CN106755034B - 一种人核糖体蛋白s5的表达提取纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程、特别是蛋白质工程技术领域。本发明提供一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，本发明的人核糖体蛋白RPS5的原核表达不带标签，并通过工程菌破碎、变性蛋白阳离子交换层析纯化、变性蛋白阴离子交换层析纯化、变性蛋白复性以及凝胶过滤层析纯化，大大提高了人核糖体蛋白S5蛋白的表达量及总收率，也提高了最终产品的纯度，降低了生产成本，有利于大规模工业化生产。

Description

一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法
技术领域
本发明涉及生物工程、特别是蛋白质工程技术领域，涉及一种通过基因工程得到的重组蛋白－人核糖体蛋白S5的表达、提取、纯化方法。
背景技术
人核糖体蛋白S5(ribosomal protein S5,RPS5)是人类核糖体40S亚基上的一个蛋白，属于S7P核糖体蛋白家族，GenBank:AB061853.2；NCBI Reference Sequence:NM_001009.3。人们发现在肝硬化的肝星状细胞中该蛋白的表达异常，显示RPS5是潜在的药物作用靶点(参考文献：Wei-Heng Xu,Hong-Gang Hu,Yuan Tian,Shao-Zhan Wang,Jie Li,Jian-Zhong Li,Xing Deng,Hui Qian,Lei Qiu,Zhen-Lin Hu,Qiu-Ye Wu,Yi-Feng Chai,Cheng Guo,Wei-Fen Xie,and Jun-Ping Zhang.Bioactive Compound Reveals a NovelFunction for Ribosomal Protein S5 in Hepatic Stellate Cell Activation andHepatic Fibrosis[J].HEPATOLOGY.2014；60:648-660.)。中国发明专利申请CN201310057096.0公开了核糖体蛋白S5在催化蛋白质分子发生脱磷酸化反应中的用途，申请公布号为CN103160557A。
据文献报道，带有六聚组氨酸标签的RPS5已能大量表达并且形成包涵体，在变性条件下纯化后，通过稀释法复性(参考文献：Alexey Malygin,Oxana Baranovskaya,AntonIvanov,and Galina Karpova.Expression and purification of human ribosomalproteins S3,S5,S10,S19,and S26[J].ProteinExpression and Purification.2003；28:57-62.)，但是六聚组氨酸标签还得后期去除，不仅工艺复杂而且成本提高。另外，目前的重组表达的RPS5蛋白最终产品存在产量低、纯度低的缺陷。
不带标签的RPS5的表达纯化方法目前尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法。
本发明旨在提供一种不带标签的RPS5的制备方法，涉及人核糖体蛋白RPS5的原核表达载体构建、原核表达及提取、纯化、复性的方法；该方法能够有效解决RPS5蛋白最终产品产量低、纯度低的缺陷。
本发明人研究发现，不带标签的RPS5的表达纯化的技术难度主要在表达时培养基的优化、初步纯化后蛋白的复性等地方。本发明人设计阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的技术方案，并进一步筛选了各步层析所用的方法和参数，特别改变同一种缓冲液梯度层析的方法，用不同的缓冲液组合，并优化配比、浓度、pH值等条件，最终完成本发明。
本发明的第一方面，提供一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法。
所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，包括以下步骤：
A、RPS5的原核表达及工程菌破碎
B、RPS5变性蛋白阳离子交换层析纯化
C、RPS5变性蛋白阴离子交换层析纯化
D、RPS5变性蛋白复性
E、RPS5蛋白凝胶过滤层析纯化
