ES2216181T3

ES2216181T3 - Procedimiento para preparar dimero purificado de factor derivado de hueso.

Info

Publication number: ES2216181T3
Application number: ES97950371T
Authority: ES
Inventors: Jun Honda; Hidetoshi Andou; Shunjiro Sugimoto
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Priority date: 1996-12-25
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2017-12-24
Also published as: US6551801B1; DE69728997D1; IL130641A0; PL334303A1; SI0949335T2; DK0949335T4; KR20000062328A; NO993151D0; DK0949335T3; SI0949335T1; WO1998029559A1; AU5339598A; PT949335E; DE69728997T2; EP0949335A4; ZA9711580B; HUP0002573A2; DE69728997T3; EP0949335B2; ATE266095T1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE FACTORES FORMOGENETICOS OSEOS DIMEROS PURIFICADOS. DICHOS FACTORES SE PUEDEN PRODUCIR SOMETIENDO UN CUERPO DE INCLUSION DE UN FACTOR MORFOGENETICO OSEO, PRODUCIDO MEDIANTE INGENIERIA GENETICA, A LAS SIGUIENTES FASES A)-E), EN ORDEN: A) TRATAR UN CUERPO DE INCLUSION DE UN FACTOR MORFOGENETICO OSEO CON UN AGENTE DESNATURALIZANTE, PARA OBTENER UN MONOMERO SOLUBILIZADO; B) TRATAR DICHO MONOMERO SOLUBILIZADO CON UNA SOLUCION DE REPLEGADO, PARA OBTENER UN FACTOR MORFOGENETICO OSEO DIMERO; C) TRATAR DICHO FACTOR MEDIANTE ULTRAFILTRACION Y SUSTITUCION DE DISOLVENTE; D) SOMETER DICHO FACTOR EN EL DISOLVENTE ASI SUSTITUIDO, A PRECIPITACION ISOELECTRICA; Y E) SOMETER DICHO FACTOR PRECIPITADO ISOELECTRICAMENTE A CROMATOGRAFIA DE FASE INVERSA.

Description

Procedimiento para preparar dímero purificado de factor derivado de hueso.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para la producción de un factor morfogenético óseo dimérico purificado. Más particularmente, se refiere a un procedimiento para la producción de un factor morfogenético óseo dimérico, caracterizado por adquirir un factor morfogenético óseo dimérico purificado a partir de un cuerpo de inclusión de un factor morfogenético óseo producido por medio de una tecnología de ingeniería genética.

Antecedentes de la invención

Se ha descubierto que en la matriz ósea existe un factor morfogenético óseo proteínico (Science 150, p. 893-899, 1965), y este factor se denominó como "proteína morfogenética ósea" (en lo sucesivo abreviado como BMP). Recientemente, se ha intentado clonar genes plurales relacionados con la BMP, y se ha encontrado que todos ellos pertenecen a la superfamilia del factor \beta del crecimiento transformador (en lo sucesivo abreviado como TGF-\beta). Se han producido recombinantes de algunos de estos factores por medio de una tecnología de ingeniería genética, y han confirmado que tienen una actividad morfogenética ósea, a partir de la cual es de esperar su aplicación al tratamiento de enfermedades óseas.

De estos factores, se ha confirmado mediante ensayos con animales que el GDF-5 (MP52) humano, recientemente descubierto y que pertenece a la familia de BMP humana (Biochem. Biophys. Res. Commun., 204, p. 646-652, 1994), es eficaz como un factor morfogenético óseo, mientras que se ha analizado técnicamente cómo llevar a cabo la producción a gran escala del mismo mediante expresión usando Escherichia coli (E. coli) recombinante. Sin embargo, cuando se expresa a gran escala en E. coli y otros, por ejemplo cuando la proteína se produce en una cantidad de varios gramos por litro de caldo cultivado, la proteína deseada generalmente tiende a formar un cuerpo de inclusión inactivo e insoluble. Este cuerpo de inclusión es monomérico y, a fin de obtener un dímero que sea activo como un factor morfogenético óseo, el cuerpo de inclusión se debe solubilizar, renaturalizar hasta un dímero de una estructura original (el procedimiento generalmente se denomina "replegamiento"), se debe separar y se debe purificar para obtener la proteína deseada.

