CN110004132A - 一种包涵体蛋白的纯化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供一种包涵体蛋白的纯化方法及其应用。纯化方法主要是全程使用一种经实验确定的溶解包涵体的缓冲液（10mM Tris‑HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，10mM咪唑，5mMβ‑巯基乙醇）及相关洗杂液、洗脱液，纯化完成后通过透析的方法将尿素、咪唑最终去除，对获得的纯蛋白进行体外酶活性测定、体内接种致病性测定等，显示所获纯蛋白Pl101具较高酶活性及致病性。本发明方法快速、简便、有效地获得具生物学活性的目标蛋白，降低了纯化成本。

Description

一种包涵体蛋白的纯化方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供一种包涵体蛋白的纯化方法及其应用。具体地说，本发明涉及一种源于辣椒疫霉菌的果胶裂解酶Pl101原核表达形成的包涵体蛋白质快速、简便纯化方法，且所获纯蛋白Pl101具较高酶活性及致病性。

背景技术

外源基因在原核细胞中表达时，尤其是在大肠杆菌中高效表达时，易形成由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，即包涵体。包涵体的形成是比较复杂的，主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等。功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型，而包涵体内的蛋白是非结晶、无定形的非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。

包涵体的形成对重组蛋白的纯化及酶活测定等下游生化实验的进行带来了很大的障碍，常规实验方法是将包涵体彻底溶解，通过6-8M盐酸胍或8-10M尿素等变性剂变复性的手段获得可溶性蛋白，而上述方法一个不容忽视的问题是蛋白质的收率较低或易造成蛋白的失活等，且纯化成本较高。一种快速、简便且有效纯化包涵体蛋白的方法对开展蛋白质组学、酶学、遗传学等相关实验可提供有力的技术支持。

果胶裂解酶（Pectate lyase，Pl）为辣椒疫霉菌（Photophthora capsici）等植物病原菌的重要细胞壁降解酶，属植物病原菌的关键致病因子，通过降解寄主细胞壁来增强病原菌对寄主的亲和力，从而引起致病。Pl能够降解植物细胞壁中的果胶，对病原菌侵染寄主植物具重要作用。研究发现，Pl对甲酯化的果胶分子亲和力较高，通过β-消除的方式裂解甲酯基的α-1，4糖苷键，生成在非还原末端的C4和C5位置有不饱和双键的半乳糖醛酸。对果胶裂解酶Pl的功能研究已成为分子植物病理学的热点科学问题。

不同植物病原菌的Pl特性（分子量、最适pH值、最适温度、底物特异性、动力学参数、所需金属离子及浓度等）存在显著差异，而源于同一病原菌的Pl基因成员调控病菌与寄主互作特性及致病性也存在明显分化。原因在于Pl基因家族及个体成员较多，且家族间氨基酸序列同源性相似度较低（<30%），由此导致不同Pl功能特性差异较大。

对Pl开展相关功能特性及致病机制研究的一个前提是获得目标基因及其纯蛋白，本发明即是在前期研究基础上，对克隆自辣椒疫霉菌的一个Pl基因Pl101进行了原核表达，并对表达出的包涵体蛋白进行了纯化步骤的探索，确定了一种快速、简便、有效地获得目标蛋白Pl101的方法，并对纯蛋白Pl101进行了酶活性及致病性测定等，证明通过本方法获得的纯蛋白具较高酶活性及致病性，为相关蛋白开展酶学、遗传学、蛋白质组学等研究提供了技术支持与借鉴。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种包涵体蛋白的纯化方法及其应用，以解决相关技术问题。该方法可快速、简便、有效地纯化包涵体蛋白且通过该方法所获纯蛋白具较高酶活性及致病性，解决了包涵体蛋白难纯化或纯化得率低、纯化后蛋白无活性或活性低的技术问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种包涵体蛋白Pl101的纯化方法及其应用，包涵体蛋白Pl101的纯化方法包括有下列步骤：

A：将靶基因Pl101构建原核表达体系（表达载体pET-28a），转化大肠杆菌（表达菌株E.coli BL21 (DE3) pLysS）诱导表达出融合蛋白Pl101，确定的包涵体蛋白诱导表达条件为：诱导温度16℃，诱导剂IPTG终浓度为1mM/L，诱导时间16h；

