CN103555742A

CN103555742A - 一种人活性颗粒酶a重组蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN103555742A
Application number: CN201310407820.8A
Authority: CN
Inventors: 江文正; 胡雪菲
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2013-09-09
Filing date: 2013-09-09
Publication date: 2014-02-05

Abstract

本发明公开一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法，利用PCR扩增得到人活性颗粒酶A基因，将其插入到与原核表达载体pET24a(+)相应酶切位点中，构建重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA，经转化大肠杆菌BL21后获得工程菌pET24a(+)-aGzmA/BL21。该工程菌经IPTG诱导后可表达人活性颗粒酶A重组蛋白，重组蛋白以包涵体的形式表达。利用镍亲和层析柱可以分离得到纯度高达95％以上的重组蛋白，且该重组蛋白经BLT底物溶液进行活性测定显示出较好的酶解活性。该方法具有成本低、操作简单、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白具有生物学活性和易于纯化。

Description

一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体地涉及了一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法。

背景技术

颗粒酶A(Granzyme A，GzmA)是一种存在于细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte，CTL)及天然杀伤性细胞(Natural killer，NK)中的丝氨酸蛋白酶。颗粒酶A主要诱导一种caspases非依赖性的细胞凋亡，它通过颗粒的胞吐作用释放，在穿孔素(Perforin)协同作用下进入靶细胞的细胞浆中，并聚集在细胞核，通过裂解SET复合物，释放的脱氧核糖核酸酶NM232H1对染色体DNA形成单股DNA链切(缺)口而引起DNA断裂，最终引起靶细胞的凋亡。近来的大量研究发现，在一些健康捐助者的血清中检测到了颗粒酶A的存在，而当炎症发生时，在血清和其他体液中可检测到更高水平的颗粒酶A，说明颗粒酶A除了具有细胞毒性功能外，还可能在细胞外发挥促进炎症和降解细胞外基质的功能，从而允许细胞毒性细胞接近组织内的靶细胞，但具体机制还有待进一步研究。因此，获得具有活性的人活性颗粒酶A重组蛋白对于开展其生物学功能及分子机制的研究具有重要的理论和实际意义。

大肠杆菌表达系统是一种简便、高效的原核表达系统，具有成本低、蛋白表达量高、操作简单等特点，并且可以将表达产物与His标签进行共表达，从而可以利用镍柱亲和层析法对目的蛋白进行分离和纯化。亲和层析纯化蛋白具有简单、快速、产物纯度高等优点，是蛋白分离纯化的最好方法之一。

N(a)-Benzyloxycarbonyl-L-lysine Thiobenz(BLT)是一种类胰蛋白酶和颗粒相关的丝氨酸酯酶高度敏感性的底物，被丝氨酸蛋白酶如颗粒酶A切割后，BLT能够与5,5′-Dithiobis-2-nitrobenzoic acid(DTNB)反应，在412nm处具有最大吸收值。吸光度值越高，说明蛋白活性越好，从而可以用于检测人颗粒酶A重组蛋白的酶解活性。

发明内容

本发明提出了一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法，包括人活性颗粒酶A重组蛋白的表达、分离纯化及其活性测定。本方法得到的人活性颗粒酶A重组蛋白去除了人颗粒酶A的N末端的28个氨基酸，并在C末端增加了6个组氨酸，以方便利用镍层析柱对重组蛋白进行纯化。本方法依次包括以下步骤：

a)获得人活性颗粒酶A的DNA片段

以含有人颗粒酶A全长基因的质粒pET24a-GzmA为模板，经PCR获得所述人活性颗粒酶A的DNA片段。

b)构建重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA

将所述人活性颗粒酶A基因的DNA片段和原核表达载体pET24a(+)分别用Nde I和XhoI双酶切后回收酶切片段，利用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，得到所述pET24a(+)-aGzmA重组质粒。