步骤A，原核表达RPS5后，所述的RPS5工程菌破碎方法具体为：4℃高速离心收集原核表达RPS5的工程菌的菌体，按照1g菌体湿重使用10mL第一缓冲液悬浮，置于冰上超声破碎，参数为功率300w、工作时间3s、间隙时间3s、工作次数99次，高速离心去掉上清；直到离心上清液淡黄色消失为止。
所述的原核表达RPS5的方法，较优的，原核表达所用的LB培养基中添加1％～10％(质量体积比)的葡萄糖或者甘油，优选5％的葡萄糖。本发明经实验发现，在大肠杆菌原核表达时所用的培养基中添加葡萄糖或甘油，RPS5可得到大量表达。
所用的原核表达载体可选自：pET-28a(+)等。
所述的工程菌，可选自大肠杆菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。
步骤B，所述RPS5变性蛋白阳离子交换层析纯化方法具体为：在第二缓冲液条件下溶解RPS5包涵体蛋白，高速离心去掉不溶物，上清液上样于阳离子交换层析柱，使用第二缓冲液充分洗涤杂蛋白，使用第三缓冲液再次充分洗去杂蛋白，最后使用第四缓冲液洗脱目的蛋白。
所述的阳离子交换层析柱可选自：CM阳离子交换层析柱、SP阳离子交换层析柱等。
步骤C，所述RPS5变性蛋白阴离子交换层析纯化方法具体为：使用第八缓冲液透析从阳离子层析柱洗脱下来的目的蛋白溶液，在第八缓冲液条件下，将目的蛋白上样于阴离子交换层析柱，收集穿透液。
所述的阴离子交换层析柱可选自：DEAE阴离子交换层析柱、Q阴离子交换层析柱等。
步骤D，所述RPS5变性蛋白复性的方法具体为：在4℃条件下，使用透析的方法逐步降低变性剂浓度至完全去除变性剂来复性RPS5蛋白。
优选的方法为：纯化好的RPS5变性蛋白溶液开始透析于第九缓冲液中6h以上，然后每隔3h使用预冷的第十缓冲液置换1/5、2/5、3/5、4/5体积的透析液，最后完全使用第十缓冲液透析蛋白溶液两次；高速离心得到的上清液即为复性的RPS5蛋白溶液；复性的RPS5蛋白溶液保存于4℃条件下。
步骤E，所述RPS5蛋白凝胶过滤层析纯化方法具体为：使用截留分子量为10kDa的超滤管浓缩复性好的RPS5蛋白，上样于预先使用第十缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱，使用第十缓冲液洗脱至出峰，收集蛋白峰。
所述的凝胶过滤层析柱可选自：Superdex 75凝胶过滤层析柱、SephadexG75凝胶过滤层析柱等。
本发明所述各个缓冲液成分的配比和浓度分别为：
第一缓冲液：40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH 7.2
第二缓冲液：8mol/L尿素/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH 7.2
第三缓冲液：8mol/L尿素/20mmol/L NaCl/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH7.2
第四缓冲液：8mol/L尿素/300mmol/L NaCl/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH 7.2
第五缓冲液：1mmol/L DTT/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH 7.2
第六缓冲液：1mmol/L DTT/20mmol/L NaCl/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH 7.2
第七缓冲液：1mmol/L DTT/300mmol/L NaCl/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH 7.2
第八缓冲液：8mol/L尿素/10mmol/L-30mmol/L(优选20mmol/L)Tris pH 8.0
第九缓冲液：8mol/L尿素/50mmol/L-150mmol/L(优选100mmol/L)Hepes/1mmol/LDTT pH 7.2
第十缓冲液：50mmol/L-150mmol/L(优选100mmol/L)Hepes/1mmol/L DTT pH 7.2