La forma activa de MP52 tiene los siguientes problemas o similares:

1) debido a su baja solubilidad en una disolución acuosa, se debe manipular en presencia de un agente desnaturalizante o en condiciones ácidas,

2) la proteína usada para la separación tiende a adsorberse de forma no específica sobre una resina para cromatografía de líquidos, y

3) el tensioactivo, esencial para el replegamiento, tiende a perturbar la separación,

y de este modo ha sido muy difícil establecer un procedimiento para su purificación.

El procedimiento de purificación recientemente desarrollado para resolver los problemas anteriormente mencionados (documento WO 96/33215), exitoso obteniendo una forma activa única de MP52, comprende las siguientes etapas:

1. solubilizar un cuerpo de inclusión mediante un agente desnaturalizante,

2. separar mediante cromatografía de intercambio iónico,

3. sulfonar,

4. separar mediante cromatografía de filtración en gel,

5. replegar,

6. recuperar mediante precipitación isoeléctrica, y

7. separar mediante cromatrografía de fase inversa.

Sin embargo, el procedimiento anterior, si se lleva a la escala industrial, ha encontrado los siguientes y similares problemas:

1) se usa una gran cantidad de un agente desnaturalizante a fin de solubilizar el cuerpo de inclusión de MP52, con lo que se puede inducir la modificación de la proteína (por ejemplo, reacción de carbamilación en el caso de urea),

2) se usa en gran cantidad una resina cara para la cromatografía, especialmente para la cromatografía de filtración en gel, tal como Sephacryl S-200HR o Superdex 200pg (todos disponibles de Pharmacia Biotech),

3) el reactivo usado en el replegamiento, entre otros, CHAPS y glutationa oxidada, esencial para la reacción de diremización, es extremadamente caro, y

4) cuando se lleva a cabo la precipitación isoeléctrica es necesaria la dilución para disminuir la concentración de detergente, y de este modo se aumenta el volumen de la disolución.

Descripción de la invención

Un objeto de esta invención es resolver los problemas anteriormente mostrados, es decir,

1) usar un agente desnaturalizante en una cantidad tan baja como sea posible;

2) usar una resina de cromatografía en una cantidad tan baja como sea posible,

3) sustituir el reactivo usado para el replegamiento por otros más baratos, y para simplificar los procedimientos concomitantes con el replegamiento,

4) disminuir el volumen de la disolución eliminando un detergente de forma selectiva, esto es, para acortar considerablemente el tiempo del procedimiento.

Ha sido factible una simplificación de las etapas de purificación solubilizando un cuerpo de inclusión extraído de E. coli, en presencia de una gente desnaturalizante, realizando un replegamiento directo según un procedimiento de dilución y entonces sometiendo a ultrafiltración, sustituyendo la disolución de replegamiento. Este procedimiento parece ser similar a la primera etapa de un procedimiento para la producción de insulina humana a partir de E. coli (documento EP 600372A1). Sin embargo, puesto que el factor morfogenético óseo es diferente en propiedades de una proteína soluble, tal como insulina humana, fue difícil aplicar el procedimiento para la producción de insulina como se representa anteriormente en caso de un factor morfogenético óseo. El MP52 (forma activa) dimerizado, como se representa anteriormente, tiene una baja solubilidad y tiende a adsorberse sobre una resina cromatográfica, y de este modo, en la producción a gran escala, no se pudo aplicar la cromatografía de intercambio iónico, o la cromatografía hidrófoba usada para insulina humana, o la cromatografía de filtración en gel usada en el documento WO 96/33215 mencionado anteriormente. Por ejemplo, cuando se usa un intercambiador iónico (SP Sepharose FF, Pharmacia Biotech), el MP52 no se eluye completamente debido a su fuerte adsorción sobre la resina, incluso si se usa un agente desnaturalizante y una concentración máxima de sal. Cuando se usa filtración en gel (Sephacryl S-200HR, Pharmacia Biotech), se produce una fuerte adsorción de la proteína sobre una resina, incluso si se usa un agente desnaturalizante, provocando un intervalo de fraccionamiento excesivamente amplio y de este modo una separación muy mala. Además, las propiedades de la resina se alteran por la influencia de un tensioactivo tal como CHAPS, lo que conduce a la pérdida de reproducibilidad. Esto también es aplicable a la elución con una disolución ácida en la que MP52 es soluble. En conclusión, no es factible hacer uso de las propiedades originales de la resina.

