CN107389932A - 用于从含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法 - Google Patents

Abstract

一种用于从含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法，包括：(a)通过至少部分地使包含在样品中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白，将所述目标分子或颗粒捕获在纤维蛋白网(fibrin network)中；(b)回缩所述纤维蛋白网，以形成纤维蛋白凝块；(c)从周围的样品介质中分离所述纤维蛋白凝块。

Description

用于从含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法

本申请是申请日为2011年9月15日，申请号为201180044211.X，发明名称为“用于从包括成分血的含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法”的申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及用于样品处理的用于从所述样品中分离目标分子或颗粒的方法。更具体地，本发明涉及在其检测和分析之前，允许从包含纤维蛋白原蛋白的样品中有效分离且浓缩目标分子或颗粒的样品制备程序。

相关技术的描述

在生物测定中，从各种样品中提取、浓缩及纯化目标分子、颗粒或分析物(即，样品制备)的能力代表关键步骤且作为用于有效的目标检测和分析的首要步骤是具有挑战性的。在生物测定中，在检测限、再现性及所述颗粒或分析物受到其它化合物的干扰的方面，样品制备步骤是主要的限速步骤。现有的样品制备程序通常涉及冗长的手工或复杂的机器人移液步骤，包括长时间的离心循环。这样的程序不仅是缓慢的、成本高的且消耗劳动的，而且它们还代表了对需要进行危险化学品的昂贵处理的试验人员的健康风险。而且，用于样品制备尤其是用于新一代分子目标的工作流程甚至变得更加复杂，且被供给多种溶液。目前，用于样品制备的各种不同的溶液被用于每一种样品类型和目标。提供可适用于易于实施的多种样品和目标、可与自动化和试剂集成相容且涉及最少的动手时间(minimalhands-on time)的标准样品制备工作流程的解决方案仍然是生命科学和诊断环境中未解决的需求。而且，样品工作流程方法学的标准化是主要在规定的诊断环境中的主要需求。

样品制备的复杂性的典型说明是从复杂的血液介质中检测出目标分子或颗粒。尤其，复杂性是在低检测水平下从血液中检测出感染剂(细菌、真菌)。在临床水平下，血液感染(即败血症)的检测是尤为重要的，因为它是由对血液中的微生物感染的炎症响应所诱发的严重的医疗状况的起因。败血症确实代表重症监护病房中的死亡的最常见起因。而且，由于对来自血液的微生物的差的检测、错过或延迟的感染剂的识别和/或缺乏或延迟的抗生素敏感试验，很多抗生素治疗形式仅以经验为主地开始，而没有适当的诊断适用范围。用于早期检测、快速微生物识别和抗生素敏感试验及充分的患者管理的败血症诊断的医学需求是高度未满足的。在微生物(例如，医院微生物)的耐药性发展增加的时候，用于快速且准确的败血症诊断的新方法学对于降低发病率和死亡率是重要的。最后，败血症感染的另一个来源是血液灌注。从血液、成分血(blood component)及血液衍生物中有效地检测出微生物对于防止污染是极其重要的。

作为血液瓶子培养或血液琼脂培养的血液培养的使用仍然是检测且识别患有菌血病和败血症的患者中的感染剂的常规选择方法(黄金标准)。

检测血液中的细菌细胞的主要问题是检测低至1个菌落形成单位(CFU)每毫升的细胞数目的能力。因此，在这个背景下，必须在这个数量级的检测水平下加工的血液体积必须由几毫升(5-10ml)的血液标本组成。“在干草堆中寻针”，血液感染诊断中的巨大挑战将基于允许从活的微生物或它们的核酸基因内容中提取和纯化特异性感染生物标志物的有效且易于实施的技术的可用性。

例如在国际专利申请WO95/15397和WO2009/015484中所报道的，多次离心或过滤方法学联合特异性细胞壁/膜溶解步骤一起使用，用于从血液样品和体液中富集目标微生物。除了低的富集效率，这样的离心方法学的另一个限制是它们与常规的自动化实验室测定工作流程不相容。为了克服离心的处理限制，引入涂覆有针对目标微生物的亲和基团(affinity group)的磁性颗粒。使用磁力，颗粒将目标捕获在它们的表面上，导致目标易于从血液中分离出来。然而，对于磁珠上的亲和基团的广泛应用以捕获活细菌，存在一些主要的劣势。首先，致病微生物的范围由革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌及许多真菌物种的长列表构成；不存在覆盖所有种类的微生物的可利用的通用型亲和基团。并且，很多这样的微生物被封装，一种利于它们在血液中生存和配置(disposition)的现象。其次，已显示，微生物在血流中不一定是自由漂浮的，而是与一些血液细胞及与血小板缔合或螯合。例如，在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的情况下，相互作用的血小板及细菌与血小板的进一步螯合是允许细菌避开宿主防御体系的重要的毒力因素。

从血液样品中直接富集活的微生物的可选方案由分子生物标志物(特异性的核酸基因序列)和紧接着的随后的核酸扩增技术比如PCR(聚合酶链反应)的使用构成。方法开启了传递较快结果的新的可能性。然而，检测水平(灵敏度)通常比基于培养的方法的检测水平低。分子方法的有限灵敏度主要与来自血液样品中的真核细胞(白细胞)的高背景DNA有关。基于PCR的方法的灵敏度的增加可以通过从血液样品中取出真核核酸或通过特别地浓缩微生物(原核的)DNA来实现。从这个角度，EP-A-1,400,589公开了从血液溶解产物中分离原核生物DNA的方法，该方法包括原核生物DNA与至少一种蛋白或多肽的特异性结合，之后分离这样形成的复合物的步骤。在相同的范围内，EP-A-1,861,495公开了用于从额外地包含较多的真核细胞的混合样品中所提供的微生物细胞中特异性地分离核酸的方法。该发明公开了核酸酶尤其是DNA-降解核酸酶的用途，该用途是用于在一种或几种离液剂和/或一种或几种表面活性剂的存在下，降解全血中的核酸，从而允许从血液溶解产物中取出真核生物核酸。两种方法都受到了以下限制：复杂方案和及时处理步骤，即在获得纯化的细菌核酸之前的半天。而且，这些方法显示出100CFU/ml的检测限，这个检测限仍显著低于血液培养方法的灵敏度，所述血液培养方法的灵敏度按照定义为在考虑的10ml体积中的1CFU。

除了现有技术中的核酸检测方法的所提及的限制外，用于检测细菌和真菌的分子方法的相关性通常是有问题的。事实上，检测血液中的循环DNA不一定与检测活的微生物的血液培养方法相关联。为了“保持”这样的相关性，一些方法提出了使用始于阳性血液培养物的基于分子的方法来识别感染剂。然而，这样的方法的临床相关性仍然受到限制，因为仍然需要耗时的培养方法。这个问题甚至是更重要的，因为分子方法在绝大多数情况下不能提供关于细菌的抗菌敏感性谱的信息，后者仍依赖于传统的培养方法。

知晓这些缺点，允许血液中的快速且可靠的微生物检测和识别的新方法的开发仍然是高度相关的问题。而且，本文所提出的在血液中检测感染剂是一个典型的实例，以阐述样品制备程序的复杂性及其在通常的生物测定且尤其是药物诊断中的重大作用。用于确定目标分子或颗粒在包括食物样品、临床样品、环境样品及实验样品的各种样品中的存在的测定越来越重要。