本发明研究发现，在RPS5的复性过程及复性后的蛋白缓冲液系统中不能含有NaCl等无机盐，否则RPS5蛋白会发生沉淀。因此，本发明从第八缓冲液之后不再用含NaCl的缓冲液，而是缓冲液中只有Na+(例如Hepes缓冲液中的Na+)或者Cl-(例如Tris缓冲液中的Cl-)时，这样蛋白就不会沉淀。
进一步地，在本发明的一个优选实施例中，RPS5的原核表达载体构建具体为：
PCR扩增两端带有Nco I酶和BamH I酶酶切位点的RPS5基因片段，上游引物为5’-TAACCATGGCGACCGAGTGGGAGAC-3’(SEQ ID NO:1)；下游引物为5’-GATGGATCCTCAGCGGTTGGACTTG-3’(SEQ ID NO:2)；所使用的表达载体为pET-28a(+)，PCR扩增产物插入的酶切位点为Nco I和BamH I之间。使用质粒PCR法鉴定出阳性克隆。
RPS5的原核表达方法具体为：所使用的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)种，所使用的培养基为添加了1％-10％葡萄糖或者甘油(优选5％葡萄糖)的LB培养基，工程菌起始诱导菌液OD600＝1.6±0.1，诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.2mmol/L；诱导时间为3h；诱导温度为37℃。
本发明的有益效果如下：
使用本发明方法纯化好的RPS5蛋白使用SDS-PAGE检测，银染结果显示蛋白为单一条带，纯度很高。考马斯亮蓝染色后使用脱色液脱色，使用光密度法测其纯度，结果显示其纯度可达99％以上。超滤浓缩后，使用BCA法测定其浓度，可达3mg/mL。
本发明大大提高了人核糖体蛋白S5蛋白的表达量及总收率，也提高了最终产品的纯度，降低了生产成本，有利于大规模工业化生产。
附图说明
图1为质粒PCR法鉴定阳性克隆电泳图；
图2A为RPS5工程菌原核表达蛋白电泳图；
图2B为RPS5工程菌在LB培养基中表达蛋白电泳图；
图2C为RPS5工程菌分别在添加了葡萄糖和甘油的LB培养基中表达蛋白电泳图；
图2D为RPS5工程菌在添加了不同浓度葡萄糖的LB培养基中表达蛋白电泳图；
图3为RPS5使用CM阳离子交换层析纯化电泳图；
图4为RPS5使用DEAE阴离子交换层析纯化电泳图，左列1为上DEAE柱纯化前的蛋白样品；右列2为过DEAE柱的穿透液，也即使用DEAE柱纯化后的蛋白样品；
图5为RPS5复性缓冲液优化电泳图，其中0为复性前样品，1为使用第二缓冲液和第五缓冲液复性的蛋白，2为使用第三缓冲液和第六缓冲液复性的蛋白，3为使用第四缓冲液和第七缓冲液复性的蛋白，4为使用第九缓冲液和第十缓冲液复性的蛋白；
图6为RPS5电泳银染图，左列为蛋白Marker，右列1为纯化后的RPS5蛋白；
图7为RPS5纯度(光密度法)电泳图。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：人核糖体蛋白RPS5的原核表达
一、RPS5原核表达载体的构建
PCR扩增两端带有Nco I酶和BamH I酶酶切位点的RPS5基因片段，上游引物为5’-TAACCATGGCGACCGAGTGGGAGAC-3’(SEQ ID NO:1)；下游引物为5’-GATGGATCCTCAGCGGTTGGACTTG-3’(SEQ ID NO:2)。
使用KOD Plus聚合酶(购自TOYOBO公司)扩增，反应程序参数为：
1、变性94℃3min；
2、变性94℃30s；
3、退火58℃30s；
4、延伸68℃40s；
5、延伸68℃5min；
6、结束4℃保存。
第2步至第4步循环30次。
空载pET-28a(+)质粒(购自Novagen公司)使用大肠杆菌DH5α扩增，质粒小量提取试剂盒(购自天根公司)提取质粒，纯度为A260/A230＞1.8、A260/A280＞1.8。
使用Nco I酶和BamH I酶双酶切RPS5基因片段和空载pET-28a(+)质粒。
使用T4DNA连接酶连接酶切好的RPS5基因片段和空载pET-28a(+)质粒。
连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB平板培养单克隆菌落。
挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒，以质粒作为模板进行PCR(615bp)，筛选阳性克隆子，见图1，图1中0为PCR产物阳性对照，2、3、6、7、8为阳性克隆子。
二、RPS5重组蛋白原核表达