Como se ha explicado anteriormente, se ha puesto de manifiesto que la purificación de la proteína deseada, en una producción a gran escala, no se puede lograr según un medio cromatográfico general, usando un sistema acuoso. La cromatografía de fase inversa, que usa disolvente orgánico, es el único medio que se podría utilizar. A la vista de esto, fue necesario desarrollar un medio de purificación en el que no se usen muchas columnas. Como medio de purificación, distinto del uso de columnas, parecía prometedor un método de fraccionamiento mediante sulfato de amonio. Sin embargo, puesto que tuvo una baja eficacia de purificación y condujo a un rendimiento innecesariamente bajo, su uso se desechó. Además, se adoptó un procedimiento de precipitación isoeléctrica mediante ajuste de pH pero, antes del procedimiento actual, se llevó a cabo un procedimiento de ultrafiltración para eliminar el tensioactivo, CHAPS, lo que permitió la realización de la precipitación isoeléctrica sin aumentar el volumen de la disolución. Convencionalmente, cuando la disolución contenía CHAPS, la solubilidad de la proteína era elevada y no ocurría la precipitación. Por lo tanto, fue necesaria una dilución para disminuir la concentración de CHAPS, pero el aumento intenso resultante en el volumen de la disolución ha sido un problema en el desarrollo del procedimiento.

Esta invención se dirige a un procedimiento para la producción de un factor morfogenético óseo dimérico purificado, caracterizado por someter a un cuerpo de inclusión de un factor morfogenético óseo, producido por medio de una tecnología de la ingeniería genética, a las siguientes etapas a)-e) en orden, produciendo de ese modo un factor morfogenético óseo dimérico:

a) tratar un cuerpo de inclusión de un factor morfogenético óseo con un agente desnaturalizante, para obtener un monómero solubilizado,

b) tratar el monómero solubilizado con una disolución de replegamiento, y en presencia de un compuesto que tiene un grupo guanidino o una sal del mismo, para obtener un factor morfogenético óseo dimérico,

c) tratar el factor morfogenético óseo dimérico mediante ultrafiltración usando una disolución ácida,

d) someter al factor morfogenético óseo dimérico, en el disolvente así sustituido, a una precipitación isoeléctrica, y

e) someter al factor morfogenético óseo dimérico así precipitado a cromatografía de fase inversa.

El cuerpo de inclusión de un factor morfogenético óseo producido por medio de una tecnología de ingeniería genética es preferiblemente el expresado en E. coli por medio de una tecnología de ingeniería genética.

Cuando un factor morfogenético óseo se expresa en E. coli, las células se suspenden en un tampón, se homogeneizan por medio de un homogeneizador, y se centrifugan para recuperar un cuerpo de inclusión. El cuerpo de inclusión se lava con un tampón que contiene un detergente, por ejemplo, Triton X-100, o urea, más de 3 veces, y se centrifuga para obtener un cuerpo de inclusión de purificación primaria.

La etapa en la que un cuerpo de inclusión de un factor morfogenético óseo es tratado con un agente desnaturalizante para dar un monómero solubilizado se puede llevar a cabo añadiendo el cuerpo de inclusión a una disolución que contiene el agente desnaturalizante, y diluyendo mediante agitación. Para la disolución que contiene un agente desnaturalizante, se puede usar cualquiera de las conocidas públicamente, tal como urea 8 M o guanidina-HCl 6 M y otras, en tampón de glicina-HaOH 50 mM (pH 10,7).