发明概述

本发明涉及用于样品制备和处理，导致从周围的复杂液体介质中有效地分离出目标分子或颗粒的方法。这个方法还将允许回收优选地为起始样品体积的至少1/10的体积的高度浓缩在控制缓冲液介质(controlled buffer medium)中的所述目标。而且，所公开的方法的益处是能够达到起始样品体积的1/100到1/1000的浓缩率(concentration rate)。此后，这样浓缩的目标可以通过另外的纯化步骤来非常容易地处理和/或使用现有技术中的方法学来直接分析。

所公开的样品制备方法尤其适合与各种样品来源与广谱的体积大小一起使用。而且，使用尺寸和/或亲和力选择，根据本发明的分离允许从复杂的样品体积中特异性地或非特异性地分离目标颗粒或分子。

因此，本发明公开了样品制备方法，该方法因此显示出普遍用于基本上任意类型的样品和目标的益处。

基于所公开的方法，本发明还公开了可以非常容易地手动使用或与现有技术中的自动化系统集成(integrate)的样品收集装置，这使得这个样品制备方法因此易于集成到常规的实验室工作流程中。

所公开的样品制备方法的技术基础是基于发明人关于通过以下有效地分离通常是从血液样品中分离目标微生物如细菌或真菌颗粒的可能性的观察：通过使用凝血酶使血液样品控制凝结，以控制的且标准化的方式将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，以将所述目标颗粒捕获在纤维蛋白网(fibrin network)内，纤维蛋白网将快速地回缩(retract)以在血液容器内形成小球(pellet)。当形成小球时，周围的血液样品可以被倒出，导致捕获在这个小球内的目标的分离。在第二步骤中，小球可以被溶解，以从它们在小体积的控制缓冲液内的纤维蛋白阱中回收目标。关于这个处理，最小尺寸的小球是需要控制的关键因素，因为其将决定所公开的方法的浓缩率。

因此，关于血液样品，其是指全血、富血小板血浆及乏血小板血浆或血清。明显地，根据本发明的血液还可以指血液代用品或由成分血、血液添加剂或模拟血液功能的任意其它成分构成的人工组合的样品。这样的成分血且常用于血液灌注的成分血的典型实例包括血小板浓缩物、红细胞(血红蛋白)浓缩物、血清或血浆代用品(还称为体积膨胀剂)。在所述血液样品缺乏凝血因子(主要为纤维蛋白原)的情况下，例如在如败血症样品、组合的血液样品或血液代用品的一些临床情况下，这种缺乏可以通过向所述血液样品中添加包含纤维蛋白原的凝血因子作为能够分离根据本发明的目标颗粒或分子的必要成分来补偿。

尽管当前的发明优选地公开了从血液样品中分离微生物或感染分子或颗粒的方法，但本领域的技术人员承认，本文的血液样品还可以指进入控制的凝结过程的包括成分血的组合的样品，如前面所描述的。

因此，通常，本发明因此公开了从含纤维蛋白原蛋白的样品中分离且浓缩目标颗粒或分子的方法，该方法是通过在第一步骤中，通过至少部分地使包含在所述样品中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成纤维蛋白网，将所述目标分子或颗粒捕获在纤维蛋白网中。在第二步骤中，这样形成的纤维蛋白网形成纤维蛋白凝块，该纤维蛋白凝块将从周围的样品介质中分离。

在一个实施方式中，根据本发明的分离是通过尺寸选择通过捕获所述目标颗粒来获得的。因此，在这个捕获过程中，纤维蛋白网孔的尺寸是特别关键的。较小的孔径确实将导致小的感染性微生物如大肠杆菌(E.coli，2μm)或衣原体(0.3μm)或甚至病毒的较有效的捕获。在这个方面，对捕获纤维蛋白网的控制可以通过调节参数如样品pH和离子强度及所述样品内的钙、纤维蛋白原、凝血酶的浓度来实现。

在一个实施方式中，根据本发明的分离是通过将所述目标颗粒亲和捕获在纤维蛋白网中来获得的。发明人的观察是：细菌颗粒如金黄色葡萄球菌对纤维蛋白原/纤维蛋白分子具有强的亲和力，这进一步利于(增强)它们根据本发明方法的分离和浓缩。通过模仿细菌颗粒的亲和相互作用，本发明公开了使用天然的及诱导的亲和相互作用，以从包含纤维蛋白原的样品中分离目标。

根据本发明的优选实施方式的诱导的亲和分离是用主要由包含针对所述目标分子或颗粒的捕获部分域的纤维蛋白原融合蛋白组成的纤维蛋白原重组蛋白来实现的。在另一个实施方式中，化学捕获是通过纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分如金黄色葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白和捕获物质的部分(substance-capturing moiety)如针对所述目标分子或颗粒的抗体来保证的。

因此，可以采用纤维蛋白网内的尺寸捕获及特异性的亲和结合反应，用于生物样品中的各种各样的目标物质的检测或分离。目标物质的实例为细胞、细胞成分、细胞亚种群(真核和原核两种)、细菌、病毒、寄生虫、抗原、特异性抗体、毒素、蛋白、核酸序列及类似物质。

因此，如本文所指的纤维蛋白原通常可以是从任意血液来源比如人血液或脊椎动物血液中获得的天然的纤维蛋白原。例如，根据本发明的纤维蛋白原还可以是通过以获得具有新的亲和功能性的新分子的方式组合天然的纤维蛋白原和任意其它分子所得到的合成的组合分子。在优选的实施方式中，这样组合的分子是通过纤维蛋白原分子和其它分子的共价键合得到的。在另一个实施方式中，这样组合的分子是通过现有技术中的重组蛋白合成技术产生的融合蛋白。

如本文所指的纤维蛋白原还可以是将具有整个纤维蛋白原晶体结构的改性的合成的纤维蛋白原分子。在优选的实施方式中，合成的纤维蛋白原分子是将具有不同的结构、尺寸、组成和亲和活性的改性的分子。更具体地，期望的是，根据本发明的纤维蛋白原是仍然表现出被凝血酶裂解(聚合)活性且可以具有关于目标颗粒或分子的明确的亲和结合反应的结构简化的分子(而不是复杂的大的天然的纤维蛋白原分子)。

因此，本发明公开了的纤维蛋白原或纤维蛋白原改性的蛋白作为载体以捕获或俘获目标颗粒或分子的用途。在所述纤维蛋白原或纤维蛋白原改性的蛋白暴露于凝血酶时，使纤维蛋白原分子裂解且使它们转化成纤维蛋白。之后，纤维蛋白颗粒将自聚合(self-polymerize)，以形成小的凝块，目标被捕获在小的凝块中，从而导致从样品液体体积中分离出目标。在与现有技术中的技术例如作为基于磁性颗粒或任意其它“固体表面”的技术相比时，提出的方法显示出大的益处。因为该方法在分子水平发生，目标与纤维蛋白原载体之间的反应是非常快且有效的，且将消除基于表面的测定所固有的非特异性结合的问题。

基于此且在具体的应用中，本发明提供了允许提供从感染的血液样品中有效地分离且浓缩未受损伤的微生物的解决方案的方法。本发明的一个可实现的目的是从大量的血液中分离出少量的微生物，之后允许它们浓缩在与进一步处理步骤相容的少量的缓冲液中。本发明的另一个可实现的目的是从血液样品中分离出未受损伤的微生物，之后，其可以通过本领域认可的特定技术来检测和分析。如所获得的，相反，使用快速培养方法及快速且更灵敏的基于分子的测定，这种方法开启了快速且有效地检测和诊断血流感染的许多可能性。

