CN102703490B - 重组链霉亲和素的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组蛋白制备领域，具体公开了一种重组链霉亲和素的制备工艺，利用基因工程的方法，人工合成表达重组链霉亲和素的重组基因，将该重组基因序列插入载体，转化宿主细胞，通过发酵，分离纯化等步骤获得重组链霉亲和素。本发明制备工艺表达的纯化的重组链霉亲和素可以达到500mg/L的最终纯蛋白产量，蛋白活性高，并且蛋白纯化工艺简单，成本低廉，便于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及重组蛋白制备领域，具体公开了一种重组链霉亲和素的制备工艺。
背景技术
链霉亲和素(Streptavidin，下称SA)是Streptomyces avidinii菌培养过程中的一种外分泌的蛋白质，与亲和素(Avidin)有相似生物学特性，可以高度特异性地结合一种水溶性的维生素：D-生物素（维生素H）。
SA为四聚体，平均每个亚基都能结合一分子生物素，Streptavidin-Biotin之间亲和力非常强，Kd值接近1015M。生物素易于与多种生物活性分子（如蛋白，核酸和糖类等）发生偶联。在发现SA之前，科学家利用生物素和亲和素的特点，利用两者亲和的能形成Avidin－Biotin系统，一方面可以偶联抗原、抗体及核酸分子,另一方面又能被酶等多种材料标记，于是此系统能够应用于抗原抗体检测作为生物反应放大系统。随SA的出现，研究者发现SA不带糖基、等电点低，且完整的四聚体还具有热稳定性好，对强酸、SDS、尿素、盐酸胍的耐受性强等特点，使得Streptavidin-Biotin系统与Avidin-Biotin系统相比具有亲和力高、灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测背景干扰少等优势，提高了检测灵敏性和拓宽了应用范围。SA完全代替了Avidin，形成的Streptavidin-Biotin系统，被更加广泛的应用于免疫学、分子生物学和组织化学等领域，并已经取得较好的效果。
1963年Stapley EO等首次发现SA，当时分离纯化获得的SA分子量约为60kDa，每个单链分子量约为15kDa。80年代研究人员发现天然SA单体肽链由169个氨基酸组成，分子量为16.5kDa，四聚体分子量为66.0kDa。早期获得的SA蛋白之所以比全长短，经研究证实是因为全长的蛋白在Streptomyces avidinii菌外分泌发酵过程中易被细胞外分泌的蛋白酶酶切，成为不完整的SA蛋白。这种不完整的SA为全长的蛋白去掉N端10-12个氨基酸残基，C端去掉19-21个氨基酸残基的片段，因为后期研究表明SA氨基酸两端的序列为疏水性序列，是降低全长蛋白溶解性的关键，它的存在也会减弱SA与生物素的亲和能力。当蛋白被分泌到菌体外时，由蛋白酶切去除这两段序列，恢复SA的溶解性，这样可以大大降低它在细胞内由于过多结合生物素照成的细胞毒性，起到保护细胞的作用。截短的SA，称为核心链霉亲和素（Core Streptavidin，CSA）具有溶解性好，生物活性、稳定性、耐酸、耐尿素及盐酸胍能力高的特点，是当前国内为主要使用的链霉亲和素形式。
1998年Anna Gallizia等运用表达载体pET11a和大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)成功地表达了带有T7标签的CSA蛋白，其表达量为70mg/L。2005年Xipeng Liu等运用表达载体pET28a和表达宿主BL21（DE3）分别表达了带有信号肽的SA和CSA，表达量都约在80mg/L左右。近年也有研究人员试图在大肠杆菌中实现外分泌表达SA，2008年GerhardMiksch等人运用phoA基因的引导序列、相应的强启动子及kil基因构建了一个特殊的表达载体，实现了SA在大肠杆菌BL21（DE3）中大量的外分泌表达，通过表达条件的优化获得外分泌SA的产量为1715nM（109.76mg/L）。