La etapa en la que un monómero solubilizado se trata con una disolución de replegamiento para dar un dímero se lleva a cabo diluyendo la disolución de proteína, obtenida anteriormente, con una disolución de replegamiento para proporcionar una concentración final de proteína de 0,1 a 5,0 mg/ml, preferiblemente 2,4 mg/ml. Aunque la disolución se ha realizado hasta ahora para proporcionar una concentración final de un agente desnaturalizante a 1M o menos, es preferible en esta invención que la disolución se haga para proporcionar un concentración final de un agente desnaturalizante a 1-4 M, particularmente 2,4 M, de forma que se evite la agregación y precipitación de proteínas con un rendimiento mejorado. Para la disolución de replegamiento, se puede usar cualquiera de las públicamente conocidas en la técnica anterior, tales como tensioactivos, por ejemplo, ácido cólico o sus derivados, tales como 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO), ácido taurocólico o una sal del mismo, ácido taurodesoxicólico o una sal del mismo, y preferiblemente 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS); EDTA; una combinación de un agente reductor, tal como mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT), con glutationa oxidada o un tampón que contiene cisteína o similares. La ventaja de usar cisteína sola es que no es necesario usar un reactivo oxidante generalmente caro, y que se puede disminuir la cantidad de su uso. Por lo tanto, es de esperar que se simplifiquen las etapas del procedimiento, y que se ahorren costes para los reactivos.

El reactivo contenido en la disolución de replegamiento, distinto del descrito anteriormente, es aquel que tiene un grupo guanidino, que también evita una agregación y precipitación de proteínas y aumenta el rendimiento. Más específicamente, se añade hidrocloruro de guanidina o hidrocloruro de arginina (Arg\cdotHCl), preferiblemente 0,5 M de Arg\cdotHCl, a la disolución de replegamiento por adelantado. En la Tabla 1 se muestra el efecto de la adición de Arg\cdotHCl

TABLA 1

Concentración de proteína (g/l)	dímero de MP52 (g/l)
0,8* + 0,5M Arg HCl	0,37
1,6 + 0,5M Arg HCl	0,62
2,4 + 0,5M Arg HCl	0,98
3,2 + 0,5M Arg HCl	0,95
2,4 Sin Arg HCl	Ocurrió la agregación de proteínas
*La concentración de proteína de 0,8 g/l fue el límite más elevado para la concentración de proteína sin Arg\cdotHCl.

Como se muestra en la Tabla 1, sin Arg\cdotHCl, ocurrió la agregación y precipitación de las proteínas en la disolución de replegamiento. Sin embargo, al añadir Arg\cdotHCl, la cantidad de proteína que se puede tratar por disolución de replegamiento, sin agregación, se puede aumentar en 2,7 veces (es decir, 0,98 g/l opuesto a 0,37 g/l). En cuanto a un tampón, se pueden usar aquellos tampones que usan fosfato o Tris-HCl, pero se prefiere un tampón de Arg-NaOH de pH 8-10, particularmente pH 8,9.

La etapa de ultrafriltración, en la que se concentra el dímero replegado, se lleva a cabo usando un filtro de membrana de corte de peso molecular de 10.000, tal como PSU 10K (Sartorius), y la concentración de CHAPS se reduce sustituyendo con una disolución ácida, tal como una disolución de ácido fosfórico al 0,2%.

La etapa en la que la disolución del dímero sustituido es precipitada isoeléctricamente se lleva a cabo añadiendo disolución alcalina, tal como NaOH, a la disolución de dímero, ajustando el valor de pH hasta 7,4 para precipitar selectivamente un factor morfogenético óseo. Después del ajuste del pH, se deja reposar la disolución durante una hora o más, se centrifuga o se filtra para eliminar el sobrenadante, y el precipitado se disuelve en una disolución ácida, tal como una disolución de ácido cítrico 50 mM, ácido fosfórico al 0,2% o ácido trifluoroacético al 0,05%.

