TWI586807B

TWI586807B - 偵測檢體內金黃色葡萄球菌的方法

Info

Publication number: TWI586807B
Application number: TW102142418A
Authority: TW
Inventors: 楊泮池; 張翼中
Original assignee: 中央研究院; 國立臺灣大學
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2017-06-11
Also published as: TW201520337A

Description

偵測檢體內金黃色葡萄球菌的方法

本發明是有關於一種用以偵測檢體內病原菌的方法，且特別是一種用以偵測金黃色葡萄球菌的方法。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為一革蘭氏陽性之兼性厭氧菌，其為人體常見的病原菌，約30%-50%成人曾感染此菌。臨床上金黃色葡萄球菌是造成肺炎及外傷感染的主因之一，此外，此菌亦可能造成皮膚感染、食物中毒、心臟內膜炎、甚至敗血性休克等疾病。近來隨著感染的病例增加以及抗生素的濫用，具有抗藥性的金黃色葡萄球菌，例如抗二甲氧基苯青黴素金黃葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)，病例通報數正逐年上升。MRSA為院內感染的主要病原菌，最常感染於加護病房內的病患，易引發細菌性肺炎，嚴重時會導致敗血症的發生，根據一篇報導指出，在台灣此菌直接或間接導致20%-50病患死亡。因此，金黃色葡萄球菌的偵測與治療已是當下重要的議題。

傳統的細菌偵測方式，需仰賴細菌培養及鑑定，但細菌生長所需的時間冗長，步驟繁複，沒有辦法滿足現在高效率及快速微生物偵測之需求。近來隨著分子生物學技術的蓬勃發展，已有聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)來放大細菌16S rRNA片段並配合定序等後續分析方法來鑑定菌種，但這兩個方法都需要專業的技術及昂貴的儀器，並不適合於一般醫院檢驗部門操作。另外也有研究提到利用核酸放大的方法先將目標細菌體中特有的核酸序列增殖，之後再進行鑑定，這個方法雖然比16S rRNA的方法更精準但在專一性引子的設計上並不容易。

因此，此領域亟須一種快速、成本低且兼顧高敏感度及專一性的偵測方式來偵測金黃色葡萄球菌。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容係提出一種新穎的病原菌偵測方法，用來偵測檢體中的金黃色葡萄球菌，此偵測方法具有高敏感性及專一性。

本揭示內容一態樣為一種偵測一檢體內金黃色葡萄球菌的方法，包含：(a)在一第一磁性粒子表面上連接複數個第一適體(aptamer)，以製備出一第一粒子；(b)在一第一奈米金粒子表面上連接複數個第二適體，以製備出一第二粒子；(c)在一第二奈米金粒子表面上連接複數個配體(adaptor)，以製備出一第三粒子；(d)混合所述第一粒子、第二粒子與該檢體，使所述第一粒子與第二粒子可分別與該檢體內的金黃色葡萄球菌結合；(e)以一磁力將步驟(d)中與該第一粒子或第二粒子結合的金黃色葡萄球菌彼此分開；(f)以一第一洗提液將步驟(e)中與所述第二粒子結合之金黃色葡萄球菌上第二粒子表面的該些第二適體洗出；(g)混合一第二磁性粒子、步驟(c)之第三粒子與步驟(f)中被洗出的該些第二適體，其中每一該些第二適體的一端可結合在該第二磁性粒子表面，另一端則可與該第三粒子上的該些配體結合； (h)以一第二洗提液將與每一該些第二適體結合之該些第三粒子洗出；以及(i)測定該些第三粒子的含量；其中相對於該第一適體，該第二適體對該金黃色葡萄球菌的結合力較高。

依據本揭示內容一實施方式，所述第一粒子的表面上覆有一環氧樹脂層。

依據本揭示內容一實施方式，其中所述第一適體為SA17；且所述第二適體為SA61，且其一端連接有一生物素。再者，所述步驟(g)之第二磁性粒子表面上連接有多個鏈黴素(streptavidin)，其可分別與每一該些第二適體上的該些生物素相接。