因此，明显地的是，从之前的描述当中，根据本发明的纤维蛋白原可以源于样品(即全血样品)或被人工地添加到所述样品中。

基于此且在具体的应用中，本发明提供用于从组合的样品中分离目标分子或颗粒的方法，该方法包括以下步骤：

(a)向所述样品中添加纤维蛋白原。

(b)通过将添加到所述样品中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成纤维蛋白网，将所述目标分子或颗粒捕获在纤维蛋白网中。

(c)回缩所述纤维蛋白网，以形成纤维蛋白凝块。

(d)从周围的样品介质中分离所述纤维蛋白凝块。

根据本发明的组合样品可以包括血液、血液衍生物或成分血样品，而且可以指任何不含纤维蛋白原的样品，例如但不限于临床样品(如尿、痰及拭子)、食物样品和环境样品。

因此，本发明还公开了用于从样品中分离目标分子或颗粒的样品收集装置，其包括：(i)识别编码；(ii)用于容纳所述样品的容器；及(iii)容器中的含纤维蛋白原的样品，装置可操作以在所述样品暴露于所述装置内的凝血酶或凝血酶样酶(thrombin-likeenzyme)时形成以可分离的方式捕获所述目标分子或颗粒的纤维蛋白凝块。

根据本发明的装置可以是设计成接收流体样品的标准反应管或储器，流体样品之后需要被检查目标颗粒或分子例如致病颗粒(细菌、病毒等)或目标分子(DNA、RNA或蛋白等)的存在。本发明的装置还将包括将导致纤维蛋白凝块形成和目标分离的稳定的试剂制剂，如上文所描述的。优选地，装置包括容纳其储存的稳定试剂制剂的反应区域，试剂制剂包括凝血因子如纤维蛋白原分子和凝结促进剂如凝血酶。这样的装置将允许以来自任何复杂生物样品的极其低的拷贝数，在检测试剂盒中定量分离且检测目标如感染剂、毒素、核酸和蛋白。公开的装置将允许收集样品且同时有效地从所述样品中分离且浓缩目标颗粒或分子的事实将极大地简化必要的样品处理步骤，且还导致潜在的感染风险和污染风险的降低。

因此，本发明的主要方面涉及根据独立权利要求1得到的用于从包含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法。

因此，本发明的主要方面涉及根据独立权利要求36得到的用于从样品中分离目标分子或颗粒的样品收集装置。

特别地，本申请提供了以下内容：

项目1.一种用于从含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法，包括：

a.通过至少部分地使包含在所述样品中的所述纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成纤维蛋白网，将所述目标分子或颗粒捕获在所述纤维蛋白网中，

b.回缩所述纤维蛋白网，以形成纤维蛋白凝块，

c.从周围的样品介质中分离所述纤维蛋白凝块。

项目2.根据项目1所述的方法，其中所述样品内的所述纤维蛋白原的浓度为至少1μg/ml。

项目3.根据项目2所述的方法，其中所述样品内的所述纤维蛋白原的浓度为至少10mg/ml。

项目4.根据项目1所述的方法，其中步骤(a)包括使所述样品经历凝血酶或凝血酶样酶。

项目5.根据项目4所述的方法，其中所述凝血酶包括外源性的凝血酶或凝血酶样酶。

项目6.根据项目4所述的方法，其中所述凝血酶包括内源性的凝血酶。

项目7.根据项目5所述的方法，其中所述外源性的凝血酶的浓度在0.01到10IU每毫升样品之间。

项目8.根据项目1所述的方法，其中所述样品还包含凝血因子XIII。

项目9.根据项目1所述的方法，其中所述样品还包含钙。

项目10.根据项目1所述的方法，其中所述样品还包含选自GDTA、EDTA和柠檬酸盐的组的螯合剂。

项目11.根据项目1所述的方法，其中所述凝块体积为初始样品体积的至多1/3。

项目12.根据项目1所述的方法，其中在步骤(b)中形成的所述凝块还回缩成具有小于所述初始样品体积的1/10的尺寸的小球。

项目13.根据项目12所述的方法，其中所述回缩步骤是用所述样品内的活化血小板细胞或活化血小板细胞溶解产物来实现的。

项目14.根据项目13所述的方法，其中用选自腺苷二磷酸和胶原的组的血小板激动剂来活化所述血小板。

项目15.根据项目13所述的方法，其中所述回缩步骤是用捕获在所述纤维蛋白网内且经历磁场的磁性颗粒来实现的。

项目16.根据项目15所述的方法，其中所述磁性颗粒被涂覆有纤维蛋白原/纤维蛋白结合部分。

项目17.根据项目1和7所述的方法，其中所述外源性的凝血酶的浓度在0.01到1IU每毫升所述样品之间。

项目18.根据项目1所述的方法，所述方法还包括溶解所述纤维蛋白凝块以回收所述目标分子或颗粒的步骤。

项目19.根据项目18所述的方法，其中溶解所述凝块的所述步骤是用纤维蛋白溶解剂来进行的。

项目20.根据项目18所述的方法，其中所述溶解步骤使用选自由细胞溶解酶、蛋白酶和核酸降解酶组成的组的组分。

项目21.根据项目18所述的方法，其中所述溶解步骤包括洗涤剂的使用。

项目22.根据项目1所述的方法，其中所述样品是血液样品。

项目23.根据项目22所述的方法，其中所述血液样品选自由全血、富血小板血浆、乏血小板血浆及血清组成的组。

项目24.根据项目22所述的方法，其中所述血液样品是通过组合血液样品和纤维蛋白原缺乏的样品得到的人工组合的血液样品。

项目25.根据项目22所述的方法，其中所述血液样品是通过组合凝血因子和纤维蛋白原缺乏的样品得到的人工组合的血液样品。

项目26.根据项目25所述的方法，其中所述凝血因子是纤维蛋白原。

项目27.根据项目1所述的方法，其中步骤c)中的分离是通过将所述目标颗粒或分子尺寸选择捕获在具有在10nm和100μm之间的孔径的所述纤维蛋白网内来获得的。

项目28.根据项目1所述的方法，其中步骤c)中的分离是通过将所述目标颗粒亲和捕获在所述纤维蛋白网中来获得的。

项目29.根据项目28所述的方法，其中化学捕获是通过所述目标分子或颗粒与纤维蛋白原或纤维蛋白的天然亲和力来实现的。

项目30.根据项目28所述的方法，其中所述纤维蛋白原是重组蛋白。

项目31.根据项目28所述的方法，其中化学捕获包括主要由以下组成的分子：(i)纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分及(ii)针对所述目标分子或颗粒的捕获物质的部分。

项目32.根据项目30所述的方法，其中所述重组蛋白是具有针对所述目标分子或颗粒的捕获部分域的纤维蛋白原融合蛋白。

项目33.根据项目31所述的方法，其中纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分选自包括凝血酶、纤维连接蛋白、细菌纤维蛋白原结合蛋白、组织型纤溶酶原激活物、整合蛋白的组，及衍生自这个组的任何成员的部分。

项目34.根据项目31所述的方法，其中针对所述目标分子或颗粒的捕获物质的部分选自包括设计成特异性识别所述目标分子或颗粒的抗体、核酸和适体的组。

项目35.根据项目33和34所述的方法，其中所述纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分和所述捕获物质的部分共价结合。