La etapa en la que el dímero precipitado isoeléctricamente se somete a cromatografía de fase inversa se lleva a cabo sometiendo a la disolución ácida, obtenida anteriormente, a una cromatografía de líquidos de altas prestaciones y eluyendo con gradientes de 0-50% de disolvente orgánico, tal como isopropanol, acetonitrilo o etanol, para recuperar las fracciones de un factor morfogenético óseo dimérico. Como resina para la cromatografía de líquidos de altas prestaciones, se usa una resina polimérica tal como SOURCE 15 RPC (6 cm\phi x 20 cm, fabricada por Pharmacia Biotech).

El factor morfogenético óseo a usar en esta invención es preferiblemente un factor morfogenético óseo que tiene un único peso molecular seleccionado del grupo que consta de MP52, BMP-2, BMP-4, BMP-6 y BMP-7. Como un ejemplo, se incuba la cepa de E. coli que tiene introducida en ella ADNc que codifica un precursor de MP52 humano (específicamente, la E. coli que tiene introducida en ella un plásmido ligado con un codón que codifica metionina en el término del cebador en 5 en la secuencia de MP52 de 119 restos, de los cuales se elimina la alanina N-terminal de MP52 humano maduro), para producir MP52 monomérico maduro como cuerpo de inclusión en grandes cantidades y, usando el actual procedimiento, se obtiene MP52 maduro con una elevada pureza a partir de este cuerpo de inclusión.

Ejemplo

Esta invención se explicará más específicamente a continuación por medio de ejemplos, que no se han de interpretar como limitantes de la invención. Los procedimientos de (2) a (4) se llevaron a cabo en una cámara a baja temperatura, a 4ºC, considerando la estabilidad de la proteína. Cada etapa se explicará de forma completa, a continuación.

(1) Fermentación de MP52 humano y purificación primaria del cuerpo de inclusión

La E. coli productora de MP52, obtenida de la misma manera como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 96/33215, se precultivó en un medio SOC modificado, y después el caldo precultivado se inoculó en 100 l de medio de producción. Para inducción, se añadió 1 mM de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) en una fase de crecimiento logarítmico temprana, y se continuó la fermentación a 32ºC hasta OD_{550}=150. Después de esto, se recolectaron las células, se suspendieron en un tampón que contiene 25 mM de Tris-HCl (pH 7,3) y 10 mM de EDTA-4Na, se homogeneizaron por medio de un homogeneizador (fabricado por Manton Gaulin), y se centrifugaron para recuperar un cuerpo de inclusión. El cuerpo de inclusión se lavó con un tampón que contiene urea 1 M como detergente, y se centrifugó para obtener un cuerpo de inclusión con la purificación primaria aplicada.

(2) Solubilización del cuerpo de inclusión y replegamiento

Se solubilizaron cien g (peso húmedo) del cuerpo de inclusión, obtenido anteriormente, mediante agitación en 300 ml de tampón de glicina-NaOH 50 mM que contiene urea 8 M y 5 mM de etilendiamintetraacetato (pH 8,9) (siendo la concentración de proteína de alrededor de 18 mg/ml). El replegamiento se llevó a cabo diluyendo la disolución del cuerpo de inclusión con un tampón de replegamiento [Arg-NaOH 0,5 M (pH 8,9), hidrocloruro de cisteína monohidratado 4,8 mM, cloruro de sodio 0,5 M, CHAPS 20 Mm] a un volumen de 6,7 veces (siendo la concentración de proteína de alrededor de 2,4 mg/ml). La mezcla como tal se dejó reposar a 4ºC durante alrededor de 20 horas.