鉴于此蛋白在生物各领域及国内外均应用广泛，而目前国内需求基本靠昂贵的国外进口满足，因此开发一种高效，成本低廉、活性较高的链霉亲和素的生产方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效，低成本，有利于大规模生产的制备重组链霉亲和素（核心链霉亲和素）的方法，以提高链霉亲和素的产量，供工业生产需要。
本发明利用基因工程的方法，人工合成表达重组链霉亲和素的重组基因，将该重组基因序列插入载体，转化宿主细胞，通过发酵，分离纯化等步骤获得重组链霉亲和素。本发明所述的重组链霉亲和素即为截短的链霉亲和素（SA），又称为核心链霉亲和素（CSA）。
本发明的技术方案为：一种重组链霉亲和素的制备工艺，具体步骤如下：
1)人工合成表达重组链霉亲和素的重组基因，所述重组基因的序列包括核心链霉亲和素（CSA）基因序列以及位于核心链霉亲和素（CSA）基因序列左右两侧的限制性酶切位点序列；
2)重组质粒的构建：将步骤1）的重组基因插入载体，获得能够表达重组链霉亲和素的重组质粒；
3)基因工程菌的制备：将步骤2）获得的重组质粒转化宿主细胞制备基因工程菌；
4)外源基因的表达：基因工程菌发酵表达重组链霉亲和素；
5)目的蛋白的分离纯化：裂解菌体，通过蛋白纯化步骤获得重组链霉亲和素。
较优的，所述核心链霉亲和素基因序列为：5’-GCAGAAGCGGGCATTACCGGTACCTGGTATAACCAGCTGGGCAGCACGTTCATTGTGACTGCAGGCGCGGATGGTGCGCTGACCGGCACCTATGAAAGCGCGGTGGGCAACGCGGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGCCGTTACGATAGCGCACCGGCGACCGATGGTAGCGGCACCGCGCTGGGCTGGACCGTGGCGTGGAAGAACAACTATCGTAACGCGCATAGCGCGACCACCTGGAGCGGCCAGTATGTTGGCGGTGCGGAAGCGCGCATCAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGCACCACCGAAGCGAACGCGTGGAAGAGCACCCTGGTGGGCCATGATACCTTTACCAAAGTGAAACCGAGCGCGGCGAGC-3’（SEQ ID NO:3）。
较优的，所述位于核心链霉亲和素基因序列左右两侧的限制性酶切位点分别为入Nde I酶和Hind III酶的限制酶切位点。该重组基因序列5’至3’方向依次为Nde I酶的限制性酶切位点序列、核心链霉亲和素基因序列、Hind III酶的限制性酶切位点序列。
更优的，所述人工合成的表达重组链霉亲和素的重组基因序列为：
5’-CAT ATG GCA GAA GCG GGC ATT ACC GGT ACC TGG TAT AAC CAG CTG GGCAGC ACG TTC ATT GTG ACT GCA GGC GCG GAT GGT GCG CTG ACC GGC ACC TATGAA AGC GCG GTG GGC AAC GCG GAA AGC CGT TAT GTG CTG ACC GGC CGT TACGAT AGC GCA CCG GCG ACC GAT GGT AGC GGC ACC GCG CTG GGC TGG ACC GTGGCG TGG AAG AAC AAC TAT CGT AAC GCG CAT AGC GCG ACC ACC TGG AGC GGCCAG TAT GTT GGC GGT GCG GAA GCG CGC ATC AAC ACC CAG TGG CTG CTG ACCAGC GGC ACC ACC GAA GCG AAC GCG TGG AAG AGC ACC CTG GTG GGC CAT GATACC TTT ACC AAA GTG AAA CCG AGC GCG GCG AGC TAA GCT T-3’（SEQ ID NO:1）。
较优的，所述载体为含有T7强启动子的原核表达载体。使用含有T7强启动子的原核表达载体可以利用IPTG进行诱导，显著提高目的蛋白的表达水平。
更优的，所述载体为pET21a(+)。
将本发明的重组基因插入到pET21a(+)的Nde I酶和Hind III酶的酶切位点之间，表达本发明的重组蛋白，并进行蛋白的分离纯化。