在一具體實施方式中，本偵測方法步驟(d)是在0℃的溫度下進行。

依據本揭示內容一實施方式，所述步驟(f)之第一洗提液為水。依據另一實施方式，所述步驟(h)之第二洗提液為一鹼性溶液。具體而言，所述鹼性溶液可以是氫氧化鈉溶液。

在一實施方式中，本揭示內容之步驟(i)係利用二極體雷射光束照射步驟(h)中該洗出液內的該些第三粒子，並測量其共振散射光強度。

依據本揭示內容一實施方式，本偵測方法可偵測到該檢體內約10個金黃色葡萄球菌。在一較佳實施方式中，本偵測方法可偵測到檢體內約1個金黃色葡萄球菌。

在可任選的實施方式中，所述檢體為一種生物檢體或環境檢體。

本發明之另一態樣為一種偵測一檢體內金黃色葡萄球菌的方法，包含：(a)在一第一磁性粒子表面上連接複數個第一適體，以製備出一第一粒子；(b)在一第一奈米金粒子表面上連接複數個第二適體，以製備出一第二粒子；(c)混合該第一粒子、該第二粒子與該檢體，其中該第一粒子與該第二粒子可分別與該檢體內的金黃色葡萄球菌結合；(d)以一磁力將該與第一粒子或第二粒子結合的金黃色葡萄球菌分開；(e)以一第一洗提液將步驟(d)中該與第二粒子結合之金黃色葡萄球菌上的該第二粒子洗出；(f)混合一第二磁性粒子與步驟(e)中被洗出的該些第二粒子，其中每一該些第二適體一端可結合在該第二磁性粒子表面； (g)以一第二洗提液將與每一該些第二適體結合之該些第一奈米金粒子洗出；以及(h)測定該些第一奈米金粒子的含量；其中相對於該第一適體，該第二適體對金黃色葡萄球菌的結合力較高。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

120‧‧‧第一粒子

122‧‧‧第一磁性粒子

124‧‧‧第一適體

140‧‧‧第二粒子

142‧‧‧第一奈米金粒子

144‧‧‧第二適體

160‧‧‧第三粒子

162‧‧‧第二奈米金粒子

164‧‧‧配體

180‧‧‧第二磁性粒子

B‧‧‧金黃色葡萄球菌

C‧‧‧複合物

R‧‧‧二極體雷射光束

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為依據本發明一實施方式之偵測金黃色葡萄球菌方法的示意圖；第2圖為本發明之適體(SA17、SA61)與不同菌種反應的免疫螢光分析的結果；第3a圖為依據本發明一實施方式，以60nm和100nm的SA17-奈米金粒子與金黃色葡萄球菌培養，在電子掃描顯微鏡下拍攝的影像；第3b圖為依據本發明一實施方式，以60nm的SA17-奈米金粒子與大腸桿菌和表皮葡萄球菌培養，在電子掃描顯微鏡下拍攝的影像；第4圖為依據本發明一實施方式，以本發明之SA17-奈米金粒子和SA61-奈米金粒子直接偵測檢體內金黃色葡萄球菌的結果；第5圖為依據本發明一實施方式，以本發明之磁珠放大偵測法，偵測金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的結果；第6a圖為依據本發明一實施方式，以本發明偵測法偵測單一金黃色葡萄球菌細胞的結果；以及第6b圖為第6a圖所示之結果與培養皿計數的結果比較圖。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發明實施態樣與具體實施例提出說明性的文字敘述；但這些實施態樣或具體實施例並非實施或運用本發明具體實施例的唯一方式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法、步驟與順序。然而，亦可利用其他具體實施例，來達成與所揭示具體實施例相同或均等的功能與步驟或順序。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。「約」一詞在本文中代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值或參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值或參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法後所得到的數值。

