CN108333289A - 一种多组分检测控制蛴螬含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多组分检测控制蛴螬含量的方法,该方法为定量测定蛴螬中尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷成分,检测时色谱条件为,Waters HSS T3色谱柱;检测波长为260 nm;流速为1.0 mL·min‑1;柱温为30℃;进样量为5µL;以乙腈为流动相A,水为流动相B进行梯度洗脱;该测定方法简单、专属性强、分离效果好,精密度、重现性高,稳定性良好,能够有效的为蛴螬药材的质量评价提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于中药材技术领域中质量检测方法,具体涉及了一种多组分检测控制蛴螬含量的检测方法。
背景技术
蛴螬为金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子Holotrichia diomphalia Bates的干燥幼虫,收载于《中药大辞典》下册,第二版3224页,为我国习用药材,具有破瘀、散结、止痛和解毒的功效,外用可治疗丹毒、痔漏、跌打损伤。内服可用于妇女经闭、症瘕。主血瘀经闭,症瘕;折伤瘀痛;痛风;破伤风;喉痹;痈肿;丹毒等。在治疗眼部疾病以及抗肿瘤、提高免疫力等方面具有良好作用。
蛴螬为成方制剂大黄虫丸、大虻虫丸、干漆丸、山茱萸丸、天浆子丸等的组方用药,蛴螬被列入《中国药典》附录中。现有地方标准收录该药材,这些标准中含量测定采用定氮法测定,为蛋白质通用方法。少量文献报道中,蛴螬采用氨基酸测定进行质量评价,但针对蛴螬的质量控制不具有专属性研究,而且未见有采用高效液相色谱法测定含量的报道。因蛴螬未有完善的质量标准控制方法,地方标准不具有专属性,且国内数十家药品企业生产的中成药中均用到了蛴螬药材,鉴于企业发展与需求,建立蛴螬的质量标准,有助于推行业的规范与发展,为质量评价和控制提供科学、有效的方法和依据。此外,建立蛴螬质量标准对于提升药品质量起到关键作用,具有重要的社会效益和经济效益。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了一种多组分检测控制蛴螬含量的检测方法,具体包括以下步骤:
步骤1、尿嘧啶对照品溶液的制备:精密称取尿嘧啶对照品6.01mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得尿嘧啶对照品溶液;
步骤2、胞苷对照品溶液的制备:精密称取胞苷对照品5.03mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得胞苷对照品溶液;
步骤3、次黄嘌呤对照品溶液的制备:精密称取次黄嘌呤对照品10.05mg,置50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得次黄嘌呤对照品溶液;
步骤4、黄嘌呤对照品溶液的制备:精密称取黄嘌呤对照品10.08mg,置50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得黄嘌呤对照品溶液;
步骤5、尿苷对照品溶液的制备:精密称取尿苷对照品5.02mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得尿苷对照品溶液;
步骤6、肌苷对照品溶液的制备:精密称取肌苷对照品5.09mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得肌苷对照品溶液;
步骤7、鸟苷对照品溶液的制备:精密称取鸟苷对照品5.04mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得鸟苷对照品溶液;
步骤8、混合对照品溶液制备:分别精密吸取尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷对照品溶液各1ml,至10ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得混合对照品溶液;
步骤9、供试品溶液的制备:称取混匀蛴螬药材细粉(过五号筛)0.5021g,置具塞锥形瓶中,精密加入超纯水50mL,混匀,50℃超声处理30min,放冷,离心机14000rpm,离心5min,0.45μm微孔滤膜滤过即得;
步骤10、高效液相色谱测定:
色谱条件:Waters HSS T3(4.6×250mm,5μm)为色谱柱;检测波长为260nm;流速为1.0mL·min-1;柱温为30℃;进样量为5μL;以乙腈为流动相A,水为流动相B,进行梯度洗脱;
步骤11、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5μl,注入液相色谱,测定,记录40min的色谱图,即得。
