比例、流速、柱温来评估测定条件微小变动时，测定结果不受影响的承受程度。在每个条件下，分别取盐酸氯卡色林及其对映异构体对照品适量，精密称定，用乙醇溶解并稀释制成每ml中含盐酸氯卡色林0.5mg和异构体2.5μg的溶液，作为供试品溶液；另取异构体杂质对照品适量，精密称定，用乙醇溶解并稀释制成每1ml中含2.5μg的溶液作为异构体对照品溶液，分别精密量取异构体对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪中，记录色谱图，对结果进行评价。试验结果见表8。结论：本法耐用性良好，符合测试要求。
表8 盐酸氯卡色林对映异构体耐用性试验
实施例2本发明盐酸氯卡色林对映异构体检测方法及其质量检查
一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法，其具体包括如下步骤：
1)系统适用性试验溶液的制备：取盐酸氯卡色林对映异构体对照品25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，精密移取10ml置200ml容量瓶中，用乙醇稀释定容至刻度，作为异构体储备溶液；另取盐酸氯卡色林对照品25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加入异构体储备液5ml，用乙醇溶解并稀释至刻度，作为系统适用性溶液；
2)对映异构体对照品溶液的制备：取盐酸氯卡色林对映异构体对照品25mg，精密称定，置100ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为盐酸氯卡色林对映异构体对照品溶液；
3)供试品溶液的制备：取盐酸氯卡色林25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
4)色谱条件与系统适用性试验：采用手性柱(CHIRALPAK IF 4.6×250mm)，正己烷-乙醇-乙醇胺(90/10/0.1，V/V/V)为流动相，流量1.0ml/min，检测波长为222nm；理论塔板数按盐酸氯卡色林峰计应不低于2000，系统适应性试验中的盐酸氯卡色林峰与其对映异构体峰的分离度应符合规定；
5)盐酸氯卡色林对映异构体测定：取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，盐酸氯卡色林与盐酸氯卡色林对映异构体的分离度应符合要求；取上述对映异构体对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液图谱中如显与对照溶液图谱中对映异构体峰相应保留时间的峰，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量。
使用上述检测方法对三批样品及稳定性样品对映异构体检查结果见表9和表10。
表9 盐酸氯卡色林样品对映异构体检查结果
| 批号 | 20140401 | 20140402 | 20140403 | 对照品 |
| 对映异构体 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
表10 盐酸氯卡色林稳定性样品对映异构体检查结果
结论：本品对映异构体检查初始拟定的标准为不得过0.5％，但经过加速及长期放样的多批次检验，均未检出对映异构体，为更加严格的控制产品质量，保证用药安全性，并结合进口质量标准及药典标准，将对映异构体检查的标准提高为不得过0.1％。
Claims (5)
1.一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1)系统适用性试验溶液的制备：取盐酸氯卡色林对映异构体使用乙醇为溶剂配制成0.5mg/ml的异构体储备溶液；另取盐酸氯卡色林对照品，并按照质量体积比为5︰1的比例加入异构体储备溶液，使用乙醇溶解至盐酸氯卡色林浓度为0.5mg/ml，作为系统适用性溶液；
2)对映异构体对照品溶液的制备：取盐酸氯卡色林对映异构体对照品使用乙醇为溶剂稀释至盐酸氯卡色林对映异构体的浓度为0.25mg/ml；精密量取上述溶液，以乙醇为溶剂并以1︰100的稀释比稀释后作为盐酸氯卡色林对映异构体对照品溶液；
3)供试品溶液的制备：精密称取盐酸氯卡色林使用乙醇为溶剂配制成盐酸氯卡色林浓度为0.5mg/ml的溶液，作为供试品溶液。
4)色谱条件与系统适用性试验：采用手性柱CHIRALPAK IF，4.6×250mm，正己烷-乙醇-乙醇胺为流动相，流量1.0ml/min，检测波长为222nm；
5)盐酸氯卡色林对映异构体测定：取上述对映异构体对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量。
2.如权利要求1所述的一种盐酸氯卡色林对映异构体检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1)系统适用性试验溶液的制备：取盐酸氯卡色林对映异构体对照品25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，精密移取10ml置200ml容量瓶中，用乙醇稀释定容至刻度，作为异构体储备溶液；另取盐酸氯卡色林对照品25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加入异构体储备液5ml，用乙醇溶解并稀释至刻度，作为系统适用性溶液；
2)对映异构体对照品溶液的制备：取盐酸氯卡色林对映异构体对照品25mg，精密称定，置100ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为盐酸氯卡色林对映异构体对照品溶液；
3)供试品溶液的制备：取盐酸氯卡色林25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
4)色谱条件与系统适用性试验：采用手性柱(CHIRALPAK IF 4.6×250mm)，正己烷-乙醇-乙醇胺(90/10/0.1，V/V/V)为流动相，流量1.0ml/min，检测波长为222nm；理论塔板数按盐酸氯卡色林峰计应不低于2000，系统适应性试验中的盐酸氯卡色林峰与其对映异构体峰的分离度应符合规定；
5)盐酸氯卡色林对映异构体测定：取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，盐酸氯卡色林与盐酸氯卡色林对映异构体的分离度应符合要求；取上述对映异构体对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液图谱中如显与对照溶液图谱中对映异构体峰相应保留时间的峰，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量。
3.一种盐酸氯卡色林的质量控制标准，其特征在于，所述的盐酸氯卡色林对映异构体的含量测定采用权利要求1或2所述的检测方法。
4.如权利要求3所述的质量控制标准，其特征在于，所述的盐酸氯卡色林对映异构体的含量在盐酸氯卡色林原料药中的含量不得超过0.5％。
5.如权利要求4所述的质量控制标准，其特征在于，所述的盐酸氯卡色林对映异构体的含量在盐酸氯卡色林原料药中的含量不得超过0.1％。
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