「檢體」一詞，在此係指從生物體或環境中所取得的樣本。所述生物體可為動物或人類。從生物體採樣的檢體，包含但不限於，血液、唾液、腦脊髓液、腹腔液、淋巴液、乳汁、痰、尿液、精液、組織滲出液或其他的類似物。環境採樣的檢體，包含但不限於，水、土壤、工業樣本和表面材質的採樣。

「適體(aptamer)」一詞，在此係指長度在10-100個核苷之單股核酸分子，其可以是DNA或RNA，一般係利用SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)方法，從寡核苷酸庫之大量隨機序列內鑑別出少量、具有獨特性質的核酸序列，其功能和抗體類似，對於特定目標物具有高專一性和親和力。適用於本發明方法的適體可為SA17或SA61。

「配體(adaptor)」，在此係指一小片段長度約5-30個核苷的人工合成核酸序列，可用以連結其他互補的核酸分子末端。在研究中，常以配體來連結二種核酸分子。舉例來說，先在甲分子上連接配體序列，乙分子的末端連接有該配體序列的互補序列，使得甲和乙分子可藉由配體而相互連結。在本發明一具體實施方式中，該配體分子乃是一段長度約20個腺嘌呤的人工合成核酸序列。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞均涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞亦涵蓋該名詞的單數型態。

一般來說，在臨床醫學檢驗的領域，鑑別病原菌的過程，從檢體的採集、培養到鑑定至少需要兩天，無法即時提供檢驗結果。因此，本發明提出一種新穎的病原菌偵測方法，利用創新的適體、光電及奈米技術發展一個可以快速偵測金黃色葡萄球菌的系統。

本發明提供一種用以偵測檢體內金黃色葡萄球菌的方法。具體而言，本發明之偵測方法係選用對於金黃色葡萄球菌具有高度專一性的適體，分別為SA17和SA61，據此，本發明是組合此二適體後所提供的一種新穎、高敏感度、高專一性的金黃色葡萄球菌偵測方法。

第1圖繪示出依據本發明方法來偵測一待測檢體中金黃色葡萄球菌的操作示意圖。

首先，分別製備出一第一、第二及第三粒子(120,140,160)。

第一粒子120是藉由在一第一磁性粒子122表面上連接複數個第一適體124而製成。第二粒子140是藉由在一第一奈米金粒子142表面上連接複數個第二適體144而製成。第三粒子160則是係由在一第二奈米金粒子162表面上連接複數個配體164而製成。適合的磁性粒子可以是一般商品化的磁珠粒子，例如Invitrogen公司所販售的M270磁粒，其外層塗覆有一層環氧樹脂層，依據製造商所提供的操作指示，將多個第一適體124連接在M270磁粒的環氧樹脂層表面上。適合的奈米金粒子可以是一般商品化的納米金粒子，且大小約為15nm至200nm，例如BBinternational所販售GNP，依據製造商所提供的操作指示或本發明實施例所揭示步驟，將多個第二適體144或多個配體164分別連接在奈米金粒子(142,162)表面上，而製成第二或第三粒子(140,160)。舉體而言，所述奈米金粒子的大小約為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200nm；較佳約為，20nm至150nm，例如約20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150nm；更佳約為30-100nm，例如約30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100nm。

需注意的是，在本發明中，需選擇與金黃色葡萄球菌親和力較高的適體與奈米金粒子結合，並讓與金黃色葡萄球菌親和力較低的適體與第一磁性粒子結合。因此，在本發明一較佳實施方式中，所述第一適體為SA17；第二適體則為SA61，且其一端連有生物素。至於配體164，則選用長度20個的腺嘌呤(A)。

接著，混合上述第一粒子120、第二粒子140與待測檢體(未示於第1圖中)，使第一粒子120與第二粒子140可分別與檢體內的金黃色葡萄球菌B結合。在一特定實施方式中，該檢體為一種生物檢體，包含但不限於，血液、唾液、腦脊髓液、腹腔液、淋巴液、乳汁、痰、尿液、精液、組織滲出液。