B：实验表明表达出的融合蛋白Pl101在常规缓冲液（10mM Tris-HCl pH7.0，150mMNaCl）中不可溶，即上述方法表达出的融合蛋白Pl101为包涵体，经实验确定可将包涵体溶解的缓冲液A为10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，10mM咪唑，5mM β-巯基乙醇；

C：对在缓冲液A中溶解的融合蛋白Pl101进行亲和层析纯化，亲和层析介质为Ni-NTA琼脂糖凝胶，并对洗杂液、洗脱液进行不同条件的优化，经实验确定的三种洗杂液分别为缓冲液B（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巯基乙醇）、C（10mMTris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巯基乙醇，0.5%(v/v)吐温-20）、D（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巯基乙醇，0.5%(v/v)乙醇），洗脱液为缓冲液E（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，100mM咪唑，5mM β-巯基乙醇），即缓冲液A组份纯化全程使用以防蛋白沉淀，经透析袋4℃低温透析的方法将最终缓冲液替换为10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，将尿素、咪唑完全去除，获得纯蛋白Pl101，纯蛋白经Western blotting杂交验证。

所述纯蛋白Pl101采用底物聚半乳糖醛酸反应法测定的酶活性为750U/mg。

所述纯蛋白Pl101采用寄主植物辣椒健康叶片接种法测定其具有较高致病活性。

所述包涵体蛋白Pl101纯化（菌液破碎、亲和层析挂柱、洗杂、洗脱、透析等）时间以控制在12h以内为宜，以防时间过长蛋白沉淀或变性。

所述纯蛋白Pl101体外酶活性测定及体内致病性测定等实验以纯化所得纯蛋白立即使用为宜，不建议使用冷冻蛋白或长时间放置后蛋白，以免影响蛋白活性或致病性。

所述缓冲液等所用试剂纯度等级为分析纯即可，不影响蛋白纯化流程及下游活性实验等。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：（1）与常规包涵体蛋白纯化需用6M盐酸胍或8尿素等变性剂变复性的手段获得目标蛋白，本发明首次在较高pH值（pH10.3）、较低尿素浓度（2M尿素）下即可实现包涵体蛋白的溶解，避免了高浓度变性剂对蛋白结构的破坏及耗时较长的复性过程；（2）本发明蛋白纯化全程所用试剂为常规试剂，价格低且易获取，全程所用时间较短，较常规包涵体纯化更快速、简便；（3）经本发明方法纯化所得纯蛋白具较高蛋白酶活性及致病性，解决了包涵体蛋白难纯化或纯化得率低、纯化后蛋白无活性或活性低等常见技术问题，值得推广与应用。

附图说明

图1. Pl101基因重组表达载体示意图

图中Kan为卡那抗性，MCS为多克隆位点，BamHⅠ和EcoRⅠ为双酶切位点，Pl101为目的基因。

图2.原核表达融合蛋白Pl101可溶性分析示意图

图中M：标准蛋白Marker；1和2分别为融合蛋白Pl101在pH7.0和pH9.0缓冲液（10mMTris-HCl，150mM NaCl）中不可溶；3：融合蛋白Pl101在缓冲液A（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，10mM咪唑，5mM β-巯基乙醇）中溶解性较好。

图3.包涵体纯化后所得纯蛋白Pl101与验证

图中(A) M：标准蛋白Marker；1：纯蛋白Pl101；(B) Western blotting杂交验证纯蛋白Pl101。

图4.纯蛋白Pl101接种活体寄主辣椒症状

图中(A)辣椒疫霉菌孢子悬浮液接种状（阳性对照）；(B)纯蛋白Pl101；(C)高温灭活的纯蛋白Pl101（阴性对照）；(D)灭菌水（阴性对照）。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细说明。

本发明所提供的实施例，除特殊说明外，均按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989），或Draper，J 等（Blackwell 科学出版社，1988）所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。具体如下：

Pl101基因表达

Pl101基因为本研究室从辣椒疫霉菌菌株SD33上克隆获得。提取表达载体pET28a(+)质粒备用；经PCR扩增后的Pl101基因通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收后待用。