对pET24a(+)-aGzmA重组质粒进行鉴定：所述pET24a(+)-aGzmA重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态后提取质粒并用Nde I和Xho I双酶切鉴定，得到目的DNA条带，证明pET24a(+)-aGzmA重组质粒构建成功。

c)获得人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)-aGzmA/BL21

将重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，于冰上放置30min后于42℃水浴热击90s；加入无抗生素培养基培养1h后涂布于kan⁺LB平板，经37℃培养过夜，得到所述人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)-aGzmA/BL21。

d)人活性颗粒酶A重组蛋白的表达和鉴定

将所述人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)-aGzmA/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜后再转接于新的LB培养基中，摇菌至OD600＝0.6～0.8之间；加入IPTG诱导表达6h后于12000rpm离心2min，得到含有所述人活性颗粒酶A重组蛋白的菌体。

用PBS重悬菌体后，取样加入2×SDS凝胶上样缓冲液，于100℃煮沸10min；将离心后的上清作为样品，上样后进行SDS-PAGE分析；菌体蛋白经SDS-PAGE分离后转膜，以小鼠抗His多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗，Western Blot鉴定人活性颗粒酶A的表达。

e)人活性颗粒酶A重组蛋白的纯化

将工程菌pET24a(+)-aGzmA/BL21用IPTG诱导表达后收集菌体用PBS重悬，置于超声波破碎仪中进行超声破碎；离心收集沉淀，用结合缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、5mM咪唑、10％甘油、8M尿素)重悬，再次离心，收集上清，经0.45μm滤膜过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的镍柱进行亲和层析纯化，得到纯化的人活性颗粒酶A重组蛋白。

在进行人活性颗粒酶A重组蛋白的纯化前，还可以先对重组蛋白表达形式的进行确定，即步骤d)得到的含有人活性颗粒酶A重组蛋白的菌体用PBS重悬后，置于超声破碎仪中进行超声破碎。4℃、12000rpm，离心15min后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，检测到人活性颗粒酶A重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。确定重组蛋白表达是包涵体的形式后，将沉淀用结合缓冲液重悬，使包涵体中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次离心，收集获得的上清，0.45μm滤膜过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的镍柱进行亲和层析纯化，得到所述人活性颗粒酶A重组蛋白。

为了进一步确定得到的人活性颗粒酶A重组蛋白具有所需的活性，本方法还包括以下步骤：

f)人活性颗粒酶A重组蛋白的活性鉴定

在96孔板每孔中加入200μl BLT底物溶液，再加入20μ1人活性颗粒酶A重组蛋白，37℃放置20min，用酶标仪测定其在412nm处的吸光度值。

本方法步骤a)的人活性颗粒酶A基因的PCR扩增中，上游引物序列(SEQ ID NO.1)：5’-GGAATTCCATATGATTATTGGAGGAAATGAAG-3′；下游引物序列(SEQ ID NO.2)：5’-CGCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3’。

本方法步骤d)所述的诱导剂IPTG终浓度为1Mm；2×SDS凝胶上样缓冲液的成分包括100mM pH6.8Tris-HCl、20％甘油、4％SDS、200mM2-巯基乙醇、0.2％溴酚兰。

本方法步骤e)所述镍柱亲和层析纯化是：将NiSO₄通过亲和层析凝胶柱以后，Ni²⁺与凝胶亲和吸附；当带His标记的人活性颗粒酶A重组蛋白滤液通过镍柱时，人活性颗粒酶A重组蛋白与Ni²⁺亲和吸附；用结合缓冲液(binding buffer)和洗涤缓冲液(washing buffer)洗去未结合的杂质，然后用含高浓度咪唑的洗脱缓冲液(elute buffer)使亲和力减弱，将人活性颗粒酶A重组蛋白洗脱下来；洗脱下来的缓冲液中含有高浓度尿素和咪唑，将其加入到处理好的透析袋中，然后将透析袋浸透在不含尿素和咪唑的缓冲液中，尿素和咪唑析出，透析袋中的蛋白即为高纯度的人活性颗粒酶A重组蛋白。

