CN110408676A - 一种基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器 - Google Patents

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Abstract

目前，纳米孔技术已经成为核酸测序和分析的热点方法。然而，以高灵敏度和特异性在宽浓度范围内检测并量化超低水平核酸仍然是一个挑战。本工作拟研发了一种超灵敏的基于胰蛋白酶激活气溶素原成孔的纳米孔策略（tNASA——trypsin‑activated nanopore amplified sandwich assay），通过胰蛋白酶激活气溶素原和使用微型电流放大器eONEHS的信号检测来进行待测样品的信号放大。本工作创新性体现在：利用胰蛋白酶激活气溶素原组装纳米孔作为信号发生器做到了对信号的二次放大，能够进行aM核酸和单细胞水平上的检测，不仅能够满足微生物检测领域中高选择性、高灵敏度和低成本的要求，同时也为病毒的诊断提供了新的见解。

Description

一种基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传 感器
技术领域
本发明为满足人们越来越希望能够通过简单、高效的检测方法获得精确检测结果的需求，提供一种基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器。
背景技术
病原微生物是那些能够引起动物或者人类疾病的微生物，它们可以通过食物和空气等途径快速传播，包括细菌、病毒、真菌等种类，时刻威胁着人们的身体健康。传统微生物检测和鉴定主要通过分离、培养病原微生物和观察形态学以及进行血清免疫学反应等途径，耗时比较长而且对仪器设备等的硬件要求比较高，并且无法在资源有限的环境顺利实施。随着现代社会经济的飞速发展，人们越来越希望能够通过简单的检测方法获得精确的病原微生物检测结果，因此如何提高微生物诊断的检测时间以及诊断结果的可靠性就变成了微生物检测相关科研人员着重考虑的问题。
纳米孔技术由于能够在施加电压的情况下驱动单链DNA/RNA通过磷脂双分子层上的纳米级生物孔并测量核酸分子通过纳米孔时电解质的离子电流变化，从而获得越来越多研究学者的青睐。该方法无需信号标记或者分子扩增，就能够在单分子水平上进行核酸分析。但是，当待检测核酸的序列极其相似或者长度很短的情况下，该检测方法则难以对其进行很好的区分。目前针对此难题的解决方案主要是使用设计好的寡核苷酸探针与待检测的靶标互补配对从而形成多水平的阻滞信号。但是该方法在检测低浓度分析物时，需要采集较多的信息并进行比较复杂的计算，具有不适合进行超灵敏检测分析的缺点。因此为了解决当前技术的缺陷，有必要开发一种快速且高效基于纳米孔的诊断测试。
气溶素(areolysin) 是由嗜水气单胞菌分泌的，可以在磷脂双分子层上形成性能良好的七聚体桶装纳米通道，在基于纳米孔道的单分子检测分析方法中应用比较广泛。但是嗜水气单胞菌最初合成的为无成孔活性的气溶素原，需要在胰蛋白酶、弗林蛋白酶等酶的催化下激活成为气溶素之后才能成孔形成电流。气溶素原的这一激活机制可以作为检测方法构建中增强响应信号的一种优良途径。
另外，纳米材料由于比表面积比较大，可固定在其表面上的生物分子的量较多，从而使结合位点数量最大化，提供了巨大的信号增强。因此，基于纳米材料信号标记的生物传感器具有较高的灵敏度和良好的应用前景。
本专利综合纳米生物传感器、胰蛋白酶激活放大系统和pA电流计三者构建了一种基于纳米孔的超灵敏微生物诊断传感器。该技术首先用捕获探针捕获靶核酸，并进一步与连接有GBP-胰蛋白酶标记的检测探针杂交形成“三明治结构”，然后利用“三明治结构”激活气溶素原，从而在pA电流计的脂质层上形成靶核酸浓度依赖性的电流。
发明内容
本发明旨在改善目前微生物诊断领域中缺乏高灵敏度和精确性检测方法的现状，提供一种超灵敏的基于胰蛋白酶激活气溶素原成孔的纳米孔策略。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器，将金结合多肽标签胰蛋白酶激活信号放大系统和膜片钳放大器pA电流计结合而构建的一种高灵敏高选择性的新型快速微生物检测传感器。
具体，所述的胰蛋白酶是带有金结合多肽标签（GBP）的重组胰蛋白酶。
上述GBP-胰蛋白酶首先由真核表达质粒pGAPZα A-trypsinogen在酵母细胞系GS115中组成表达出GBP-胰蛋白酶原；酵母培养基经过蛋白纯化获得GBP-胰蛋白酶原，经肠激酶充分激活后成为有活性的GBP-胰蛋白酶。
上述GBP-胰蛋白酶还可以是GBP-胃蛋白酶、GBP-噬热菌蛋白酶、GBP-弗林蛋白酶。
上述GBP-胰蛋白酶包括猪来源的胰蛋白酶、牛来源的胰蛋白酶、羊来源的胰蛋白酶、人来源的胰蛋白酶。
一种基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器的应用，所述的微生物检测传感器在微生物检测领域的应用。
将所述的微生物检测传感器对副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌10种微生物进行检测。
本发明所具有的优点：
本发明中的传感器易于组装，并且电流读数与目标检测浓度直接相关，无需额外的数据解释和统计分析，大大降低了对硬件和软件的需求。
本发明利用胰蛋白酶激活气溶素原组装纳米孔作为信号发生器做到了对信号的二次放大，能够进行aM核酸和单细胞水平上的检测，不仅能够满足微生物检测领域中高选择性、高灵敏度和低成本的要求，同时也为病毒的诊断提供了新的见解。
附图说明：
图1 基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器的检测流程示意图。
图2胰蛋白酶原的纯化与激活的western blot图谱。其中，1泳道是胰蛋白原，2泳道是气溶素，3泳道是肠激酶激活之后的胰蛋白酶。
图3 基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器检测不同浓度的人工合成的金黄色葡萄球菌靶点DNA。
图4 基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器检测不同浓度的金黄色葡萄球菌微生物。
图5 基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器检测10种不同的微生物。
具体实施方式：
实施例1 胰蛋白酶原的表达纯化与激活
质粒准备：
pGAPZα A-trypsinogen质粒转化大肠杆菌克隆感受态细胞DH5α，然后涂布在含有25 µg/mL博来霉素抗性的LSLB平板上，经过测序方法筛选阳性克隆。然后摇阳性克隆提取质粒，用BspHI进行单酶切，酶切体系如下：
限制性内切酶 10 µL
质粒DNA 10 µg
10X Buffer 0 20 µL (1X)
无酶水 补齐至200 µL
37 ℃酶切4 h。
感受态制备：
巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris——GS115 （购买于CICC）30 ℃ 300 rpm摇菌过夜至OD600 = 1.3-1.5，离心收集菌体并用预冷的无菌水清洗2次，然后用预冷的无菌的1 M山梨醇清洗1次，最后重悬于适量预冷的无菌的1 M山梨醇中。
电转：
线性化的质粒使用伯乐电转仪Gene Pulser Xcell进行电转（200 Ω, 25 µF, 1500V），涂布在含有100 µg/mL博来霉素的YPDS平板上，筛选博来霉素抗性的克隆进行PCR检测，引物对为pGAP-F/3’ AOX1-R。 PCR程序以及体系如下：
重组蛋白表达以及纯化：
将阳性克隆转接至YPD液体培养基中进行扩培，30 ℃ 300 rpm摇菌36 h，8000 rpm 10min离心收集培养基，将培养基按照1：7的比例与平衡液（50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 500 mMNaCl, 10 mM 咪唑）混合，并用0.22 µm的滤膜过滤。用至少5个柱体积的平衡液平衡Bio-Scale™ Mini Nuvia™ IMAC Ni-Charged Cartridges柱，流速5 mL/min直至洗出稳定的基线；样品上样至平衡了的镍柱，流速2 mL/min；至少10个柱体积的洗杂液（50 mM NaH2PO4,pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM 咪唑）对柱子进行清洗，流速5 mL/min；洗脱液（50 mMNaH2PO4, pH 8.0, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑）线性洗脱镍柱，流速2 mL/min，并对样品进行收集；western检测。对检测为阳性的样品进行透析，透析液为150 mM NaCl，20 mM HEPES(pH 7.4)，然后冻存-80 ℃。SDS-PAGE和western检测蛋白纯化效果。Qubit® ProteinAssay Kits检测蛋白浓度。
重组胰蛋白酶原的激活：
Qubit® Protein Assay Kits检测蛋白浓度，然后按照1 U肠激酶：50 µg胰蛋白酶原的比例将肠激酶与胰蛋白酶原混合，25 ℃酶切过夜。肠激酶购买于上海源叶。