项目36.一种用于从样品中分离目标分子或颗粒的样品收集装置，包括：(i)识别编码；(ii)用于容纳所述样品的容器；及(iii)在所述容器中的含纤维蛋白原的样品，所述装置可操作以在所述样品暴露于所述装置内的凝血酶或凝血酶样酶时形成以可分离的方式捕获所述目标分子或颗粒的纤维蛋白凝块。

项目37.根据项目36所述的装置，其中所述样品容器的体积在0.1到20ml之间。

项目38.根据项目36所述的装置，其中所述样品内的纤维蛋白原的浓度在0.1到100mg/ml之间。

项目39.根据项目36所述的装置，其中所述凝血酶或凝血酶被初始包含在所述装置内。

项目40.根据项目36所述的装置，其中所述凝血酶或凝血酶在所述样品收集后被添加到所述装置中。

项目41.根据项目36所述的装置，所述装置还包括选自钙、螯合剂；活化血小板细胞或活化血小板细胞溶解产物及因子XIII的组的添加剂。

项目42.根据项目36所述的装置，所述装置还包括磁性颗粒。

项目43.根据项目42所述的装置，其中所述磁性颗粒被涂覆有纤维蛋白原/纤维蛋白结合部分。

项目44.根据项目43所述的装置，所述装置还包括具有以下的分子：(I)纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分及(II)针对所述目标分子或颗粒的捕获物质的部分。

项目45.根据项目36所述的装置，其中所述样品中的所述纤维蛋白原是重组的。

项目46.根据项目45所述的装置，其中所述样品中的所述纤维蛋白原是具有针对所述目标分子或颗粒的捕获部分域的纤维蛋白原融合蛋白。

项目47.根据项目1-35中任一项所述的方法或根据项目36-46中任一项所述的装置，其中所述目标分子或颗粒包括细菌、病毒、酵母、蛋白、肽和/或核酸。

项目48.一种使用根据项目36-47中任一项所述的装置的方法，包括：

a.提供项目36的反应装置，其中所述装置包括干试剂制剂；

b.向所述装置中添加包含目标颗粒或分子的生物样品，

c.在允许在所述装置内形成纤维蛋白凝块的条件下，培养所述生物样品，

d.从所述装置中取出所述样品液体，

e.溶解所述纤维蛋白凝块且释放所述目标颗粒或分子。

不同的实施方式在从属权利要求中进行陈述。权利要求的主题及所有所要求的组合通过引用被并入到本说明书，且即使权利要求被放弃，其仍然属于本公开的一部分。

附图简述

本发明的目的和特征在所附的权利要求中特别陈述。结合附图，通过参考以下的描述，本发明关于其组织和操作方式两者连同另外的目的和益处可以更好地被理解，其中

图1是凝结过程的示意图(参考http://en.wikipedia.org/wiki/Coagulation)，且其显示了可用于获得本发明的主要客观目的的纤维蛋白原到纤维蛋白的转化。

图2是在包含纤维蛋白原(1)的样品暴露于凝血酶时，将目标分子或颗粒(2)捕获在纤维蛋白网(3)中的机制的示意图。

图3是在包含纤维蛋白原的样品暴露于凝血酶时，用于将目标分子或颗粒亲和捕获在纤维蛋白网中的不同实施方式的示意图：(a)具有结合部分(4)的目标(2)与纤维蛋白原/纤维蛋白(1)的天然亲和力；(b)通过针对所述目标(2)且具有纤维蛋白/纤维蛋白原(1)结合部分(4)的捕获物质的部分(5)的亲和捕获；(c)通过具有针对目标(1)的捕获部分域(7)的纤维蛋白原融合蛋白(1)的亲和捕获。

图4是图3(b)的亲和捕获的变化形式的示意图，其中亲和捕获是通过针对所述目标(2)且具有纤维蛋白(3)结合部分(4')的捕获物质的部分(5)来进行的。在优选的实施方式中，仅在样品暴露于凝血酶的步骤之后，部分(4')与纤维蛋白的亲和力将转化成活性形式(4)。

图5是从目标分离到检测的整个测定处理的示意图，且其中包含纤维蛋白原(1)的样品内的目标(2)被暴露于包含纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分(4)的捕获物质的部分(5)和包含检测标记(9)的标记物质的部分(8)。在暴露于凝血酶时，复合物“目标/捕获物质的部分/标记物质的部分”将被隔绝在回缩的纤维蛋白凝块内。目标的检测将在凝块浓缩物上直接进行。

图6是样品收集装置操作的示意图；根据本发明，装置可操作以在所述样品暴露于所述装置内的凝血酶或凝血酶样酶时形成以可分离的方式捕获所述目标分子或颗粒的纤维蛋白凝块。

发明详述

根据本发明的一个实施方式，用于从血液样品中分离目标分子或颗粒的方法包括：

(a)通过至少部分地使包含在所述样品中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成纤维蛋白网，将所述目标分子或颗粒捕获在纤维蛋白网中；

(b)回缩所述纤维蛋白网，以形成纤维蛋白凝块；

(c)从周围的样品介质中分离所述纤维蛋白凝块。

因此，关于血液样品，其是指全血、富血小板血浆及乏血小板血浆。血液样品还可以指血清，其中在这种情况下，必须将纤维蛋白原添加到所述样品中，以允许根据本发明的分离机制起作用。明显地，根据本发明的血液还可以指血液代用品或由成分血、血液添加剂或模拟血液功能的任意其它成分构成的人工组合的样品。这样的成分血和常用于血液灌注的成分血的典型实例包括血小板浓缩物、红细胞(血红蛋白)浓缩物、血清或血浆代用品(还称为体积膨胀剂)。在所述血液样品缺乏凝血因子(主要为纤维蛋白原)的情况下，例如在如败血症样品、组合的血液样品或血液代用品的一些临床情况下，这种缺乏可以通过向所述血液样品中添加包含纤维蛋白原的凝血因子作为能够分离根据本发明的目标颗粒或分子的必要成分来补偿。

在相同的精神内，根据本发明的血液样品因此还可以指通过组合血液样品和纤维蛋白原缺乏的样品(fibrinogen deficient sample)所得到的人工组合的血液样品。这样的纤维蛋白原缺乏的样品可以包括来自任意来源的样品例如生物样品、临床样品、食物样品及环境样品。更具体地，根据本发明的术语血液样品包括通过组合至少包含纤维蛋白原的凝血因子和纤维蛋白原缺乏的样品得到的人工组合的血液样品。

如本文通常所使用的“纤维蛋白网”是指其中纤维蛋白原在暴露于凝血酶时裂解且转变成纤维蛋白的过程的产物。一旦纤维蛋白原转化成纤维蛋白，发生自聚合步骤，其中纤维蛋白单体聚集且形成非共价交联的三维聚合物网。而且，在凝血因子XIII的存在下，纤维蛋白网将通过因子XIIIa交联，因子XIIIa是因子XIII的被凝血酶活化的转谷氨酰胺酶。存在其它转谷氨酰胺酶且还可以涉及共价交联且接枝到纤维蛋白网上。

如本文通常所使用的“凝块形成与回缩”是指观察到的纤维蛋白基质的拉入，以在某一时间后形成凝块。在一定的条件下，通过将水拉出凝块，这个凝块的大小可以随时间的过去而变小(即，凝块回缩)。当然，凝块回缩是通过来自捕获在凝块的纤维蛋白网眼中的活化血小板的多种凝血因子的释放来诱导的。