将重组质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中，在LB培养基平板上培养单克隆菌落。
挑取单菌落于LB液体培养基中摇菌过夜。
将过夜培养物按1％的体积比例接种于添加了5％葡萄糖的新鲜LB培养基中。37℃/250rpm条件下培养至菌液OD600为1.6±0.1。
加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，购自上海生工公司)至终浓度为0.2mmol/L，继续摇菌10h，期间每隔一个小时取一次菌液样品用于电泳，诱导温度为37℃。
结果显示，诱导2h以上时，蛋白表达量最大并达到稳定，见图2A，图中1为诱导前样品对照，2～11为诱导1h～10h时的样品。
三、本发明原核表达培养基的优化：
i)将过夜培养物按1％的体积比例接种于新鲜LB培养基中。37℃/250rpm条件下培养至菌液OD600为1.6±0.1。
加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L，继续摇菌4h，期间每隔半个小时取一次菌液样品用于电泳，诱导温度为37℃。
结果显示，使用单纯的LB培养基时，RPS5蛋白表达量极少，如图2B中箭头所示，图中1为诱导前样品对照，2～9为诱导0.5h～4h时的样品。
ii)将过夜培养物按1％的体积比例接种于分别添加了1％的葡萄糖和甘油的新鲜LB培养基中。37℃/250rpm条件下培养至菌液OD600＝1.6±0.1。
加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L，继续摇菌4h，取菌液样品用于电泳，诱导温度为37℃。
结果显示，使用添加了葡萄糖或者甘油的LB培养基时，RPS5蛋白表达量大大增多，并且同等条件下，添加葡萄糖比添加甘油更利于蛋白表达量的增加，如图2C中箭头所示，图中1为诱导前样品对照，2添加葡萄糖的样品，3为添加甘油的样品。
iii)将过夜培养物按1％的体积比例接种于分别添加了0.5％、1％、2.5％、5％、10％的葡萄糖的新鲜LB培养基中。37℃/250rpm条件下培养至菌液OD600＝1.6±0.1。
加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L，继续摇菌4h，取菌液样品用于电泳，诱导温度为37℃。
结果显示，使用添加了所述浓度葡萄糖的LB培养基时，RPS5蛋白均有大量表达，并且同等条件下，添加5％葡萄糖时蛋白表达量最大，如图2D中箭头所示，图中1为诱导前样品对照，2～6分别为添加了0.5％、1％、2.5％、5％、10％的葡萄糖的样品。
实施例2：RPS5重组蛋白的提取纯化
A、RPS5工程菌破碎
4℃条件下高速离心收集菌体沉淀，1L发酵液可得到大约6g的菌体湿重，并使用第一缓冲液清洗一次菌体沉淀。
按照1g菌体沉淀使用10mL第一缓冲液悬浮的比例悬浮菌体。在冰上进行超声破碎，设置参数为工作时间3s，间隙时间3s，工作次数99次，工作功率300w。超声两个循环后，4℃高速离心去掉上清液，沉淀使用第一缓冲液再清洗一次。悬浮沉淀，再次进行超声破碎，直到离心上清液无淡黄色为止。
所述的第一缓冲液：50mmol/L NaH2PO4pH 7.2
所述的第一缓冲液的配制具体如下：
i)产生最终浓度为40mmol/L-60mmol/L(例如50mmol/L)NaH2PO4的溶液(例如1L)；
ii)使用氢氧化钠溶液将溶液的pH调节至6.5-8.0(例如7.2)，由此获得第一缓冲液。
B、RPS5变性蛋白阳离子交换层析纯化
按照1g包涵体蛋白使用15mL第二缓冲液悬浮溶解，高速离心去掉沉淀(不溶物)。
上清上样于预先使用第二缓冲液平衡的阳离子交换层析柱(优选CM阳离子交换层析柱，购自上海生工公司，型号：CM SefinoseTM FF琼脂糖)。
使用第二缓冲液充分洗掉杂蛋白，使用第三缓冲液再次洗杂蛋白。
使用第四缓冲液洗脱目的蛋白，收集目的蛋白峰。
结果：包涵体表达得到了初步纯化，见图3，图中1为包涵体溶解液，2为层析穿透液，3为第一次洗杂蛋白溶液，4为第二次洗杂蛋白溶液，5为目的蛋白洗脱液。
第二缓冲液：8mol/L尿素/50mmol/L NaH2PO4pH 7.2
第三缓冲液：8mol/L尿素/20mmol/L NaCl/50mmol/L NaH2PO4pH 7.2
第四缓冲液：8mol/L尿素/300mmol/L NaCl/50mmol/L NaH2PO4pH 7.2