较优的，所述宿主细胞为大肠杆菌。
更优的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL2l(DE3)。
BL21（DE3）能高效表达控制于T7启动子和核糖体结合位点的外源基因，它不表达ompT和lon（1）蛋白酶，因此表达产物比较稳定，不会被菌株内源性的蛋白酶所降解。
较优的，所述蛋白纯化步骤采用五步纯化法，该五步纯化法依次为包涵体溶解、阳离子交换层析、包涵体蛋白复性、阴离子交换层析以及凝胶过滤层析。
更优的，所述五步纯化法具体步骤为：
A.包涵体溶解：尿素溶液变性包涵体蛋白；
B.阳离子交换层析：SP Sepharose F.F.层析柱初步分离步骤A变性后的包涵体蛋白；
C.包涵体蛋白复性：将上一步初步分离的变性后的包涵体蛋白，采用稀释复性的方法复性，获得复性蛋白溶液；
D.阴离子交换层析：用Q Sepharose F.F.层析柱纯化步骤C所得的复性蛋白溶液，获得重组链霉亲和素；
E.凝胶过滤层析：Superdex 75凝胶过滤层析进一步纯化步骤D获得的重组链霉亲和素，收集进一步纯化的目的蛋白。
较佳的，所述步骤A包涵体溶解具体为：破碎菌体，收集菌体沉淀(包涵体)，将菌体沉淀用含5～15mM NaCl，4～8M尿素，pH4.0～5.5，10~50mM的磷酸盐缓冲液充分搅拌溶解，离心取上清。
最佳的，所述步骤A包涵体溶解具体为：破碎菌体，收集菌体沉淀(包涵体)，将菌体沉淀用含10～15mMNaCl，6～8M尿素，pH4.5±0.1，10～20mM的磷酸盐缓冲液充分搅拌溶解，离心取上清。
所述离心条件为12000g离心15分钟。
较佳的，所述步骤B阳离子交换层析具体为：先用平衡液平衡填充有SP Sepharose F.F.的离子交换柱，将上一步获得的上清液上柱后，用平衡液清洗离子柱；最后用洗脱液洗脱，收集蛋白峰洗出液。
更佳的，步骤B中所述平衡液为含5～15mMNaCl，4～8M尿素，pH4.0～5.5，10~50mM的磷酸盐缓冲液；洗脱液为含100~500mM NaCl，4～8M尿素，pH5.0～7.0，10~50mM的磷酸盐缓冲液。上清液上柱的流速为10mL/min，结束后用4~5倍柱床体积的平衡液清洗离子柱。
最佳的，步骤B中所述平衡液为含10～15mM NaCl，6～8M尿素，pH4.5±0.1，10～20mM的磷酸盐缓冲液；洗脱液为含100～150mM NaCl，6～8M尿素，pH6.0±0.1，10～20mM的磷酸盐缓冲液。
较佳的，所述步骤C包涵体蛋白复性具体为：将上一步的蛋白峰洗出液通过复性液进行蛋白复性，获得复性蛋白溶液；复性蛋白溶液中蛋白浓度为50～100ug/ml，复性8～16小时；所述复性液为含10～50mM NaCl，pH7.0～8.0，10~50mM的Tris缓冲液。
最佳的，所述步骤C包涵体蛋白复性具体为：将上一步的蛋白峰洗出液通过复性液进行蛋白复性，获得复性蛋白溶液；复性蛋白溶液中蛋白浓度为80～100ug/ml，复性14～16小时；所述复性液为含10～20mM NaCl，pH7.5±0.1，10～20mM的Tris缓冲液。
较佳的，所述步骤D阴离子交换层析具体为：用平衡液平衡填充有Q Sepharose F.F.的离子柱，将上一步骤获得的复性蛋白溶液上柱后，淋洗离子柱，最后用洗脱液洗脱，得到重组链霉亲和素。
更佳的，步骤D所述平衡液为pH8.0～9.0，10~50mM的Tris缓冲溶液；洗脱液为含100～400mM NaCl，pH值8.0～8.5，l0~50mM的磷酸盐缓冲液。复性蛋白溶液上柱的流速为20mL/min，结束后用4~5倍柱床体积的平衡液淋洗。
最佳的，步骤D所述平衡液为pH8.5±0.1，10～20mM的Tris缓冲溶液；洗脱液为含100～200mM NaCl，pH值8.0～8.5，10～20mM的磷酸盐缓冲液。
较佳的，所述步骤E凝胶过滤层析具体为：用2-3倍柱体积平衡液平衡填充有Superdex75的层析柱后，将上一步获得的重组链霉亲和素上柱，然后用洗脱液进行洗脱，得到进一步纯化的目的蛋白。
更佳的，步骤E所述平衡液为pH5.0～7.0，10~50mM的磷酸盐缓冲液；洗脱液为pH5.0～7.0，10~50mM的磷酸盐缓冲液。目的蛋白上柱的流速为3mL/min。