对于纤维蛋白网的形成，纤维蛋白原溶液和/或凝血酶溶液的浓度对形成的网的密度、凝块形成、最终的纤维蛋白基质的交联及速率具有重要的影响。通常，凝血酶和纤维蛋白原的量的减少使交联过程减缓且有助于形成具有较小密度的网的纤维蛋白凝块。因此，控制凝血酶和纤维蛋白原的量的比率导致控制形成纤维蛋白网密度和最终凝块的大小。而且，凝血酶与纤维蛋白原的量的比率提供具有更适合用于目标捕获的较小密度的网的纤维蛋白基质。而且，凝血酶与纤维蛋白原的量的比率提供具有较小尺寸的回缩的纤维蛋白凝块，允许得到分离的目标颗粒或分子的高的浓缩率。

本发明的潜在机制是：将纤维蛋白原转化成纤维蛋白导致纤维蛋白网的形成，纤维蛋白网将起到捕获目标颗粒或分子的网的作用。为了获得期望的效果，所述纤维蛋白网形成的控制是尤为重要的。在这个方面，作为关键的凝血因子的凝血酶和纤维蛋白原的浓度在纤维蛋白捕获网的形成和随后的根据本发明的凝块产生及分离中是关键的。事实上，高浓度的凝血酶和纤维蛋白原导致非常密集的纤维蛋白网和不期望的大的凝块尺寸。然而，发现是：较低浓度的凝血酶和纤维蛋白原导致在样品器皿或容器中快速回缩成小球形式的稀松的纤维蛋白网的形成。在这个回缩过程中，纤维蛋白网捕获来自样品体积的目标颗粒或分子，从而导致它们从所述样品中的浓缩和分离。

为了达到从包含纤维蛋白原的样品中有效捕获和分离目标颗粒或分子的期望的效果，所述纤维蛋白原在样品中的浓度优选地为至少0.1μg/ml。在优选的实施方式中，纤维蛋白原在样品中的浓度在10mg/ml到10μg/ml之间。还可以使用较高的浓度，甚至超出本文所述的范围，但导致较大的纤维蛋白基质密度和回缩的凝块尺寸。在用尺寸选择或尺寸捕获来分离目标颗粒的情况下，使用相对高浓度的纤维蛋白原是尤为合适的。目标颗粒的尺寸越小，所需要的纤维蛋白原浓度就越高。然而，使用较高浓度的纤维蛋白原的不利方面是较大的凝块尺寸的形成，导致目标颗粒的较低的浓缩率。因此，实际上且在尺寸选择或尺寸捕获的情况下，纤维蛋白原的浓度必须以达到最大的捕获效率且同时达到较小的凝块尺寸的方式来优化。

从前面的描述充分地理解，根据本发明的纤维蛋白原可以源于样品(即血液样品)或被人工地添加到所述样品中。在优选的实施方式中，纤维蛋白原将被添加到样品中，即使所述样品具有天然的纤维蛋白原，例如如全血的情况。例如，这将是有益的：补偿任意的纤维蛋白原缺乏或在可在这样的样品中发生的天然的纤维蛋白原的浓度的变化。在另一个优选的实施方式中，添加到血液样品中的纤维蛋白原(即使天然的纤维蛋白原浓度为期望的浓度)将源自与考虑当中的样品的种类不同的种类的血液来源。例如，如果使用人全血样品，根据这个实施方式，将源自于另外的脊椎动物如牛、绵羊、负鼠或鸡的纤维蛋白原添加到所述人样品中。使用纤维蛋白原/纤维蛋白反应可以是物种特异性的事实，通过将作为添加剂的不同的纤维蛋白原来源用到具有天然纤维蛋白原的样品中的预期效果为：特异性地使用所添加的纤维蛋白原(优选地用相关物种的凝血酶来活化)来完成目标分离，同时避免(最小化)分离过程中的天然纤维蛋白原的干扰。这可以是特别有益的，因为其将允许目标分离过程的更有效的控制且避免了依赖于天然纤维蛋白原变化。在相同的精神内，在另一个实施方式中，所添加的纤维蛋白原将是重组纤维蛋白原蛋白，所述重组纤维蛋白原蛋白被特别设计以在使用时不被血液样品的内源性凝血酶裂解。

从包含纤维蛋白原的样品中有效地捕获且分离目标颗粒或分子的期望的效果可以相应地通过使所述样品经历凝血酶或凝血酶样酶来实现。在这个方面，所述凝血酶可以是外源性的(人工添加到所述样品)或内源性的(已经是所述样品的一部分)凝血酶或凝血酶样酶。因此，凝血酶可以以活性形式或可以通过凝血因子如因子X的活化来产生，如图1所示的。该凝血酶和/或凝血因子的来源可以是来自人、动物或昆虫来源。因此，关于凝血酶样酶，是指从外部血液来源获得且具有将纤维蛋白原转化成纤维蛋白的能力的丝氨酸蛋白酶的家族。这样的酶是本领域熟知的且通常从蛇毒获得或以重组形式产生。

在优选的实施方式中，凝血酶浓度为0.01到10I.U/ml样品，且优选地在0.1到2I.U/ml样品的范围内。实际上，凝血酶或凝血酶样酶的量必须被更精确地调节成与装置内的纤维蛋白原浓度相应，以获得期望的纤维蛋白网结构和凝块尺寸。在这个方面，凝血酶的量优选地小于20I.U凝血酶每毫克纤维蛋白原，优选地在0.01到10I.U凝血酶每毫克纤维蛋白原的范围内，更优选地在0.1到1I.U凝血酶每毫克纤维蛋白原之间。

在控制纤维蛋白网结构以从样品中捕获目标分子或颗粒的优选的实施方式中，还可以调节钙的浓度。实际上，这可以通过将钙离子源添加到测试样品中来实现。钙离子源优选地为氯化钙(CaCl₂)，优选地以在1到10毫克每毫升样品体积，甚至更优选地在4到7毫克每毫升样品体积之间，最优选地在5到6毫克每毫升样品体积之间的浓度范围。在血液样品中，例如，钙天然地存在，且钙浓度的调节可以通过额外地添加选自GDTA、EDTA和柠檬酸盐的组的钙螯合剂来实现。

在控制纤维蛋白网结构以从样品中捕获目标分子或颗粒的优选的实施方式中，方法可以涉及将凝血因子XIII添加到所述样品中的步骤。凝血因子XIII是在其被凝血酶活化之后能够催化纤维蛋白基质交联形成的酶。这将进一步有助于稳定纤维蛋白网结构，加速凝块回缩且有助于滴定(titer)纤维蛋白孔隙率。以在0.5到100I.U每毫升样品体积之间，更优选地在1到60I.U每毫升样品体积之间，且最优选地在1到10I.U每毫升样品体积之间的浓度范围，以其非活性或活性(XIIIa)形式的这样的因子XIII可以连同纤维蛋白原添加剂一起被添加或调节。

由前面的描述推断，根据本发明的方法的主要可实现的目的是从测试样品中有效地浓缩目标颗粒或分子。实际上，浓缩系数或比率是由凝块尺寸确定的。因此，在优选的实施方式中，所形成的凝块的尺寸为起始样品尺寸的至多1/3，且优选地凝块尺寸小于起始样品体积的1/10。而且，在根据本发明的优选实施方式中，凝块回缩以进一步形成具有可达到在起始样品体积的1/50到1/1000之间的值的尺寸的小球。