本方法中，所述结合缓冲液的成分包括0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、5mM咪唑、10％甘油、8M尿素；所述洗涤缓冲液的成分包括0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、60mM咪唑、10％甘油、8M尿素；所述洗脱缓冲液的成分包括0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、500mM咪唑、10％甘油、8M尿素。

本方法中，不含尿素和咪唑的缓冲液成分为0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、10％甘油。

本方法中，步骤f)的BLT底物溶液的成分包括500μl20mM BLT贮存液、500μl20mMDTNB贮存液、500μl1％Triton X-100和48.5ml PBS。

本发明利用PCR扩增得到人活性颗粒酶A基因，将其插入到与原核表达载体pET24a(+)相应酶切位点中，构建重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA，经转化大肠杆菌BL21后获得工程菌pET24a(+)-aGzmA/BL21。该工程菌经IPTG诱导后可表达人活性颗粒酶A重组蛋白，重组蛋白以包涵体的形式表达。利用镍亲和层析柱可以分离得到纯度高达95％以上的重组蛋白，且该重组蛋白经BLT底物溶液进行活性测定显示出较好的酶解活性。该方法具有成本低、操作简单、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白具有生物学活性和易于纯化。

附图说明

图1为本发明方法中重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA构建流程图。

图2为人活性颗粒酶A基因的PCR扩增图谱。第一泳道为DL2000分子量标准(自上向下依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，第二泳道为PCR产物。

图3为重组质粒pET24a(+)-aGzmA酶切鉴定图谱。第一泳道为为DL2000分子量标准(自上向下依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，第二泳道为未酶切的质粒pET24a(+)-aGzmA，第三泳道为Nde I和Xho I双酶切后的pET24a(+)-aGzmA。

图4为人活性颗粒酶A重组蛋白表达的SDS-PAGE鉴定结果。第一泳道为蛋白分子量标准(自上向下依次为：94.0KDa，66.2KDa，33.0KDa，26.0KDa，20.2KDa，14.0KDa)，第二泳道为pET24a(+)-aGzmA/BL21未经IPTG诱导的电泳结果，第三泳道为pET24a(+)-aGzmA/BL21经IPTG诱导的电泳结果，第四泳道为pET24a(+)/BL21经IPTG诱导的电泳结果；第五泳道为空白菌大肠杆菌BL21经IPGT诱导的电泳结果。

图5为人活性颗粒酶A重组蛋白表达的westernblot鉴定结果。第一泳道为蛋白分子量标准(自上向下依次为：70.0KDa，50.0KDa，45.0KDa，35.0KDa，25.0KDa)，第二泳道为pET24a(+)-aGzmA/BL21未经IPTG诱导的电泳结果，第三泳道为pET24a(+)-aGzmA/BL21经IPTG诱导的电泳结果，第四泳道为pET24a(+)/BL21经IPTG诱导的电泳结果；第五泳道为空白菌大肠杆菌BL21经IPGT诱导的电泳结果。

图6为人活性颗粒酶A重组蛋白表达形式的检测结果。第一泳道为蛋白分子量标准(自上向下依次为：94.0KDa，66.2KDa，33.0KDa，26.0KDa，20.2KDa，14.0Kba)，第二泳道为pET24a(+)-aGzmA/BL21未经IPTG诱导的电泳结果，第三泳道为pET24a(+)-aGzmA/BL21经IPTG诱导的电泳结果，第四泳道为诱导的pET24a(+)-aGzmA/BL21超声破碎后上清的电泳结果；第五泳道为诱导的pET24a(+)-aGzmA/BL21超声破碎后沉淀的电泳结果。