本发明的优点和有益效果为:本发明所述方法采用尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷进行含量控制,多组分测定方法可兼具有指纹图谱定性鉴别意义。其测定方法简单、专属性强、分离效果好,精密度、重现性高,稳定性良好,能够有效的为蛴螬药材的质量评价提供科学依据。
附图说明
图1尿嘧啶线性回归方程;
图2胞苷线性回归方程;
图3次黄嘌呤线性回归方程;
图4黄嘌呤线性回归方程;
图5尿苷线性回归方程;
图6肌苷线性回归方程;
图7鸟苷线性回归方程;
图8混合对照品高效液相色谱图;
图9编号为1供试品高效液相色谱图;
其中,图8、图9中1为尿嘧啶、2为胞苷、3为次黄嘌呤、4为黄嘌呤、5为尿苷、6为肌苷、7为鸟苷。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述,以便本领域的技术人员更了解本发明,但并不以此限制本发明。
实施例1
1、仪器与试药
1.1仪器:Ultimate 3000型液相色谱仪(Thermo公司),二极管阵列检测器(Thermo公司);eppendorf5424型离心机(德国艾本德股份公司),MSE125S型十万分之一电子天平(Sartorius公司),KQ-500DV型超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司),Milli-Q去离子水发生器(密理博公司)。
1.2试药与试剂:尿嘧啶(批号:100469-201302)、次黄嘌呤(批号:140661-200903)、黄嘌呤(批号:140662-200802)、尿苷(批号:110887-200202)、肌苷(批号:140669-201305;含量为99.1%)、鸟苷(批号:111977-201501;含量为93.6%),均购自中国食品药品检定研究院;胞苷(批号:101511354,西格玛奥德里奇有限公司);乙腈为色谱纯;水为超纯水;蛴螬样品(编号为1~10,经鉴定为正品)。
1.3方法与结果:
步骤1、尿嘧啶对照品溶液的制备:精密称取尿嘧啶对照品6.01mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得尿嘧啶对照品溶液;
步骤2、胞苷对照品溶液的制备:精密称取胞苷对照品5.03mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得胞苷对照品溶液;
步骤3、次黄嘌呤对照品溶液的制备:精密称取次黄嘌呤对照品10.05mg,置50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得次黄嘌呤对照品溶液;
步骤4、黄嘌呤对照品溶液的制备:精密称取黄嘌呤对照品10.08mg,置50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得黄嘌呤对照品溶液;
步骤5、尿苷对照品溶液的制备:精密称取尿苷对照品5.02mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得尿苷对照品溶液;
步骤6、肌苷对照品溶液的制备:精密称取肌苷对照品5.09mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得肌苷对照品溶液;
步骤7、鸟苷对照品溶液的制备:精密称取鸟苷对照品5.04mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得鸟苷对照品溶液;
步骤8、混合对照品溶液制备:分别精密吸取尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷对照品溶液各1ml,至10ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得混合对照品溶液;
步骤9、供试品溶液的制备:称取混匀蛴螬药材细粉(过五号筛)0.5021g,置具塞锥形瓶中,精密加入超纯水50mL,混匀,50℃超声处理30min,放冷,离心机14000rpm,离心5min,0.45μm微孔滤膜滤过即得;
步骤10、高效液相色谱测定:
色谱条件:Waters HSS T3(4.6×250mm,5μm)为色谱柱;检测波长为260nm;流速为1.0mL·min-1;柱温为30℃;进样量为5μL;以乙腈为流动相A,水为流动相B,进行梯度洗脱;
步骤11、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5μl,注入液相色谱,测定,记录40min的色谱图,即得。
1.4方法学考查
1.4.1线性关系:精密称定尿嘧啶3.00mg、胞苷1.94mg、次黄嘌呤10.00mg、黄嘌呤10.01mg、尿苷1.97mg、肌苷1.23mg、鸟苷1.40mg置100mL量瓶中,加水稀释至刻度,混匀;配置成浓度为尿嘧啶30μg·mL-1;胞苷19.4μg·mL-1;次黄嘌呤100μg·mL-1;黄嘌呤100.1μg·mL-1;尿苷19.7μg·mL-1;肌苷12.3μg·mL-1;鸟苷14μg·mL-1的混合溶液。精密吸取混合对照品溶液0.2μL、1μL、5μL、10μL、20μL分别注入液相色谱仪,按照上述色谱条件对样品进行测定,以峰面积为纵坐标(y),进样质量为横坐标(X),峰面积对质量作线性回归方程,得回归方程,结果见表1及图1至图7。