为了获得较高的回缩率，如上文已经描述的，纤维蛋白原和凝血酶的浓度是主要因素。其它参数如钙浓度和添加剂如凝血因子XIII可以影响凝块尺寸。然而，实际上，在所述样品内的活化血小板细胞或活化血小板细胞溶解产物的存在下，凝块还可以回缩。天然存在于血液样品中或作为血液组成样品的添加剂，血小板的活化可以用选自腺苷二磷酸(ADP)和胶原的组的血小板激动剂来实现。

因此，本发明公开了从包含纤维蛋白原的样品中分离目标分子或颗粒的方法，方法包括使所述样品经历活化血小板细胞或血小板细胞溶解产物的步骤。在优选的实施方式中，所述活化血小板细胞或血小板细胞溶解产物可以天然地存在于所述样品中或被人工地添加到所述样品中。血小板活化优选地通过在1mM到1μM且优选地在100μΜ到10μΜ之间的浓度下的ADP来实现。

为了获得较高的回缩率，在优选的实施方式中，捕获在纤维蛋白网中的磁性颗粒可以被用作回缩工具(means)，以压缩且从而减小凝块的尺寸。实际上，磁性颗粒将被用于模仿由血小板在回缩纤维蛋白凝块中天然起到的作用。这种回缩可以通过使捕获在纤维蛋白凝块内的磁性颗粒经历外部磁力来实现。因此，与纤维蛋白网的孔隙率相比，由于磁性颗粒的尺寸较大，所述磁性颗粒被捕获在纤维蛋白凝块中。在优选的实施方式中，磁性颗粒通过所述颗粒可以具有的与纤维蛋白原/纤维蛋白的亲和相互作用而被捕获在纤维蛋白凝块内。这可以用涂覆有纤维蛋白原/纤维蛋白结合部分的磁性颗粒来实现，纤维蛋白原/纤维蛋白结合部分可以选自凝血酶、凝血因子XIII、细菌纤维蛋白原结合蛋白和组织型纤溶酶原激活物(t-PA)的组。

为了进一步浓缩目标分子或颗粒，本发明还公开了亲和捕获以将所述目标俘获在纤维蛋白网内的用途。使用亲和捕获的益处是双重的：(1)俘获难于或不能通过尺寸俘获在纤维蛋白网内的小目标；(2)允许高水平的目标浓度(即，非常小的凝块或相当小的球)，因为使用亲和捕获，需要较低的纤维蛋白原浓度来实现有效的俘获收率。事实上，使用亲和捕获，可以预期达到小于起始样品体积的1/50且优选地在起始样品体积的1/100到1/1000之间的浓缩率。使用大的样品体积(例如3-10ml)，浓缩率甚至可以小于起始样品体积的1/1000。

如图3(a)所阐明的，在优选的第一实施方式中，亲和捕获可以通过具有结合部分(4)的目标(2)与纤维蛋白原/纤维蛋白(1)的天然亲和力来实现。这样的亲和捕获的典型实例是捕获金黄色葡萄球菌，已知金黄色葡萄球菌通过其表面纤维蛋白原结合蛋白凝集因子A(CIfA)具有与纤维蛋白原/纤维蛋白的有效亲和力。一般而言且如国际专利申请WO2011/007,004中详细描述的，葡萄球菌、链球菌和肠球菌携带称作粘附素的蛋白，所述粘附素可以通过结合到包括纤维蛋白原的蛋白上来介导感染。在血液的情况下。根据本发明的方法的另外的益处是使用血液细胞的天然亲和力，以进一步使白细胞和凝血细胞沉淀在小的纤维蛋白小球内，同时基本上使红细胞保持在悬浮液中。这是特别重要的，因为微生物不一定自由漂浮在血液样品中，而是缔合或螯合在白细胞和凝血细胞中。例如，在金黄色葡萄球菌的情况下，相互作用及之后在血小板中的螯合和细菌存活有助于毒力，因为其允许细菌避开宿主防御。天然的亲和捕获还可以用于捕获小分子如由于电荷相互作用而强结合到纤维蛋白上的核酸。关于细菌颗粒，天然亲和力可以延伸到小的蛋白分子上，只要这样的分子具有与纤维蛋白原/纤维蛋白的直接的相互亲和力。

在优选的实施方式中，天然的亲和分离过程可以通过使用来自不同物种的纤维蛋白原来修改。例如，使用绵羊纤维蛋白原而不是人纤维蛋白原将降低金黄色葡萄球菌的捕获率。这是由于绵羊纤维蛋白原显示出与金黄色葡萄球菌细菌的低的结合亲和力的事实。在相同的指导下，在使用中，样品内的纤维蛋白原可以是被设计成增强或抑制纤维蛋白原与确切目标或目标基团的天然的亲和捕获的重组的或改性的纤维蛋白原。

亲和捕获的第二实施方式阐明在图3(b)中。因此，亲和力是用针对所述目标(2)且又具有纤维蛋白/纤维蛋白原(1)结合部分(4)的捕获物质的部分(5)来实现的。捕获物质的部分作为中间方式以连接目标的用途是在目标不具有与纤维蛋白原/纤维蛋白的天然的亲和力的情况下是优选的。其典型的实例是在大多数情况下缺乏与纤维蛋白原/纤维蛋白的天然的亲和力的革兰氏阴性物种的捕获。例如，这可以通过使用具有纤维蛋白原结合部分的革兰氏阴性特异性抗体来实现。而且，实际上，间接的亲和捕获可以延伸到任意目标颗粒或分子，目标颗粒或分子可以包括但不限于目标细胞、细胞成分、细胞亚种群(真核和原核两种)、细菌、病毒、寄生虫、抗原、特异性抗体、毒素、蛋白、核酸序列及类似物质。为了实现这个，针对所述目标分子或颗粒的捕获物质的部分选自包括设计成特异性识别所述目标分子或颗粒的抗体、核酸和适体的组。而且，所述捕获物质的部分可以偶联或组合选自包括凝血酶、纤维连接蛋白、细菌纤维蛋白原结合蛋白、组织型纤溶酶原激活物、整合蛋白的组及衍生自这个组的任何成员的部分的纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分。在优选的实施方式中，所述纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分和所述捕获物质的部分共价结合。

亲和捕获的第三实施方式阐明在图3(c)中。因此，亲和力是用具有针对目标(1)的捕获部分域(7)的纤维蛋白原融合蛋白(1)来实现的。纤维蛋白原融合蛋白的使用呈现出直接在纤维蛋白原分子内组合亲和捕获的选择性的益处。在这个角度内，纤维蛋白原分子可以被定制或被特别地设计以特异性地捕获且之后分离一个组或特定组的目标。而且，纤维蛋白原重组的或改性的蛋白可以被设计，以避免天然的相互作用和/或增强与特定样品类型内的分子或颗粒的特异性相互作用。而且，在另外的实施方式中，纤维蛋白原融合蛋白还包括降解位点。这对于在溶解步骤期间，从纤维蛋白网中回收结合的目标分子或颗粒，将是特别有用的，如下文将描述的。在优选的实施方式中，降解位点是酶促或水解降解位点。在最优选的实施方式中，降解位点是酶促降解位点，其通过选自由纤溶酶和基质金属蛋白酶组成的组的酶来裂解。