这几个缓冲液的配制具体如下：
i)产生最终浓度为8mol/L尿素和40mmol/L-60mmol/L(例如50mmol/L)NaH2PO4的溶液(例如1L)；
ii)使用氢氧化钠溶液将溶液pH调节至6.5-8.0(例如7.2)；
iii)收集2/4溶液，由此获得第二缓冲液；
iv)向来自步骤iii)的剩余2/4溶液中的1/4溶液中添加NaCl以获得5mmol/L-35mmol/L(例如20mmol/L)的最终NaCl浓度，由此获得第三缓冲液；
v)向来自步骤iii)的剩余1/4溶液中添加NaCl以获得250mmol/L-350mmol/L(例如300mmol/L)的最终NaCl浓度，由此获得第四缓冲液。
C、RPS5变性蛋白阴离子交换层析纯化
从阳离子交换层析柱洗脱下来的目的蛋白溶液使用第八缓冲液充分透析。目的是为了降低蛋白溶液中的盐浓度以及置换缓冲液。
透析好的蛋白溶液上样于预先使用第八缓冲液平衡的阴离子交换柱(优选DEAE阴离子交换柱，购自上海生工公司，型号：DEAE SefinoseTM FF琼脂糖)上。
接取样品穿透液，即为纯化好的变性蛋白溶液。
经过此步骤，RPS5蛋白得到进一步的纯化，见图4，图中1为进一步纯化前的蛋白样品，2为样品穿透液，即进一步纯化后的蛋白样品。
第八缓冲液：8mol/L尿素/20mmol/L Tris pH 8.0
所述第八缓冲液的配制具体如下：
i)产生最终浓度为8mol/L尿素和10mmol/L-30mmol/L(例如20mmol/L)Tris(三羟甲基氨基甲烷，购自上海生工公司)的溶液(例如1L)；
ii)使用氢氧化钠溶液将溶液的pH调节至7.5-8.5(例如8.0)，由此获得第八缓冲液。
D、RPS5变性蛋白复性
在4℃条件下，纯化好的RPS5变性蛋白溶液开始透析于第九缓冲液中3h-9h(例如6h)。
倒出1/5体积的透析液，加入预冷的相同体积的第十缓冲液，透析2h-6h(例如3h)。
倒出2/5体积的透析液，加入预冷的相同体积的第十缓冲液，透析2h-6h(例如3h)。
倒出3/5体积的透析液，加入预冷的相同体积的第十缓冲液，透析2h-6h(例如3h)。
倒出4/5体积的透析液，加入预冷的相同体积的第十缓冲液，透析2h-6h(例如3h)。
将透析液全部置换成预冷的相同体积的第十缓冲液，透析3h-9h(例如6h)。
将透析液全部置换成预冷的相同体积的第十缓冲液，透析3h-9h(例如6h)。
将透析好的蛋白溶液高速离心，高速离心得到的上清液即为复性的RPS5蛋白溶液，保存上清蛋白溶液于4℃环境中。
第九缓冲液：8mol/L尿素/100mmol/L Hepes/1mmol/L DTT pH 7.2
第十缓冲液：100mmol/L Hepes/1mmol/L DTT pH 7.2
所述第九缓冲液的配制具体如下：
i)产生最终浓度为8mol/L尿素和50mmol/L-150mmol/L(例如100mmol/L)Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，购自上海生工公司)的溶液(例如1L)
ii)使用氢氧化钠溶液将溶液的pH调节至6.6-7.6(例如7.2)；
iii)向来自步骤ii)的溶液中添加DTT(二硫苏糖醇，购自上海生工公司)以获得0.5mmol/L-2.0mmol/L(例如1.0mmol/L)的最终DTT浓度，由此获得第九缓冲液。
所述第十缓冲液的配制具体如下：
i)产生最终浓度为50mmol/L-150mmol/L(例如100mmol/L)Hepes的溶液(例如1L)
ii)使用氢氧化钠溶液将溶液的pH调节至6.6-7.6(例如7.2)；
iii)向来自步骤ii)的溶液中添加DTT以获得0.5mmol/L-2.0mmol/L(例如1.0mmol/L)的最终DTT浓度，由此获得第十缓冲液。
本发明复性缓冲液的优化：
来自步骤C的纯化后RPS5蛋白，在4℃条件下，分别透析于第二缓冲液、第三缓冲液、第四缓冲液、第九缓冲液中3h-9h(例如6h)。
各倒出1/5体积的透析液，分别加入预冷的相同体积的第五缓冲液、第六缓冲液、第七缓冲液、第十缓冲液，透析2h-6h(例如3h)。
各倒出2/5体积的透析液，分别加入预冷的相同体积的第五缓冲液、第六缓冲液、第七缓冲液、第十缓冲液，透析2h-6h(例如3h)。
各倒出3/5体积的透析液，分别加入预冷的相同体积的第五缓冲液、第六缓冲液、第七缓冲液、第十缓冲液，透析2h-6h(例如3h)。