将基因和载体质粒进行双酶切，酶切体系为：

Pl101基因 10-20mg 28a质粒 10-20mg

10×Buffer 10μL 10×Buffer 10μL

BamHI 4μL BamHI 4μL

EcoRI 4μL EcoRI 4μL

MQ to 100μL MQ to 100μL

Total 100μL Total 100μL

混合后于37℃水浴酶切4h以上，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收，待用。

基因和载体进行连接（图1）转化：

酶切后pET-28a(+) 1-3μL

酶切后Pl101基因 5-7μL

Solution I 1μL

Total 10μL

于16℃水浴连接反应 4h后进行转化。

转化步骤：

取连接产物10μL加入到100μLDH5α感受态细胞中，放入42℃水浴中热激90sec，快速放入冰水中2min；加入800μL不含抗生素LB培养基，37℃水浴1h以上；12000转/分离心2min，吸弃大部分上清培养基，剩余约100μL吹打悬浮沉淀；涂布含有卡那抗生素的LB琼脂平板，倒置平板37℃培养过夜。

重组质粒鉴定：

从每一个培养平板上分别挑出五个菌落，接入5ml的LB培养基中，培养过夜，提取质粒备用。

PCR鉴定：取1μL质粒按前述基因扩增体系和步骤进行PCR，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。

双酶切鉴定：按前述载体双酶切体系和步骤，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。

测序鉴定：将PCR扩增产物和阳性菌落扩大培养后提取的质粒送测序公司测序检测。

目的蛋白试表达：

将阳性重组质粒转化表达宿主BL21(DE3)，涂于卡那（50mg/L）抗性平板。具体表达流程为：

(1)从LB平板上分别挑取5个单克隆菌落，接入含5ml LB（50mg/L Kan）的15ml离心管中，于37℃震荡培养OD值至0.6-0.8之间。

(2)每一个试管各取500μL菌液和15％的甘油1:1(v/v)混合后装至灭菌冻存管中，零下80℃保存。

(3)每一个试管中取500μL菌液，做为诱导前对照。

(4)每一个试管中加入5μL IPTG（终浓度为1mM/L），37℃ 200rpm诱导表达4h。

(5)诱导结束后分别取500μL的菌液，与诱导前菌液12000rpm共离心2min。

(6)弃掉上清，分别加入10μL 5×样品缓冲液，于100℃加热5min变性，上样前12000rpm离心5min。

(7)15％SDS-PAGE 电泳分析表达结果。

蛋白表达条件优化：

在确定蛋白正常重组表达后，继续优化高效表达条件，在温度、诱导剂剂量、时间等进行优化筛选，确定Pl101最佳表达条件为：诱导温度16℃，诱导剂IPTG终浓度为1mM/L，诱导时间16h。

Pl101包涵体蛋白纯化

挑取阳性克隆，接种至含50mg/L卡那霉素的10ml LB培养基中，37℃震荡培养过夜至OD600=0.6-0.8，然后按1：100接种至含50mg/L卡那霉素的1L LB培养基中，37℃震荡培养至OD600=0.6-0.8。按照前述优化的表达条件进行，即冷却至16℃后，添加IPTG至1mM/L，培养16h，然后5000rpm离心6min收集菌体，待用。

实验表明表达出的融合蛋白Pl101在常规缓冲液中不可溶，即上述方法表达出的融合蛋白Pl101为包涵体，经实验确定可将包涵体溶解的缓冲液A为10mM Tris-HClpH10.3，150mM NaCl，2M尿素，10mM咪唑，5mM β-巯基乙醇（图2），具体纯化流程为：

(1)菌液破碎。取重组蛋白Pl101菌液50ml，加入经实验确定的缓冲液A（10mM Tris-HClpH10.3，150mM NaCl, 2M尿素，10mM咪唑，5mM β-巯基乙醇）进行菌液破碎。菌液在超声波破碎仪冰水浴下于300W条件下超声30min（超声3s间歇3s）后，15000rpm离心20min，吸取上清待用，上清液及沉淀分别SDS-PAGE分析，确定目的蛋白以可溶的方式存在于上清液中。