最佳的，步骤E所述平衡液为pH 6.0±0.5，10～20mM的磷酸盐缓冲液；洗脱液为pH6.0±0.5，10～20mM的磷酸盐缓冲液。
本发明的链霉亲和素的制备工艺可以达到500mg/L的最终纯蛋白产量，远远高于目前国际所述的109.76mg/L的蛋白表达量，蛋白活性基本一致甚至更高，并且目的蛋白纯度高达98%。可见本发明蛋白纯化工艺简单，成本低廉，便于工业化生产。
附图说明
图1：pET-21a(+)载体物理图谱
图2：重组链霉亲和素（Streptavidin）蛋白在转化体E.coli内表达的SDS-PAGE电泳分析（M：标准蛋白质分子量；1：诱导前；2：诱导4小时）
图3：30升发酵罐发酵重组链霉亲和素（Streptavidin）蛋白在转化体内表达的SDS-PAGE电泳分析（M：标准蛋白质分子量；1：诱导前；2：诱导4小时）
图4：离子交换柱SP纯化后的重组链霉亲和素（Streptavidin）蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果（M：标准蛋白质分子量；1：SP柱纯化前样品；2：SP柱纯化流穿样品；3：SP柱纯化洗脱样品）
图5：离子交换柱Q纯化后的重组链霉亲和素（Streptavidin）蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果（M：标准蛋白质分子量；1：Q柱纯化前样品；2：Q柱纯化流穿样品；3：Q柱纯化洗脱样品）
图6：凝胶过滤纯化后的重组链霉亲和素（Streptavidin）蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果（M：标准蛋白质分子量；1：室温处理样品；2：95℃加热处理样品）
注：标准蛋白质分子量（从上至下）：99K、66K、45K、30K、20K、14.4K
具体实施方式
本发明利用基因工程的方法，人工合成表达重组链霉亲和素的重组基因，将该重组基因序列插入表达载体，转化宿主细胞，通过发酵，分离纯化等步骤获得重组链霉亲和素（核心链霉亲和素）。
以下为本发明的具体实施例，用于进一步理解本发明的技术方法，但不以任何形式限制本发明的保护范围。
实施例1基因工程菌的制备
1.人工合成表达重组链霉亲和素的重组基因
重组基因的序列包括核心链霉亲和素基因序列（SEQ ID NO:3），并且核心链霉亲和素基因序列左右两侧分别引入Nde I酶和Hind III酶的限制酶切位点；重组基因全序列由上海生工生物工程公司合成，序列如SEQ ID NO:1所示。
2.重组质粒的构建
1）表达载体的构建
将人工合成的重组链霉亲和素基因序列经Nde I/Hind III双酶切后克隆于经NdeI/Hind III双酶切的Pet21a(+)中，T4DNA连接酶（Promega公司）用于连接反应，连接反应温度为2～16℃，1～30小时，获得重组质粒。
2）表达载体的鉴定
CaCl2法（分子克隆实验指南，第二版，科学出版社）将重组质粒转化DH5α菌，Amp抗性筛选阳性克隆，再经Nde I和Hind III双酶切鉴定得到重组质粒pET21a(+)-SA，结果表明已获得正确插入重组链霉亲和素（Streptavidin）基因表达载体。
以T7terminatorprimer为引物，以PET21a(+)-SA为模板，对该重组质粒中的重组链霉亲和素基因进行序列分析，结果表明：以此DNA序列推导的重组链霉亲和素的氨基酸序列与文献报道及实验设计完全一致。重组质粒用T7terminator引物测序的序列结果见SEQ IDNO:2。
3.基因工程菌的制备
1）构建基因工程菌
将重组质粒pET21a(+)-SA以CaCl2法（分子克隆实验指南，第二版，科学出版社）转化受体菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。选择表达相对最高的一株作为重组链霉亲和素表达之工程菌（pET21a(+)-SA/BL21(DE3)）。
2）表达产物的鉴定