实施例2 基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器检测不同浓度的人工合成的金黄色葡萄球菌靶点和微生物浓度
人工合成靶点灵敏度的检测：
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以人工合成的金黄色葡萄球菌靶点DNA（106 aM）为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以人工合成的金黄色葡萄球菌靶点DNA（105 aM）为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以人工合成的金黄色葡萄球菌靶点DNA（104 aM）为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以人工合成的金黄色葡萄球菌靶点DNA（103 aM）为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以人工合成的金黄色葡萄球菌靶点DNA（102 aM）为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以人工合成的金黄色葡萄球菌靶点DNA（101 aM）为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以人工合成的金黄色葡萄球菌靶点DNA（100 aM）为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
微生物浓度灵敏度的检测：
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以金黄色葡萄球菌（106 cfu·ml-1）cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mMPB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0 nM)反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以金黄色葡萄球菌（105 cfu·ml-1）cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以金黄色葡萄球菌（104 cfu·ml-1）cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以金黄色葡萄球菌（103 cfu·ml-1）cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以金黄色葡萄球菌（102 cfu·ml-1）cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以金黄色葡萄球菌（101 cfu·ml-1）cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）与10 µL以金黄色葡萄球菌（100 cfu·ml-1）cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
实施例3 基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器检测10种不同细菌微生物
20 µL副溶血弧菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）分别与10 µL以副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL副溶血弧菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。分别取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL单增李斯特菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）分别与10 µL以副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL单增李斯特菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。分别取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL奇异变形菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）分别与10 µL以副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL奇异变形菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。分别取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL粪肠球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）分别与10 µL以副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL粪肠球菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。分别取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL肺炎克雷伯氏菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）分别与10 µL以副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL肺炎克雷伯氏菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。分别取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL酿脓链球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）分别与10 µL以副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL酿脓链球菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。分别取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL金黄色葡萄球菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）分别与10 µL以副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL金黄色葡萄球菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。分别取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL铜绿假单胞菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）分别与10 µL以副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL铜绿假单胞菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。分别取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL大肠埃希氏菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）分别与10 µL以副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30 min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL大肠埃希氏菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。分别取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。
20 µL伤寒沙门菌捕获探针链霉亲和素功能化磁珠（2 mg/mL）分别与10 µL以副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌cDNA为模板进行不对称PCR的产物反应30min。用PB缓冲液（10 mM PB pH 7.4）清洗10次该反应体系，加入20 µL伤寒沙门菌功能化金纳米探针(2.0 nM) 反应30 min，用缓冲液清洗6次该反应体系。分别取12 μL成功构建的“三明治”模型与20 μL气溶素原（5.5 μM）混合，室温反应1 h之后12000 rpm 10 min离心收集上清，加入到纳米孔测试系统（eONE, Elements SRL, Italy）中进行测试，采集相关的电流信号。