各倒出4/5体积的透析液，分别加入预冷的相同体积的第五缓冲液、第六缓冲液、第七缓冲液、第十缓冲液，透析2h-6h(例如3h)。
分别将透析液全部置换成预冷的相同体积的第五缓冲液、第六缓冲液、第七缓冲液、第十缓冲液，透析3h-9h(例如6h)。
分别将透析液全部置换成预冷的相同体积的第五缓冲液、第六缓冲液、第七缓冲液、第十缓冲液，透析3h-9h(例如6h)。
分别将透析好的蛋白溶液高速离心，高速离心得到的上清液即为复性的RPS5蛋白溶液，保存上清蛋白溶液于4℃环境中。复性好的蛋白样品用SDS-PAGE检测。
结果显示使用Hepes缓冲液复性RPS5蛋白的效率大大高于磷酸盐缓冲液。如图5所示，图中0为复性前样品；1为使用第二缓冲液和第五缓冲液复性的蛋白；2为使用第三缓冲液和第六缓冲液复性的蛋白；3为使用第四缓冲液和第七缓冲液复性的蛋白；4为使用第九缓冲液和第十缓冲液复性的蛋白。
第二缓冲液：8mol/L尿素/50mmol/L NaH2PO4pH 7.2，同步骤B。
第三缓冲液：8mol/L尿素/20mmol/L NaCl/50mmol/L NaH2PO4pH 7.2，同步骤B。
第四缓冲液：8mol/L尿素/300mmol/L NaCl/50mmol/L NaH2PO4pH 7.2，同步骤B。
第五缓冲液：1mmol/L DTT/50mmol/L NaH2PO4pH 7.2
第六缓冲液：1mmol/L DTT/20mmol/L NaCl/50mmol/L NaH2PO4pH 7.2
第七缓冲液：1mmol/L DTT/300mmol/L NaCl/50mmol/L NaH2PO4pH 7.2
第九缓冲液：8mol/L尿素/100mmol/L Hepes/1mmol/L DTT pH 7.2，同步骤D。
第十缓冲液：100mmol/L Hepes/1mmol/L DTT pH 7.2，同步骤D。
上述几个缓冲液的配制具体如下：
第五缓冲液：
i)产生最终浓度为40mmol/L-60mmol/L(例如50mmol/L)NaH2PO4的溶液(例如1L)；
ii)使用氢氧化钠溶液将溶液pH调节至6.5-8.0(例如7.2)；
iii)向来自步骤ii)的溶液中添加DTT以获得0.5mmol/L-2.0mmol/L(例如1.0mmol/L)的最终DTT浓度，由此获得第五缓冲液。
第六缓冲液：
i)产生最终浓度为10mmol/L-30mmol/L(例如20mmol/L)NaCl和40mmol/L-60mmol/L(例如50mmol/L)NaH2PO4的溶液(例如1L)；
ii)使用氢氧化钠溶液将溶液pH调节至6.5-8.0(例如7.2)；
iii)向来自步骤ii)的溶液中添加DTT以获得0.5mmol/L-2.0mmol/L(例如1.0mmol/L)的最终DTT浓度，由此获得第六缓冲液。
第七缓冲液：
i)产生最终浓度为200mmol/L-400mmol/L(例如300mmol/L)NaCl和40mmol/L-60mmol/L(例如50mmol/L)NaH2PO4的溶液(例如1L)；
ii)使用氢氧化钠溶液将溶液pH调节至6.5-8.0(例如7.2)；
iii)向来自步骤ii)的溶液中添加DTT以获得0.5mmol/L-2.0mmol/L(例如1.0mmol/L)的最终DTT浓度，由此获得第七缓冲液。
E、RPS5蛋白凝胶过滤层析纯化方法
使用截留分子量为10kDa的超滤管浓缩复性好的RPS5蛋白。
浓缩的RPS5蛋白上样于预先使用第十缓冲液平衡好的Superdex 75(购自国药集团公司)凝胶过滤层析柱。
使用第十缓冲液洗脱至出峰，收集蛋白峰。
第十缓冲液：100mmol/L Hepes/1mmol/L DTT pH 7.2，同步骤D。
结果：纯化好的RPS5蛋白使用SDS-PAGE检测，银染结果(如图6中1号泳道所示)显示蛋白为单一条带，纯度很高。
考马斯亮蓝染色后使用脱色液脱色，使用光密度法测其纯度(如图7中1号泳道所示)，1.59/1.60＝99.37％，结果显示其纯度可达99％以上。超滤浓缩后，使用改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自上海生工公司)测定其浓度，可达3mg/mL。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法
<130> 说明书，权利要求书
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