(3) Purificación de MP52 después del replegamiento (ultrafiltración)

Después de la terminación de la reacción de replegamiento, el MP52 se concentró 5 veces usando un filtro de membrana con un peso molecular de corte de 10.000 (PSU 10K, Sartorius), y la disolución se diluyó y se sustituyó por un volumen de 5 veces con una disolución de ácido fosfórico al 0,2%. Repitiendo el procedimiento 3 veces, la concentración de CHAPS se diluyó teóricamente 100 veces o más.

(4) Purificación de MP52 tras el replegamiento (precipitación isoeléctrica)

La precipitación isoeléctrica se realizó añadiendo disolución de NaOH a la disolución de replegamiento sustituida, ajustando el valor de pH hasta 7,4. La disolución se puso turbia, y entonces se dejó reposar durante una hora o más. Después se centrifugó (10.000 g X 15 min) y se recuperó el precipitado. El precipitado se disolvió en disolución de ácido fosfórico al 0,2%.

(5) Purificación de MP52 tras el replegamiento (cromatografía de fase inversa)

El MP52, disuelto en la disolución de ácido fosfórico, se separó por medio de cromatografía de fase inversa. Se utilizó un sistema cromatográfico de líquidos de altas prestaciones, usando SOURCE 15 RPC (6 cm\phi x 20 cm, Pharmacia Biotech) como resina, y se eluyó con el gradiente de etanol al 0-50% para recuperar las fracciones que contienen MP52 dimérico.

Según el procedimiento de purificación mencionado anteriormente, se tuvo éxito recuperando una forma activa de MP52 con rendimiento elevado, como se muestra en la Tabla 2. La cantidad de MP52 en la etapa de purificación se determinó mediante cuantificación de la imagen de barrido del gel de electroforesis teñido con CBB.

TABLA 2

Etapa	Cantidad de MP52 (g)	Rendimiento (%)
Solubilización	5,4	100
Replegamiento	2,2	41
Ultrafiltración	1,6	30
Precipitación isoeléctrica	1,5	29
Cromatografía de fase inversa	1,1	21

Una de las ventajas del procedimiento de purificación en esta invención es una reducción eficaz del coste de purificación. Según un cálculo preliminar, el coste del procedimiento total se puede reducir en alrededor de 1/2 por proteína, según se compara con aquellos del documento WO 96/33215. Por lo tanto, el procedimiento actual de purificación puede ser muy útil en la industrialización.

Según el procedimiento actual, se puede producir eficazmente, en gran cantidad y de forma más barata, un factor morfogenético óseo dimérico que tiene un único peso molecular, según se compara con el procedimiento de la técnica anterior.

Claims

1. Un procedimiento para la producción de un factor morfogenético óseo dimérico purificado, que comprende someter a un cuerpo de inclusión de un factor morfogenético óseo, producido por medio de una tecnología de ingeniería genética, a las siguientes etapas a)-e) en orden, produciendo de ese modo el factor morfogenético óseo dimérico:

a) tratar un cuerpo de inclusión, de un factor morfogenético óseo, con un agente desnaturalizante, para obtener un monómero solubilizado,

b) tratar el monómero solubilizado con una disolución de replegamiento, y en presencia de un compuesto que tiene un grupo guanidino o la sal del mismo, para obtener un factor morfogenético óseo dimérico,

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho cuerpo de inclusión es un cuerpo de inclusión de un factor morfogenético óseo expresado en Escherichia coli por medio de una tecnología de ingeniería genética.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la concentración final de dicho agente desnaturalizante durante el replegamiento según la etapa (b) es 1 M - 4 M.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha disolución de replegamiento es un tampón que comprende cisteína o una sal de la misma a una concentración de 0,1 a 1,0 mg/ml de proteína, cloruro de sodio a una concentración de 0,1 a 1,5 M, y ácido cólico o sus derivados a una concentración de 5 hasta 100 mM, y que tiene un pH en el intervalo de 8-10.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el compuesto que tiene un grupo guanidino es hidrocloruro de guanidina o/e hidrocloruro de arginina.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho factor morfogenético óseo es un factor morfogenético óseo seleccionado del grupo que consta de MP52, BMP-2, BMP-4, BMP-6 y BMP-7.