接著，可施加一磁場(如，一磁鐵)將與第一粒子120或第二粒子140結合的金黃色葡萄球菌B彼此分開，並去除未結合的第一粒子120和第二粒子140。接著，以一第一洗提液將上述與第二粒子140結合之金黃色葡萄球菌B上第二粒子140表面的該些第二適體144洗出。所述第一洗提液可以是95℃的水。

接下來，將一第二磁性粒子180、上述第三粒子與前一步驟中被洗出的該些第二適體144混合，其中每一第二適體144一端可結合在第二磁性粒子180表面，另一端則可與該第三粒子160上的該些配體164結合，以形成一複合物C。可選用前述第一磁性粒子122當作第二磁性粒子180來使用，但不同的是此步驟中第二磁性粒子180外表面額外連接有多個鏈黴素，用以和第二適體144上的生物素相接，以便放大後續的偵測訊號。

類似的，可再次施加磁場(如，磁鐵)將由第二磁性粒子180、第二適體144及第三粒子160共同組成的複合物C與未結合的第二磁性粒子180或第三粒子160彼此分開。

接著，以一第二洗提液將上述步驟中與每一第二適體144結合之第三粒子160洗出。適合的第二洗提液可以是一種鹼性溶液，例如，0.1M氫氧化鈉。

最後，以二極體雷射光束R照射其前一步驟中所收集到的洗液內的第三粒子160，藉由測量該些第三粒子160產生的共振散射光強度來決定其含量。所測得的該些第三粒子160含量即可反應出檢體內金黃色葡萄球菌的數量。

在一較佳實施方式中，本發明偵測方法的最低有效檢體偵測量，可偵測到僅含約10個金黃色葡萄球菌的檢體；更佳為，僅含有1個金黃色葡萄球菌的檢體。此外，本發明所提供的偵測方法，可在1.5小時內完成檢體內單一金黃色葡萄球菌細胞的偵測。

本發明方法還可加以改良，利用對其他病原菌具有親和力的不同適體和配體的組合，來迅速、有效地偵測其他病原菌。

下文舉出多種實施例來闡明本發明之部分態樣，以使本發明所屬技術領域中具有通常知識者能藉以實踐本發明。因此不應將這些實施例視為對本發明範圍之限制。本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於此處提的說明，當可在不需過度推衍的情形下運用本發明。此處提及的所有文獻，皆視為已完全引用而成為本說明書的一部份。

實驗例

材料與方法

菌種培養

以下實驗例所使用的菌種皆購自新竹食品工業研究所生物資源保存及研究中心(FIRDI,Hsinchu,Taiwan)。菌種分別為：枯草桿菌(B.subtilis)(ATCC：21336)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)(ATCC：8090)、大腸桿菌(E.coli)(ATCC：43896)、克雷伯氏肺炎桿菌(K.pneumonia)(ATCC：13883)、李斯特單胞菌(L.monocytogenes)(ATCC：19112)、和卡它菌(M.catarrhalis)(ATCC：25238)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)(ATCC：27853)、沙門氏菌(S.enteric)(ATCC：13314)、痢疾桿菌(S.boydii)(ATCC：8700)、福氏志賀氏菌(S.flexneri)(ATCC：29903)、6株金黃色葡萄球菌 (S.aureus)(ATCC：6538DR,6538P,12600,25923,29213,6538)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)(ATCC：155)、溶血性鏈球菌(S.haemolyticus)(ATCC：29970)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)(ATCC：15305)、牛鏈球菌(S.bovis)(ATCC：43077)以及肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)(ATCC：6301)。

葡萄球菌屬的細菌係由牛腦心萃取物培養液(Brain-Heart infusion broth)(購自Oxoid,Basingstoke,England)培養；枯草桿菌係由LB培養液培養(購自Difco,Detroit,MI,USA)；其他菌種係由營養培養液(nutrient broth)(購自Difco,MI,USA)。

金黃色葡萄球菌濃度之計算，係以培養皿計數法。首先，連續稀釋菌液，再塗抹於培養皿上，計算培養皿上菌落形成單位的數目(colony forming units,CFUs)。同時以OD₆₀₀測量各菌落形成單位的吸光值(一OD 600：1.0 1.5x10⁹ CFU/ml)。