taaccatggc gaccgagtgg gagac 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatggatcct cagcggttgg acttg 25

Claims (4)

1.一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，所述的方法包括以下步骤：
A、RPS5的原核表达及工程菌破碎：
RPS5原核表达的工程菌用大肠杆菌，表达所用的LB培养基中添加1％～10％的葡萄糖或者甘油；
原核表达RPS5后，RPS5工程菌破碎方法为：4℃高速离心收集原核表达RPS5的工程菌的菌体，按照1g菌体湿重使用10mL第一缓冲液悬浮，置于冰上超声破碎，高速离心去掉上清，直到离心上清液淡黄色消失为止；所述的第一缓冲液为：40-60mmol/LNaH2PO4，pH 7.2，
B、RPS5变性蛋白阳离子交换层析纯化：
在第二缓冲液条件下溶解RPS5包涵体蛋白，高速离心去掉不溶物，上清液上样于阳离子交换层析柱，使用第二缓冲液充分洗涤杂蛋白，使用第三缓冲液再次充分洗去杂蛋白，最后使用第四缓冲液洗脱目的蛋白，
所述的第二缓冲液为：8mol/L尿素和40-60mmol/LNaH2PO4，pH 7.2；
所述的第三缓冲液为：8mol/L尿素、20mmol/L NaCl和40-60mmol/L NaH2PO4，pH 7.2；
所述的第四缓冲液为：8mol/L尿素、300mmol/LNaCl和40-60mmol/L NaH2PO4，pH 7.2，
C、RPS5变性蛋白阴离子交换层析纯化：
使用第八缓冲液透析从阳离子柱洗脱下来的目的蛋白溶液，在第八缓冲液条件下，将目的蛋白上样于阴离子交换柱，收集穿透液；
所述的第八缓冲液为：8mol/L尿素和10mmol/L-30mmol/LTris，pH 8.0
D、RPS5变性蛋白复性：
纯化好的RPS5变性蛋白溶液开始透析于第九缓冲液中6h以上，然后每隔3h使用预冷的第十缓冲液置换1/5、2/5、3/5、4/5体积的透析液，最后完全使用第十缓冲液透析蛋白溶液两次；高速离心得到的上清液即为复性的RPS5蛋白溶液；复性的RPS5蛋白溶液保存于4℃条件下；
所述的第九缓冲液为：8mol/L尿素、50mmol/L-150mmol/L Hepes和1mmol/LDTT，pH7.2；
所述的第十缓冲液为：50mmol/L-150mmol/LHepes和1mmol/LDTT，pH 7.2，
E、RPS5蛋白凝胶过滤层析纯化：
使用截留分子量为10kDa的超滤管浓缩复性好的RPS5蛋白，上样于预先使用第十缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱，使用第十缓冲液洗脱至出峰，收集蛋白峰。
2.根据权利要求1所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，
步骤A中，冰上超声破碎的参数为功率300w、工作时间3s、间隙时间3s、工作次数99次。
3.根据权利要求1所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，
步骤A中的RPS5的原核表达为：
原核表达载体的构建：PCR扩增两端带有Nco I酶和BamH I酶酶切位点的RPS5基因片段，上游引物如SEQ ID NO:1所示；下游引物为如SEQ ID NO:2所示；所使用的表达载体为pET-28a(+)，PCR扩增产物插入的酶切位点为Nco I和BamH I之间，使用质粒PCR法鉴定出阳性克隆；
原核表达：使用的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)种，使用的培养基为添加了1％-10％的葡萄糖或者甘油的LB培养基，工程菌起始诱导菌液OD600＝1.6±0.1，诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.2mmol/L；诱导时间为3h；诱导温度为37℃。
4.根据权利要求1所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，
收集到的RPS5蛋白纯度达99％以上；浓度达3mg/mL以上。
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