将经筛选的重组链霉亲和素基因工程菌划线在含100ul/ml氨苄青酶素的LB琼脂平板上，37℃培养16小时。挑选生长良好的单菌落，接种于LB培养液（含Amp l00ug/ml），37℃培养过夜。将过夜菌以1：50接种于20ml LB培养液中（含Amp l00ug/rnl），37℃振荡培养。
当菌液OD600达0.6-0.8时，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导4小时。菌液经5000rpm，离心5min，去培养基上清，向菌体沉淀中加入上样缓冲液，100℃水浴3min，离心后上SDS-PAGE电泳（积层胶5％，分离胶15％），染色，脱色，扫描分析，SDS-PAGE电泳结果见图2。
现有技术已知重组链霉亲和素基因长384bp，含有128个氨基酸，理论分子量约为13.4KD。由图2可知，电泳结果显示在14.4K下方有明显表达条带，与预期相符，并且链霉亲和素蛋白占菌体总蛋白的30％左右。
实施例2发酵表达重组链霉亲和素
1）种子活化：
自保存的实施例1制备的基因工程菌斜面上取一环菌种接入30ml LB培养液中（含100ug/ml氨苄青酶素），37℃，200rpm摇瓶培养15小时。
2）种子液的制备：
取步骤1）的活化种子，按10％接种量接于2000ml M9+LB培养液中（含100ug/ml氨苄青酶素），37℃，250rpm摇瓶培养6小时。
3）30升发酵罐发酵：
将步骤2）的种子液按6％接种量加入装有M9+LB培养基的发酵罐中，37℃，控制PH值在7.0左右，由通气及搅拌速度控制溶氧在30％以上。OD600为20～30时，加入IPTG至终浓度为0.5rnM，诱导4.0小时收菌。
4）SDS-PAGE检测重组蛋白表达量：
SDS-PAGE电泳检测（积层胶3％，分离胶10％），电泳结果见图3，目的蛋白分子量约为13.4KD，约占菌体总蛋白的30％左右。
实施例3重组蛋白纯化工艺
1.菌体处理
将发酵培养后的菌体4℃，9000rpm离心25分钟，弃上清液。用10倍菌体重量的磷酸盐缓冲液（pH6.0～9.0）悬浮菌体，然后APV-1000匀浆机（Invensys公司）循环破菌2次。4℃，9000rpm离心30分钟，取沉淀。
2.五步纯化法分离纯化目的蛋白：
本次实验的五步纯化法所用设备为通用电气公司（GE）AKTAPurifier 100或者AKTAPrimer，所有填料均为该公司产品；五步纯化法的具体条件及参数见方法一至方法三。
方法一：
1）菌体破碎，收集沉淀(包涵体)，将菌体沉淀用含10mM NaCl，8M尿素，pH4.5±0.1，20mM的磷酸盐缓冲液充分搅拌溶解，12000g离心15分钟取上清。
2）SP Sepharose F.F.离子交换层析：先用含10mM NaCl，8M尿素，pH4.5±0.1，20mM的磷酸盐缓冲液平衡离子交换柱，将上一步获得的上清液以10mL/min的流速上柱，（柱床体积200mL），用4倍柱床体积的平衡液清洗离子柱；再用含100mM NaCl，8M尿素，pH6.0±0.1，20mM的磷酸盐缓冲液脱目的蛋白，收集蛋白峰洗出液，得到变性后的包涵体蛋白；经过离子交换柱SP层析纯化后的变性后的包涵体蛋白经SDS-PAGE检测纯度达到70%以上，电泳结果见图4。
3）变性蛋白的复性：将上一步所收集蛋白峰洗出液用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白浓度后，通过稀释复性法进行蛋白复性，复性液中蛋白浓度为100ug/ml，复性14小时。复性液为含10mMNaCl，pH7.5±0.1，20mM的Tris缓冲液。
4）Q Sepharose F.F离子交换层析：用pH8.5，20mM的Tris缓冲溶液平衡柱后，将上一步复性后的蛋白溶液上柱，流速为20mL/min（柱床体积约200mL），清洗后以含200mMNaCl，pH值8.5，20mM的磷酸盐缓冲液洗脱，得到重组链霉亲和素。经过离子交换柱Q层析后的目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测纯度达95％以上，电泳结果见图5。