在优选的实施方式中且如图4所阐明的，亲和捕获是通过针对所述目标(2)且具有对纤维素蛋白原没有任何亲和力的特异性纤维蛋白(3)结合部分(4')的捕获物质的部分(5)来进行的，如使用组织型纤溶酶原激活物作为纤维蛋白结合部分。在优选的实施方式中，仅在样品暴露于凝血酶的步骤之后，如在使用因子XIII作为纤维蛋白结合部分的情况下，部分(4')与纤维蛋白的亲和力将转化成活性形式(4)。

在使用当中，本发明不仅涉及用于分离且浓缩目标分子或颗粒的方法，而且本发明还可以进一步包括检测所述目标的步骤，如图5所阐明的。在这个方面，测定处理包括将目标捕获且分离在纤维蛋白凝块内，之后直接检测凝块浓缩物内的所述目标的步骤。例如，这可以通过将包含纤维蛋白原(1)的样品暴露于包含纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分(4)的捕获物质的部分(5)和包含检测标记(9)的标记物质的部分(8)来实现。这导致“目标/捕获物质的部分/标记物质的部分”的形成。在暴露于凝血酶时，将在回缩的纤维蛋白凝块(3)内分离复合物“目标/捕获物质的部分/标记物质的部分”。通过例如将纤维蛋白凝块暴露于标记(8)激发源(10)以导致检测信号(11)的发射，在凝块浓缩物上直接进行目标的检测。通常，检测方法学将取决于所使用的标记，且为此，可以采用熟知的检测方法学如荧光、发光、SERS(表面增强拉曼光谱学)和拉曼光谱学。

在小球形成且目标分离后，在优选的实施方式中，纤维蛋白凝块或小球可以悬浮在控制缓冲溶液中，之后扰动(即溶解)凝块，以从纤维蛋白凝块中回收分离的目标。控制缓冲液的典型实例为低渗缓冲液，包含洗涤剂和纤维蛋白溶解剂如纤溶酶和/或蛋白水解剂如蛋白酶K、链霉蛋白酶和金属蛋白酶的缓冲液。这样的溶解步骤可以通过另外添加凝块溶解增强剂如纤溶酶原或纤溶酶原激活物来改进。在优选的实施方式中，溶解步骤还可以包括使用核酸降解酶。

对于本发明的实际实施，本发明的第二方面涉及用于从样品中分离目标分子或颗粒的样品收集装置，其包括：(i)识别编码；(ii)用于容纳所述样品的容器，所述容器可以以将容纳所述样品的管的形式；及(iii)所述容器中的含纤维蛋白原的样品，所述装置可操作以在所述样品暴露于所述装置内的凝血酶或凝血酶样酶时形成以可分离的方式捕获所述目标分子或颗粒的纤维蛋白凝块。

因此，所述样品容器的体积在0.1到100ml之间且优选地在0.1到10ml之间。样品中的所述纤维蛋白原的浓度优选地为至少0.1μg/ml。在优选的实施方式中，样品中的纤维蛋白原的浓度在0.1到100mg/ml之间且最优选地在10mg/ml到10μg/ml之间。

因此，所述装置还包括作为添加剂的凝血酶或凝血酶。在这个方面，凝血酶浓度为0.01到10I.U/ml，且优选地在样品的0.1到2I.U/ml的范围内。实际上，凝血酶或凝血酶样酶的量必须被更精确地调节成与装置内的纤维蛋白原浓度相应，以获得期望的纤维蛋白网结构和凝块尺寸。在这个方面，凝血酶的量优选地小于20I.U凝血酶每毫克纤维蛋白原，优选地在0.01到10I.U凝血酶每毫克纤维蛋白原的范围内，更优选地在0.1到1I.U凝血酶每毫克纤维蛋白原之间。

例如，在血液样品作为全血的情况下，根据本发明的样品收集装置还包括促进样品内的内源性凝血酶的生成的凝结剂(coagulation agent)。这样的促进剂可以为例如选自包括以下的组：粉末状的或纤维状的硅酸盐化合物比如高岭土、Celite、硅藻土和玻璃纤维；钙化合物比如碳酸钙和硫酸钙的细粉末；衍生自蛇毒的凝血酶样酶物质；及可以活化凝血因子以促进凝结的多酚类。而且，例如，这些凝结促进剂可以被单独或联合地添加到样品中或涂覆在样品容器的壁内。所述内源性凝血酶促进剂的量和处理必须以控制凝结过程且获得小的纤维蛋白凝块尺寸的方式来调节。

而且，根据本发明的装置可以包含选自钙、螯合剂、活化血小板细胞或活化血小板细胞溶解产物及因子XIII的组的添加剂。因此，样品收集装置还可以包括作为添加剂的磁性颗粒。在优选的实施方式中，装置内的所述磁性颗粒可以涂覆有选自包括凝血酶、纤维连接蛋白、细菌纤维蛋白原结合蛋白、组织型纤溶酶原激活物、整合蛋白的组及衍生自这个组的任何成员的部分的纤维蛋白原/纤维蛋白结合部分。在优选的实施方式中，所述纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分和所述磁性颗粒共价结合。

而且，根据本发明的装置可以包括包含具有以下的分子的添加剂：(I)纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分及(II)针对所述目标分子或颗粒的捕获物质的部分。因此，针对所述目标分子或颗粒的所述捕获物质的部分可以选自包括设计成特异性地识别所述目标分子或颗粒的抗体、核酸和适体的组。而且，所述捕获物质的部分可以偶联或组合选自包括凝血酶、纤维连接蛋白、细菌纤维蛋白原结合蛋白、组织型纤溶酶原激活物、整合蛋白的组及衍生自这个组的任何成员的部分的纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分。在优选的实施方式中，所述纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分和所述捕获物质的部分共价结合。

而且，根据本发明的装置可以包括包含纤维蛋白原重组的或改性的蛋白的添加剂。这样的重组的或改性的纤维蛋白原蛋白可以被特别地设计成增强或抑制所述重组纤维蛋白原蛋白与包含在使用中在装置内的样品中的特定的目标分子或颗粒的亲和相互作用。在优选的实施方式中，在装置内使用的所述重组蛋白是具有针对所述目标分子或颗粒的捕获部分域的纤维蛋白原融合蛋白。在另一个实施方式中，纤维蛋白原融合蛋白还包括降解位点。这对于在溶解步骤期间，从纤维蛋白网中回收结合的目标分子或颗粒，将是特别有用的，如在下文将描述的。在优选的实施方式中，降解位点是酶促或水解降解位点。在最优选的实施方式中，降解位点是酶促降解位点，其通过选自由纤溶酶和基质金属蛋白酶组成的组的酶来裂解。

实际上，所有的前述添加剂可以在样品收集之后被添加到样品中或已经集成在装置内。在最后一种情况下，添加剂可以被统一溶解在含水缓冲液中。优选地，所述缓冲液包含水；氯化钙，优选地以40mM的浓度；和氯化钠，优选地以75mM的浓度；且优选地具有7.3的pH。在优选的实施方式中，所述添加剂可以以冻干形式被包含在装置内，所述冻干形式可以在使用装置之前或在将样品引入到装置内之后被溶解。

这样公开的用于样品收集的装置将起作用，导致目标颗粒或分子被捕获在其中的小的纤维蛋白凝块的形成。实际上，浓缩系数或比率是由凝块尺寸来确定的。因此，构成且设计装置，使得其将导致具有为起始样品尺寸的至少1/3的尺寸的凝块的形成，且优选地凝块尺寸为起始样品体积的至少1/10。而且，在根据本发明的优选实施方式中，凝块回缩以进一步形成具有可以达到在起始样品体积的1/50到1/1000之间的值的尺寸的小球。