製備奈米金粒子

製備配體-奈米金粒子

金膠體溶液(gold colloid solution)以100mM K₂CO₃調整pH值至8.5-9.1之間，再與硫標的配體(thio-labeled adaptor)序列(A₂₀)混合，25℃隔夜培養。配體序列加入10mM三(2-羧乙基)膦(TECP)預活化。配體結合到奈米金粒子後，加入氯化鈉(NaCl)將溶液最終濃度調整為200mM。將配體-奈米金粒子與安定緩衝液(含20mM Tris-氯化氫(Tris-HCl)(pH 8.5)、1%胎牛血清蛋白(bovine serum albumen,BSA)、5mM氯化鉀(KCl)、1mM氯化鈣(CaCl₂)、2mM氯化鎂(MgCl₂)和150mM氯化鈉)混合並離心，重複清洗六次，儲存於4℃備用。

製備適體-奈米金粒子

取10μM適體序列(SA17、SA61)(含poly-T linker)與1ml適體奈米金粒子(10¹⁰)混合，利用PCR機器將該混合物加熱至65℃五分鐘，再以每40秒降2℃的降溫速度從65℃降至4℃，將混合物置放於4℃隔夜培養。結合適體的配體-奈米金粒子，同上述步驟以安定緩衝液清洗六次，得到適體-奈米金粒子，儲存於4℃備用。

實施例1 本發明適體(SA 17和SA61)可專一性地辨識金黃色葡萄球菌

混合250nM FAM螢光染劑標記的SA適體(SA17、SA61)與100μl細菌懸浮液(OD₆₀₀吸光值1.0)，冰上培養30分鐘；接著以SELEX緩衝液(含1% of BSA 和0.02% of Tween-20)去除未結合的適體，重複清洗數次。接著，加熱洗出結合在細菌細胞上的適體，以避免細菌細胞自體螢光的干擾，最後以SpectraMax Plus螢光微盤記錄器(Molecular Devices,Union City,CA,USA)分析，結果如第2圖所示。

第2圖為SA17和SA61定量免疫螢光分析之結果，由圖面結果顯示，其中除了SA61在綠膿桿菌和表皮葡萄球菌中具有微量螢光訊號外(呈紅色)，SA17和SA61對於金黃色葡萄球菌以外的其他菌種無交叉反應。此外，SA17和SA61在不同株的金黃色葡萄球菌中，皆會產生顯著的螢光訊號。由此可知，本發明適體對於金黃色葡萄球菌具有高度專一性。

實施例2 本發明SA17-奈米金粒子可專一性地辨識金黃色葡萄球菌

分別將60-奈米適體-奈米金粒子(10⁸個)或100-奈米適體-奈米金粒子(10⁷個)與細菌檢體混合，置於4℃培養，30分鐘。以0.45-微米過濾管柱((Millipore,Billerica,MA,USA)過濾混合液，接著將過濾後的混合液噴灑在蓋玻片(其上塗佈了聚-L-離胺酸)上，使細菌黏附(10分鐘，4℃)。接著，以1%甲醛和2%戊二醛固定，置放於室溫，2小時；再以2%四氧化鋨(osmium tetroxide)固定1小時；固定後的檢體先以乙醇脫水，再進行臨界點乾燥，塗佈金-鈀合金；最後，以Jeol JSM T330A掃瞄式電子顯微鏡觀察(15kV加速度)，結果參見第3圖。

第3a和3b圖為掃瞄式電子顯微鏡下所拍攝的影像，在放大倍率50,000下觀察。圖面顯示60nm或100nm適體-奈米金粒子可專一性的結合在金黃色葡萄球菌的表面(參見第3a圖)；相對地，未有任何適體-奈米金粒子和大腸桿菌以及表皮葡萄球菌結合(參見第3b圖)。