图7为纯化的人活性颗粒酶A蛋白的SDS-PAGE检测结果。第一泳道为蛋白分子量标准(自上向下依次为：66.2KDa，33.0KDa，26.0KDa，20.2KDa)，第二泳道为pET24a(+)-aGzmA/BL21未经IPTG诱导的电泳结果，第三泳道为pET24a(+)-aGzmA/BL21经IPTG诱导的电泳结果，第四泳道为纯化蛋白的电泳结果。

图8为人活性颗粒酶A重组蛋白活性鉴定结果。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

(1)人活性颗粒酶A的DNA片段的获得；

步骤(1)包括以下步骤：以含人颗粒酶A全长基因的质粒pET24a-GzmA为模板，利用PCR扩增人活性颗粒酶A基因片段，上游引物序列(SEQ ID NO.1)为：5’-GGAATTCCATATGATTATTGGAGGAAATGAAG-3′(下划线部分为Nde I酶切位点，85-103)；下游引物序列(SEQ ID NO.2)为：5’-CGCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3’(下划线部分为Xho I酶切位点,769-786)。扩增片段大小为723bp，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析并回收。

(2)重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA的构建与鉴定；

步骤(2)包括以下步骤：将人活性颗粒酶A的PCR扩增片段和原核表达载体pET24a(+)分别用Nde I和Xho I双酶切后回收酶切片段，利用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态后涂Kan⁺LB平板培养。待菌落长出后，挑取单个菌落扩大培养后提取质粒，Nde I和Xho I双酶切鉴定。挑选阳性重组子进行测序，测序正确的质粒命名为pET24a(+)-aGzmA。

(3)人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)-aGzmA/BL21的获得；

步骤(3)包括如下步骤：将制备的重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，于冰上放置30min后于42℃水浴热击90s；按1∶3加入无抗生素培养基培养1h后涂布于kan⁺LB平板，37℃培养过夜，挑单个菌落培养后即为人活性颗粒酶A表达菌，命名为pET24a(+)-aGzmA/BL21。

(4)人活性颗粒酶A重组蛋白的表达和鉴定；

步骤(4)中的表达是指：将人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)-aGzmA/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜后再转接于新的LB培养基中，摇菌至OD600＝0.6～0.8之间；加入IPTG诱导表达6h后于12000rpm离心2min，收集的菌体即为表达菌。

步骤(4)中的鉴定是指：用PBS重悬表达菌体后，取样加入2×SDS凝胶上样缓冲液，于100℃煮沸10min；将离心后的上清作为样品，上样后进行SDS-PAGE分析；菌体蛋白经SDS-PAGE分离后转膜，以小鼠抗His多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗，Western Blot鉴定人活性颗粒酶A的表达。

(5)人活性颗粒酶A重组蛋白的纯化；

步骤(5)中的包括以下步骤：将工程菌pET24a(+)-aGzmA/BL21用IPTG诱导表达后收集菌体并用PBS重悬，然后置于超声波破碎仪中进行超声破碎；4℃、12000rpm，离心15min后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，检测到人活性颗粒酶A重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中；将沉淀用结合缓冲液0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、5mM咪唑、10％甘油、8M尿素)重悬，使包涵体中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次离心，收集获得的上清，0.45μm滤膜过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的镍层析柱后，用结合缓冲液和洗涤缓冲液(0.5MNaCl、20mM Tis-HCl、60mM咪唑、10％甘油、8M尿素)洗去未结合的杂质，最后用洗脱缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、500mM咪唑、10％甘油、8M尿素)将人活性颗粒酶A重组蛋白洗脱下来。洗脱下来的溶液放入到透析袋中进行透析，尿素和咪唑析出，透析袋中的蛋白即为高纯度的人活性颗粒酶A重组蛋白。

(6)人活性颗粒酶A重组蛋白的活性鉴定。

骤(6)中的活性鉴定是指：先将500μl20mM BLT贮存液、500μl20mM DTNB贮存液、500μl1％Triton X-100和48.5ml PBS混合配制BLT底物溶液。取200μl BLT底物溶液加入到96孔板中，再加入20μl人活性颗粒酶A重组蛋白，37℃放置20min，用酶标仪测定其在412nm处的吸光度值。