根据本发明的样品收集装置可以被用于分离且浓缩目标分子或颗粒，目标分子或颗粒可以选自包括目标细胞、细胞成分、细胞亚种群(真核和原核两种)、细菌、病毒、寄生虫、抗原、特异性抗体、毒素、蛋白、核酸序列及类似物质的组。

根据本发明的样品收集装置可以被用于从如已经定义的各种样品中分离且浓缩目标分子或颗粒。通常，这包括全血、血液衍生物、成分血、具有凝血因子添加剂的组合样品。在这个方面，本文的样品可以指需要测试的任意样品类型，包括食物样品、临床样品、环境样品和实验样品。

实际上，装置内的识别编码可以为例如装置的条码、颜色、尺寸和形状。这样的识别编码可以被用作装置预期的使用和应用的参考或指示物。实际上，根据本发明的装置可以根据它们的构成、装置将被用于的样品类型和或需要分离的目标来区分。

图6显示了用根据本发明的装置来进行样品处理的实例。装置可以是具有密封盖和识别编码的标准反应管。装置被设计成容纳流体样品，流体样品之后需要被检查目标颗粒或分子例如致病颗粒(细菌、病毒等)或目标分子(DNA、RNA或蛋白等)的存在。本发明的装置还将包括将导致纤维蛋白凝块形成和目标分离的稳定的试剂制剂。在装置内样品收集之后，纤维蛋白原分子将首先与管内的目标反应。在第二步骤中，纤维蛋白原将被转化成纤维蛋白，导致聚合和所述目标在纤维蛋白网中的捕获。在第三步骤中，纤维蛋白网将在血液容器内回缩，以形成小球。当形成小球时，周围的样品将被倒出，导致捕获在这个小球内的目标的分离。在最后的步骤中，小球可以被溶解，以使从它们在小体积的控制缓冲液内的纤维蛋白阱中回收目标。尽管目标捕获/小球形成步骤将在例如样品运输期间在密封管中进行，但是小球的分离和溶解可以用现有技术中的液体处理自动化系统来容易地进行。用这个过程，公开的装置将允许收集样品且同时从所述样品中有效地分离且浓缩目标颗粒或分子，极大地简化了必要的样品处理步骤且还导致潜在的感染风险和污染风险的降低。

实施例1.从成分血样品：富血小板血浆(PRP)样品中捕获金黄色葡萄球菌(SA)细菌。500μl的柠檬酸盐化的PRP样品被添加有100CFU的SA细菌。通过添加5μl的以10U.I./ml的浓度的凝血酶且培养，将形成小球(尺寸为10-20μl)。用100μl溶解缓冲液(0.01％皂苷、0.05％吐温和0.05％Triton X)和5μl的蛋白酶K(10U.I./ml)溶解这样形成的小球，导致在溶解缓冲液中回收了90-100％之间的起始添加的SA细菌。

实施例2.从成分血样品：乏血小板血浆(PPP)样品中捕获金黄色葡萄球菌(SA)细菌。500μl的柠檬酸盐化的PPP样品被添加有100CFU的SA细菌且使用如用于实施例1的相同的方案来处理。将获得相同的回收性能。然而，在与PRP情况相比时，纤维蛋白凝块的尺寸更大。这种差别归因于在PPP样品的情况下纤维蛋白凝块的低回缩。但是，这种回缩是通过存在于PRP样品内的血小板细胞来保证的。

实施例3.从成分血样品：血清样品中捕获金黄色葡萄球菌(SA)细菌。500μl的柠檬酸盐化的血清样品被添加有100CFU的SA细菌且使用如用于实施例1的相同的方案来处理。在这种情况下，由于在血清样品中缺乏纤维蛋白原，将不形成凝块/小球。通过将1.25mg的人纤维蛋白原添加到血清样品中，将能够形成纤维蛋白凝块且因此将SA细菌从血清样品中分离出来。

实施例4.从全血中捕获革兰氏阳性细菌和真菌。来自添加有100CFU的微生物的4ml全血的回收率：

实施例5.从组合样品中特异性捕获细菌。1ml的组合PBS样品被添加有金黄色葡萄球菌(SA)(1000CFU/ml)或弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter Freundi)(18000CFU/ml)，样品内具有不同浓度的纤维蛋白原：

通过减小纤维蛋白原浓度，将减小小球尺寸(即浓缩率)且同时减小纤维蛋白网孔隙率大小。在这样的条件下，SA捕获率仍是非常有效的，同时将可观地减小弗氏柠檬酸杆菌捕获率。捕获效率的这种差异归因于以下事实：SA细菌具有与纤维蛋白原的强的天然的亲和力(通过其CIfA表面蛋白)，而弗氏柠檬酸杆菌缺乏这样的亲和力。

实施例6.从组合样品中特异性捕获细菌。与用于实施例5的条件相同，将弗氏柠檬酸杆菌用于作为样品的1ml组合PBS中，改变为我们另外向样品中添加了标记有葡萄球菌CIfA蛋白的针对革兰氏阴性脂质-A表面蛋白的抗体。在这种条件下且如图3(b)所示的，抗体将结合弗氏柠檬酸杆菌，允许其有效地结合到纤维蛋白原上，且之后允许其在纤维蛋白小球内有效分离(接近100％收率)。

本领域的技术人员将理解，刚刚所描述的优选的实施方式的各种改变和修改可以被配置，而没有脱离本发明的范围和精神。因此，将理解，在所附权利要求的范围内，本发明可以不同于如本文所特别描述的来实践。

Claims (10)

1.一种用于处理含纤维蛋白原的液体样品以从所述样品中分离和浓缩目标分子或颗粒的方法，包括：

a.通过使所述样品经历凝血酶或凝血酶样酶以至少部分地使包含在所述样品中的所述纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成纤维蛋白网，将所述目标分子或颗粒捕获在所述纤维蛋白网中，

b.回缩所述纤维蛋白网，以形成纤维蛋白凝块，

c.从周围的样品介质中分离所述纤维蛋白凝块。

2.一种用于从液体样品中分离且浓缩目标分子或颗粒的样品收集装置，包括：(i)识别所述装置将被用于的样品类型和待分离的所述目标的编码；(ii)用于容纳所述样品的容器；及(iii)在所述容器中的含纤维蛋白原的样品，均被布置成在所述样品暴露于所述装置内的凝血酶或凝血酶样酶时，形成以可分离的方式捕获所述目标分子或颗粒的纤维蛋白凝块。

3.根据权利要求2所述的装置，其中所述样品容器的体积在0.1到20ml之间。

4.根据权利要求2所述的装置，其中所述样品内的纤维蛋白原的浓度在0.1到10mg/ml之间。

5.根据权利要求2所述的装置，其中所述纤维蛋白原源自所述样品。

6.根据权利要求2所述的装置，其中所述纤维蛋白原被初始包含在所述装置内。

7.根据权利要求2所述的装置，其中所述凝血酶或凝血酶被初始包含在所述装置内。

8.根据权利要求2所述的装置，其中所述凝血酶或凝血酶在所述样品收集后被添加到所述装置中。

9.根据权利要求2所述的装置，所述装置还包括选自钙、螯合剂；活化血小板细胞或活化血小板细胞溶解产物及因子XIII的组的添加剂。

10.根据权利要求2所述的装置，所述装置还包括具有以下的分子：(I)纤维蛋白/纤维蛋白原结合部分及(II)针对所述目标分子或颗粒的捕获物质的部分。