表1 7种被测成分的线性范围
上述结果表明,7种被测成分在各自线性范围内呈良好的线性关系,且尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷均具有良好的线性关系。
1.4.2精密度试验:取混合对照品溶液,按照上述色谱条件连续进样6次,测定其峰面积,结果见表2;结果表明仪器精密度良好。
表2精密度试验
1.4.3稳定性试验:取同一供试品溶液(编号1),按照上述色谱条件测定,分别于配制后的0、3、9、12、15、20h,精密吸取5μL,注入液相色谱仪,记录峰面积,结果尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷和鸟苷峰面积的RSD(n=6)分别在0.20%和1.4%之间,结果表明供试品溶液在20h内稳定。,由实验数据说明样品溶液在18h内基本稳定,该方法稳定性良好,结果见表3。
表3稳定性试验结果
1.4.4重复性试验:取样品粉末6份(编号1),分别按照上述方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定,结果测得的各份尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷和鸟苷含量的RSD别在0.20%和1.7%之间,实验结果表明重复性良好,结果见表4。
表4重复性试验结果
1.4.5回收率试验:取已知含量的供试品粉末6份(编号1),每份约0.25g,置50ml量瓶中,精密加入与其含有量相应对照品溶液适量,加水定容至刻度,分别按照供试品制备方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定,记录峰面积,计算回收率(n=6),计算其加标回收率,结果见表5。
表5回收率试验结果
1.5样品含量测定
按上述色谱条件测定十批供试品溶液,结果每克蛴螬中含尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷和鸟苷见表6。
表6样品含量测定结果
综上,本发明所建立的含量测定方法,具有精密度好、重复性、稳定性良好的特点,可全面、有效地用于控制与评价药材的质量。
Claims (1)
1.一种多组分检测控制蛴螬含量的方法,其特征在于:具体操作步骤如下:
步骤1、尿嘧啶对照品溶液的制备:精密称取尿嘧啶对照品6.01mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得尿嘧啶对照品溶液;
步骤2、胞苷对照品溶液的制备:精密称取胞苷对照品5.03mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得胞苷对照品溶液;
步骤3、次黄嘌呤对照品溶液的制备:精密称取次黄嘌呤对照品10.05mg,置50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得次黄嘌呤对照品溶液;
步骤4、黄嘌呤对照品溶液的制备:精密称取黄嘌呤对照品10.08mg,置50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得黄嘌呤对照品溶液;
步骤5、尿苷对照品溶液的制备:精密称取尿苷对照品5.02mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得尿苷对照品溶液;
步骤6、肌苷对照品溶液的制备:精密称取肌苷对照品5.09mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得肌苷对照品溶液;
步骤7、鸟苷对照品溶液的制备:精密称取鸟苷对照品5.04mg,置100ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得鸟苷对照品溶液;
步骤8、混合对照品溶液制备:分别精密吸取尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷对照品溶液各1ml,至10ml容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,得混合对照品溶液;
步骤9、供试品溶液的制备:称取混匀蛴螬药材细粉(过五号筛)0.5021g,置具塞锥形瓶中,精密加入超纯水50mL,混匀,50℃超声处理30min,放冷,离心机14000rpm,离心5min,0.45μm微孔滤膜滤过即得;
步骤10、高效液相色谱测定:
色谱条件:Waters HSS T3为色谱柱;检测波长为260nm;流速为1.0mL·min-1;柱温为30℃;进样量为5μL;以乙腈为流动相A,水为流动相B,进行梯度洗脱;
步骤11、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5μl,注入液相色谱,测定,记录40min的色谱图,即得。
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