5）Superdex 75凝胶过滤层析：通过pH6.0±0.5，20mM的磷酸盐缓冲液平衡柱后，将上一步获得的目的蛋白上柱，流速为3mL/min（柱床体积320mL）；用pH6.0±0.5，20mMmM的磷酸盐缓冲液进行洗脱，得到进一步纯化的目的蛋白。重组蛋白经凝聚过滤层析后，SDS-PAGE电泳和HPLC检测其纯度高达98％以上，电泳结果见图6。不经过加热处理的样品SDS-PAGE的大小和文献报道一样，分子量是单体分子量的4倍左右。
方法二：
1）菌体破碎，收集沉淀(包涵体)，将菌体沉淀用含15mM NaCl，6M尿素，pH4.0，50mM的磷酸盐缓冲液充分搅拌溶解，离心取上清。
2）SP Sepharose F.F.离子交换层析：先用含15mM NaCl，6M尿素，pH4.0，50mM的磷酸盐缓冲液平衡离子交换柱，将上一步获得的上清液以10mL/min的流速上柱，（柱床体积200mL），用4倍柱床体积的平衡液清洗离子柱；再用含500mM NaCl，6M尿素，pH5.0，50mM的磷酸盐缓冲液脱目的蛋白，收集蛋白峰洗出液，得到变性后的包涵体蛋白。
3）变性蛋白的复性：将上一步所收集蛋白峰洗出液用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白浓度后，通过稀释复性法进行蛋白复性，复性液中蛋白浓度为80ug/ml，复性16小时。复性液为含50mM NaCl，pH7.0，50mM的Tris缓冲液。
4）Q Sepharose F.F离子交换层析：用pH8.0，50mM的Tris缓冲溶液平衡柱后，将上一步复性后的蛋白溶液上柱，流速为20mL/min（柱床体积约200mL），清洗后以含100mMNaCl，pH值8.0，50mM的磷酸盐缓冲液洗脱，得到重组链霉亲和素。
5）Superdex 75凝胶过滤层析：通过pH5.0，50mM的磷酸盐缓冲液平衡柱后，将上一步获得的目的蛋白上柱，流速为3mL/min（柱床体积320mL）；用pH5.0，50mM mM的磷酸盐缓冲液进行洗脱，得到进一步纯化的目的蛋白，并且经计算，纯化前每升发酵液中表达的目的蛋白的量为750mg左右，纯化后目的蛋白的最终纯蛋白产量为500mg/L。
方法三：
1）菌体破碎，收集沉淀(包涵体)，将菌体沉淀用含5mM NaCl，4M尿素，pH5.5，10mM的磷酸盐缓冲液充分搅拌溶解，离心取上清。
2）SP Sepharose F.F.离子交换层析：先用含5mM NaCl，4M尿素，pH5.5，10mM的磷酸盐缓冲液平衡离子交换柱，将上一步获得的上清液以10mL/min的流速上柱，（柱床体积200mL），用5倍柱床体积的平衡液清洗离子柱；再用含150mM NaCl，4M尿素，pH7.0，10mM的磷酸盐缓冲液脱目的蛋白，收集蛋白峰洗出液，得到变性后的包涵体蛋白。
3）变性蛋白的复性：将上一步所收集蛋白峰洗出液用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白浓度后，通过稀释复性法进行蛋白复性，复性液中蛋白浓度为50ug/ml，复性8小时。复性液为含20mM NaCl，pH8.0，10mM的Tris缓冲液。
4）Q Sepharose F.F离子交换层析：用pH9.0，10mM的Tris缓冲溶液平衡柱后，将上一步复性后的蛋白溶液上柱，流速为20mL/min（柱床体积约200mL），清洗后以含400mMNaCl，pH值8.5，10mM的磷酸盐缓冲液洗脱，得到重组链霉亲和素。
5）Superdex 75凝胶过滤层析：通过pH7.0，10mM的磷酸盐缓冲液平衡柱后，将上一步获得的目的蛋白上柱，流速为3mL/min（柱床体积320mL）；用pH7.0，10mM mM的磷酸盐缓冲液进行洗脱，得到进一步纯化的目的蛋白。
Claims (4)
1.一种重组链霉亲和素的制备工艺，具体步骤如下：
1)人工合成表达重组链霉亲和素的重组基因，所述重组基因的序列包括核心链霉亲和素基因序列以及位于核心链霉亲和素基因序列左右两侧的限制性酶切位点序列，其中所述核心链霉亲和素基因序列如SEQ ID NO:3所示，并且所述位于核心链霉亲和素基因序列左右两侧的限制性酶切位点分别为Nde I酶和Hind III酶的限制酶切位点,并且所述人工合成的表达重组链霉亲和素的重组基因序列如SEQ ID NO:1所示；
2)重组质粒的构建：将步骤1)的重组基因插入载体，获得能够表达重组链霉亲和素的重组质粒，其中所述载体为pET21a(+)，并且插入位点为Nde I/Hind III位点；