(2)亲和层析挂柱。取3ml Ni-NTA凝胶树脂加至纯化柱中，用缓冲液A冲洗2-5个柱体积，将菌液超声破碎离心后的上清液过纯化柱3次以上，再进行洗杂。

(3)洗杂。先用基本缓冲液A洗杂200ml左右，然后依次用缓冲液B（10mM Tris-HClpH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巯基乙醇）、C（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巯基乙醇、0.5%(v/v)吐温-20）、D（10mM Tris-HClpH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巯基乙醇、0.5%(v/v)乙醇）分别洗杂100ml左右。

(4)洗脱。用缓冲液E（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，100mM咪唑，5mM β-巯基乙醇）洗脱10ml左右，SDS-PAGE分析结果显示蛋白纯度达95%以上，获得纯蛋白Pl101。蛋白浓度用Bradford方法测定，测定蛋白浓度为2.012mg/ml，且纯蛋白经Westernblotting杂交验证（图3）。

Pl101纯蛋白酶活测定

对所获纯蛋白Pl101进行体外酶活性测定，采用的是底物聚半乳糖醛酸反应法，具体步骤为：取纯蛋白Pl101 20ul加入980ul反应体系中（含0.2% (v/v)聚半乳糖醛酸、100mMTris-HCl pH8.5，1mM CaCl2），在40℃下反应10min；加入250ul 50mM HCl终止反应；通过紫外分光光度计检测232nm 波长下吸光值的变化测得的最终酶活为750U/mg。

Pl101纯蛋白致病性测定

对所获纯蛋白Pl101进行体内酶活即致病性测定，采用的是寄主植物辣椒健康叶片接种法，即培养生长健康的辣椒植株，选取健壮叶片采用针刺伤口法分别接种辣椒疫霉菌孢子悬浮液（阳性对照）、纯蛋白Pl101、高温灭活的纯蛋白Pl101（阴性对照）及灭菌水（阴性对照），28℃生化培养箱中培养观察接种叶片发病症状。结果表明经上述步骤纯化获得的纯蛋白Pl101具较高致病活性（图4）。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以显示和描述本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点，所属领域的普通技术人员应当了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种包涵体蛋白Pl101的纯化方法及其应用，其特征在于，包涵体蛋白Pl101的纯化方法包括有下列步骤：

A：将靶基因Pl101构建原核表达体系（表达载体pET-28a），转化大肠杆菌（表达菌株E.coli BL21 (DE3) pLysS）诱导表达出融合蛋白Pl101，确定的包涵体蛋白诱导表达条件为：诱导温度16℃，诱导剂IPTG终浓度为1mM/L，诱导时间16h；

B：实验表明表达出的融合蛋白Pl101在常规缓冲液（10mM Tris-HCl pH7.0，150mMNaCl）中不可溶，即上述方法表达出的融合蛋白Pl101为包涵体，经实验确定可将包涵体溶解的缓冲液A为10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，10mM咪唑，5mM β-巯基乙醇；

C：对在缓冲液A中溶解的融合蛋白Pl101进行亲和层析纯化，亲和层析介质为Ni-NTA琼脂糖凝胶，并对洗杂液、洗脱液进行不同条件的优化，经实验确定的三种洗杂液分别为缓冲液B（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巯基乙醇）、C（10mMTris-HCl pH10.3，150mM NaCl, 2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巯基乙醇、0.5%(v/v)吐温-20）、D（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巯基乙醇、0.5%(v/v)乙醇），洗脱液为缓冲液E（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，100mM咪唑，5mM β-巯基乙醇），即缓冲液A组份纯化全程使用以防蛋白沉淀，经透析袋4℃低温透析的方法将最终缓冲液替换为10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，将尿素、咪唑完全去除，获得纯蛋白Pl101，纯蛋白经Western blotting杂交验证。

2.根据权利要求1所述的一种包涵体蛋白Pl101的纯化方法及其应用，其特征在于：所述纯蛋白Pl101采用底物聚半乳糖醛酸反应法测定的酶活性为750U/mg。

3.根据权利要求1所述的一种包涵体蛋白Pl101的纯化方法及其应用，其特征在于：所述纯蛋白Pl101采用寄主植物辣椒健康叶片接种法测定其具有较高致病活性。