实施例1

本实施例是本发明方法中重组质粒pET24a(+)-aGzmA的构建及鉴定，其流程如图1所示，具体过程如下：

1.人活性颗粒酶A的DNA片段的获得

根据GenBank中人颗粒酶A全长序列(CR456968.1)设计人活性颗粒酶A上下游引物，并引入相应的限制性核酸内切酶酶切位点，上游引物序列(SEQ ID NO.1)为：5’-GGAATTCCATATGATTATTGGAGGAAATGAAG-3′(下划线部分为Nde I酶切位点，85-103)下游引物序列(SEQ ID NO.2)为：5'-CGCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3’(下划线部分为Xho I酶切位点,769-786)。以含人颗粒酶A全长基因序列的质粒pET24a-GzmA为模板，利用人活性颗粒酶A的特异性引物SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2进行PCR扩增。扩增片段大小为723bp(包括人活性颗粒酶A基因序列702bp和部分上下游引物序列2ibp)，其中人活性颗粒酶A基因序列详细如SEQ ID NO.3所示。PCR反应条件为94℃2min；94℃45s，58℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃再延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析并回收。

人活性颗粒酶A基因PCR扩增的电泳分析结果，如图2所示。含人颗粒酶A全长基因的质粒pET24a-GzmA的构建方法见文献(生物制品学杂志.2012，25(2)：68-70.)。简言之，根据GenBank公布的人颗粒酶A基因序列(CR456968.1)设计并合成引物，抽提NK92细胞株总RNA，利用RT-PCR扩增得到人颗粒酶A全长基因。将人颗粒酶A全长基因的PCR产物用EcoR I和Xho I双酶切后插入到原核表达载体pET24a(+)相应酶切位点中，构建含人颗粒酶A全长基因的重组质粒，该重组质粒经双酶切鉴定并进行测序验证，测序正确的质粒命名为pET24a-GzmA。

2.重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA的构建与鉴定

(1)将人活性颗粒酶A的PCR扩增产物经胶回收后用Nde I和Xho I于37℃双酶切3-8小时，回收酶切产物，与经同样酶切处理的载体质粒pET24a(+)在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，得到的连接产物是pET24a(+)-aGzmA重组质粒。

(2)将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态菌后，涂Kan⁺LB平板进行培养。待菌落长出后，挑取单个菌落，扩大培养后提取质粒，Nde I和Xho I双酶切鉴定。其酶切鉴定图谱如图3所示，在712bp(包括人活性颗粒酶A基因序列702bp和酶切位点序列10bp)处有一特异性DNA条带(第三泳道)，表明质粒构建正确。将该重组质粒送生物公司进行序列测定，结果显示该基因序列与GenBank公布的序列一致。测序正确的质粒命名为pET24a(+)-aGzmA。

实施例2

本实施例为将实施例1中的重组质粒pET24a(+)-aGzmA转化大肠杆菌BL21获得工程菌pET24a(+)-aGzmA/BL21，并进行目的蛋白的诱导表达及表达产物的鉴定，具体过程如下：

1.人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)-aGzmA/BL21的获得

(1)取4μl重组质粒pET24a(+)-aGzmA加入冰预冷的200μl大肠杆菌BL21感受态中，冰上放置30min，42℃水浴热激90s，然后迅速置冰上冷却3min。加入600μl不含抗生素的LB培养基，混匀后置于37℃振荡培养60min，取菌液涂布于kan⁺LB平板，正放平皿于37℃培养箱中30min，待其完全吸收后，倒置培养12-16小时直至单个菌落出现。