3)基因工程菌的制备：将步骤2)获得的重组质粒转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)，从而制备基因工程菌；
4)外源基因的表达：基因工程菌发酵表达重组链霉亲和素；
5)目的蛋白的分离纯化：裂解菌体，通过蛋白纯化步骤获得重组链霉亲和素；
其中，所述蛋白纯化步骤采用五步纯化法，该五步纯化法依次为包涵体溶解、阳离子交换层析、包涵体蛋白复性、阴离子交换层析以及凝胶过滤层析。
2.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述的基因工程菌是用如下步骤制备的：
(a)表达载体的构建：将人工合成的如SEQ ID NO.:1所示的重组链霉亲和素基因序列经Nde I/Hind III双酶切后克隆于经Nde I/Hind III双酶切的pET21a(+)中，T4DNA连接酶用于连接反应，连接反应温度为2～16℃，1～30小时，获得重组质粒pET21a(+)-SA；
(b)表达载体的鉴定：用CaCl2法，将重组质粒转化DH5α菌，Amp抗性筛选阳性克隆，再经Nde I和Hind III双酶切鉴定得到重组质粒pET21a(+)-SA，从而获得正确插入重组链霉亲和素基因表达载体；并以T7terminator primer为引物，以pET21a(+)-SA为模板，对该重组质粒中的重组链霉亲和素基因进行序列分析，结果表明：序列正确；
(c)构建基因工程菌：将重组质粒pET21a(+)-SA以CaCl2法转化受体菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆，作为所述基因工程菌。
3.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述五步纯化法具体步骤为：
A.包涵体溶解：尿素溶液变性包涵体蛋白；
B.阳离子交换层析：SP Sepharose F.F.层析柱初步分离步骤A变性后的包涵体蛋白；
C.包涵体蛋白复性：将上一步初步分离的变性后的包涵体蛋白，采用稀释复性的方法复性，获得复性蛋白溶液；
D.阴离子交换层析：用Q Sepharose F.F层析柱纯化步骤C所得的复性蛋白溶液，获得重组链霉亲和素；
E.凝胶过滤层析：Superdex 75凝胶过滤层析进一步纯化步骤D获得的重组链霉亲和素，收集进一步纯化的目的蛋白。
4.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述纯化方法的具体操作如下：
1)菌体破碎，收集沉淀即包涵体，将菌体沉淀用含15mM NaCl，6M尿素，pH4.0，50mM的磷酸盐缓冲液充分搅拌溶解，离心取上清；
2)SP Sepharose F.F.离子交换层析：先用含15mM NaCl，6M尿素，pH4.0，50mM的磷酸盐缓冲液平衡离子交换柱，将上一步获得的上清液以10mL/min的流速上柱，其中柱床体积为200mL，用4倍柱床体积的平衡液清洗离子柱；再用含500mM NaCl，6M尿素，pH5.0，50mM的磷酸盐缓冲液脱目的蛋白，收集蛋白峰洗出液，得到变性后的包涵体蛋白；
3)变性蛋白的复性：将上一步所收集蛋白峰洗出液用考马氏亮蓝染色法测定蛋白浓度后，通过稀释复性法进行蛋白复性，复性液中蛋白浓度为80μg/ml，复性16小时；复性液为含50mM NaCl，pH7.0，50mM的Tris缓冲液；
4)Q Sepharose F.F离子交换层析：用pH8.0，50mM的Tris缓冲溶液平衡柱后，将上一步复性后的蛋白溶液上柱，流速为20mL/min，其中柱床体积为200mL，清洗后以含100mM NaCl，pH值8.0，50mM的磷酸盐缓冲液洗脱，得到重组链霉亲和素；
5)Superdex75凝胶过滤层析：通过pH5.0，50mM的磷酸盐缓冲液平衡柱后，将上一步获得的目的蛋白上柱，流速为3mL/min，其中柱床体积为320mL；用pH5.0，50mM的磷酸盐缓冲液进行洗脱，得到进一步纯化的目的蛋白。
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