Claims (7)

1.一种基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器，其特征在于：将金结合多肽标签胰蛋白酶激活信号放大系统和膜片钳放大器pA电流计结合而构建的一种高灵敏高选择性的新型快速微生物检测传感器。
2.如权利要求1所述的基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器，其特征在于：所述胰蛋白酶是带有金结合多肽标签（GBP）的重组胰蛋白酶。
3.如权利要求1所述的基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器，其特征在于：所述GBP-胰蛋白酶首先由真核表达质粒pGAPZα A-trypsinogen在酵母细胞系GS115中组成表达出GBP-胰蛋白酶原；酵母培养基经过蛋白纯化获得GBP-胰蛋白酶原，经肠激酶充分激活后成为有活性的GBP-胰蛋白酶。
4.如权利要求1所述的基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器，其特征在于：所述GBP-胰蛋白酶还可以是GBP-胃蛋白酶、GBP-噬热菌蛋白酶、GBP-弗林蛋白酶。
5.如权利要求1所述的基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器，其特征在于：所述GBP-胰蛋白酶包括猪来源的胰蛋白酶、牛来源的胰蛋白酶、羊来源的胰蛋白酶、人来源的胰蛋白酶。
6.一种权利要求1所述的基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器的应用，其特征在于：所述微生物检测传感器在微生物检测领域的应用。
7.按权利要求6所述的基于金结合多肽标签功能化胰蛋白酶的微生物诊断传感器的应用，其特征在于：所述微生物检测传感器对副溶血弧菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门菌10种微生物的检测。
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