(2)挑单菌落接种到kan⁺LB培养基中过夜培养，提取质粒并经双酶切鉴定正确的大肠杆菌即为人活性颗粒酶A表达菌，命名为pET24a(+)-aGzmA/BL21。

2.人活性颗粒酶A重组蛋白的表达和鉴定

(1)pET24a(+)-aGzmA/BL21工程菌的诱导表达

从kan⁺LB平板上挑取单菌落接种到3ml LB培养基(含50mg/L卡那霉素)中，37℃220rpm振荡培养过夜。次日按1％转接到新的培养基中后，37℃，220rpm继续振荡培养2～3h至OD600达到0.6-1.0。加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达6h。同时设pET24a(+)-aGzmA/BL21工程菌未诱导对照、空载体转化菌pET24a(+)/BL21诱导对照和空白菌BL21诱导对照。

(2)人活性颗粒酶A重组蛋白的鉴定

吸取1ml菌液，12000rpm离心1min，收集菌体。加入80μl PBS和20μl5×SDS上样缓冲液，混匀，煮沸10min，使蛋白质变性且与上样缓冲液中的SDS、β-巯基乙醇充分结合。12000rpm离心10min，取上清进行电泳。SDS-PAGE电泳结果如图4所示，在26.0-33.0KDa处有一特异性蛋白条带(第三泳道)，与预期的人活性颗粒酶A重组蛋白分子量相符。由于该重组蛋白为含有His标签的融合蛋白，将凝胶转膜后，以小鼠抗His单克隆抗体为一抗，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，利用Western Blot对该重组蛋白进行鉴定，其结果如图5所示，在25.0-35.0KDa处有一特异性显色条带(第三泳道)，表明该重组蛋白能特异性地与抗His单克隆抗体结合。

实施例3

将实施例2中的重组蛋白利用镍亲和层析柱进行分离纯化，并对纯化蛋白进行活性测定，具体过程如下：

1.人活性颗粒酶A重组蛋白的分离纯化

(1)重组蛋白表达形式的确定

表达菌体用PBS重悬后，置于超声破碎仪中进行超声破碎。超声条件为工作3s，间歇3s，400W，超声总时长为1h，每30min添加冰块并稍作等待，使菌液温度下降，防止炭化。破碎后，于4℃12000rpm离心20min，取一定量的上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，其结果如图6所示，人活性颗粒酶A重组蛋白主要存在于沉淀中(第五泳道)，表明重组蛋白主要以包涵体形式存在。

(2)重组蛋白包涵体的制备与处理

将表达菌体超声破碎仪破碎后，离心收集沉淀，用结合缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、5mM咪唑、10％甘油、8M尿素)重悬，使包涵体中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次离心，收集获得的上清，0.45μm滤膜过滤。

(3)重组蛋白的镍柱亲和层析纯化

用5个体积的50mMNiSO₄通过His亲和层析柱以后，Ni²⁺与凝胶通过亲和力结合在一起，再分别用5个体积的双蒸水和5个体积的结合缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、5mM咪唑、10％甘油、8M尿素)洗去未结合的Ni²⁺。

将制备的重组蛋白溶液通过预处理好的镍层析柱后，人活性颗粒酶A重组蛋白通过His与Ni²⁺亲和吸附，然后用10个体积的结合缓冲液和6个体积的洗涤缓冲液(0.5M NaCl、20mMTis-HCl、60mM咪唑、10％甘油、8M尿素)将不能结合的杂质洗掉，最后用3个体积的洗脱缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、500mM咪唑、10％甘油、8M尿素)将人活性颗粒酶A重组蛋白洗脱下来，每管2mL依次收集洗脱液。

洗脱下来的人活性颗粒酶A重组蛋白溶液中含有8M尿素和500mM咪唑，将其放入处理好的透析袋中，透析袋浸透在不含尿素和咪唑的缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、10％甘油)中，尿素和咪唑析出，袋中的蛋白即为高纯度的人活性颗粒酶A重组蛋白。人活性颗粒酶A重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，含人活性颗粒酶A蛋白序列、Xho I酶切位点对应的氨基酸序列和6个组氨酸序列。将纯化蛋白上样进行SDS-PAGE分析，其结果如图7所示，表明利用镍柱亲和层析法可得到纯度高达95％以上的重组蛋白。

2.人活性颗粒酶A重组蛋白的活性鉴定

根据人活性颗粒酶A可以裂解BLT底物溶液的特点，先按500μl20mM BLT贮存液、500μl20mM DTNB贮存液、500μl1％Triton X-100和48.5ml PBS的配方配制BLT底物溶液。取200μl BLT底物溶液加入到96孔板中，再加入20μ1人活性颗粒酶A重组蛋白，37℃放置20min，用酶标仪测定其在412nm处的吸光度值。同时分别以PBS和透析液为空白对照和阴性对照，其结果如图8所示，表明纯化的人活性颗粒酶A重组蛋白具有较高的酶解活性。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims

1.一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)获得人活性颗粒酶A的DNA片段

以含有人颗粒酶A全长基因的质粒pET24a-GzmA为模板，经PCR获得所述人活性颗粒酶A的DNA片段；

b)构建重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA

将所述人活性颗粒酶A基因的DNA片段和原核表达载体pET24a(+)分别用Nde I和Xho I双酶切后回收酶切片段，利用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，得到所述pET24a(+)-aGzmA重组质粒；

c)获得人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)-aGzmA/BL21

将重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，于冰上放置30min后于42℃水浴热击90s；加入无抗生素培养基培养1h后涂布于kan⁺LB平板，经37℃培养过夜，得到所述人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)-aGzmA/BL21；

d)人活性颗粒酶A重组蛋白的表达和鉴定

将所述人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)-aGzmA/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜后再转接于新的LB培养基中，摇菌至OD600＝0.6～0.8之间；加入IPTG诱导表达6h后于12000rpm离心2min，得到含有所述人活性颗粒酶A重组蛋白的菌体；

e)人活性颗粒酶A重组蛋白的纯化

将所述菌体用PBS重悬，置于超声波破碎仪中进行超声破碎；离心收集沉淀，经重悬、离心，过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的镍柱进行亲和层析纯化，得到纯化的人活性颗粒酶A重组蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)的人活性颗粒酶A基因的PCR扩增中，上游引物序列(SEQ ID NO.1)：5’-GGAATTCCATATGATTATTGGAGGAAATGAAG-3′；下游引物序列(SEQ ID NO.2)：5’-CGCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3’。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d)所述的诱导剂IPTG终浓度为1mM；2×SDS凝胶上样缓冲液的成分包括100mM pH6.8Tris-HCl、20％甘油、4％SDS、200mM2-巯基乙醇、0.2％溴酚兰。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e)中所述镍柱亲和层析纯化是：将NiSO₄通过亲和层析凝胶柱以后，Ni²⁺与凝胶亲和吸附；当带His标记的人活性颗粒酶A重组蛋白滤液通过镍柱时，人活性颗粒酶A重组蛋白与Ni²⁺亲和吸附；用结合缓冲液和洗涤缓冲液洗去未结合的杂质，用含高浓度咪唑的洗脱缓冲液使亲和力减弱，将人活性颗粒酶A重组蛋白洗脱下来；将其加入到透析袋中，浸透在不含尿素和咪唑的缓冲液中，尿素和咪唑析出，得到高纯度的人活性颗粒酶A重组蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述结合缓冲液的成分包括0.5M NaCl、20mMTis-HCl、5mM咪唑、10％甘油、8M尿素；所述洗涤缓冲液的成分包括0.5M NaCl、20mMTis-HCl、60mM咪唑、10％甘油、8M尿素；所述洗脱缓冲液的成分包括0.5M NaCl、20mMTis-HCl、500mM咪唑、10％甘油、8M尿素。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述不含尿素和咪唑的缓冲液的成分为0.5MNaCl、20mM Tis-HCl、10％甘油。