實施例3 以SA17-奈米金粒子和SA61-奈米金粒子直接偵測金黃色葡萄球菌

將10⁸個適體-奈米金粒子(SA17-或SA61-奈米金粒子)加入至25μl SELEX緩衝液(含40mM HEPES緩衝液，pH 8.0、5mM氯化鉀、1mM氯化鈣、2mM氯化鎂以及150mM氯化鈉)與細菌檢體混合，利用0.45μm過濾管柱((Millipore,Billerica,MA,USA)洗去未結合的適體-奈米金粒子後，再以0.1M氫氧化鈉洗滌出結合在金黃色葡萄球菌表面的適體-奈米金粒子，最後以光散射偵測系統測量，結果參見第4圖。

由圖面可知，SA17-和SA61-奈米金粒子與金黃色葡萄球菌的結合力顯著，且訊號強度隨著細胞濃度增加而上升。此外，SA61-奈米金粒子結合至金黃色葡萄球菌的訊號強度，優於SA17-奈米金粒子。相反地，SA17-和SA61-奈米金粒子在表皮葡萄球菌組中，無訊號產生。因此，此實驗證實本發明之SA17-或SA61-奈米金粒子可專一性的結合至金黃色葡萄球菌，且具有高度結合力。

實施例4 以磁珠放大偵測法(Bead-amplification method)偵測金黃色葡萄球菌

以pH9.0硼酸鹽緩衝液混合1μmole氨-標記(amine-labeled)SA17適體和M270環氧磁珠(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)(10⁸)，培養48小時；再以1%BSA阻斷，將塗佈有SA17之M270磁珠加入至安定緩衝液中，儲存於4℃備用。

混合生物素-SA61-奈米金粒子(10⁸)、SA17-M270(10⁷)與細菌檢體，將混合物置於冰上，培養30分鐘。以磁鐵將與生物素-SA61-奈米金粒子或SA17-M270結合的金黃色葡萄球菌分開；再以95℃蒸餾水洗出結合在金黃色葡萄球菌上的生物素-SA61-奈米金粒子中的生物素-SA61適體。

另外，以雜交緩衝液(20mM Tris-氯化氫pH 9.0、1%胎牛血清蛋白、100mM氯化鈉)阻斷帶有鏈黴素的磁珠(Streptavidin-Magnetic beads,SA-M)(Chemogen)，置放於37℃，1小時。

將SA-M、配體-奈米金粒子(10⁸個)和洗出的生物素-SA61適體，培養於37℃，30分鐘。以0.1M氫氧化鈉將與每一生物素-SA61適體結合之配體-奈米金粒子洗出；最後，以光散射偵測系統分析，結果參見第5圖。

由結果可知，檢體含金黃色葡萄球菌的訊號遠高於含表皮葡萄球菌的檢體。具體而言，在含金黃色葡萄球細胞濃度約10²的檢體中，以本方法偵測得到的訊號強度為約160mV，而含表皮葡萄球菌組的檢體，其偵測訊號為零。相較於一般直接以適體-奈米金粒子直接偵測的結果(參見第4圖)，在含有相近濃度的金黃色葡萄球菌檢體下，以磁珠放大偵測法所偵測得到的訊號提升數十倍以上。此外，本實驗例約在1.5小時內，快速完成檢體內單一金黃色葡萄球菌細胞之偵測。

因此，證實以本發明之磁珠放大法偵測檢體內的金黃色葡萄球菌，不僅具有高度專一性，更具有高度的偵測靈敏度，且能快速偵測檢體內的病原菌。

實施例5 本發明偵測法可偵測單一金黃色葡萄球菌細胞

將金黃色葡萄球菌接種於BHI培養液，培養於37℃。當培養液濃度達到OD₆₀₀吸光值0.5-0.8時，收集細菌細胞。以SELEX緩衝液(含2% PEG 2000和0.02% Tween-20)懸浮和沖洗細菌細胞，重複步驟2次，以減少細菌細胞聚集。再次以SELEX緩衝液懸浮細菌細胞，並將細胞濃度調整至OD₆₀₀吸光值1.0。以培養皿計數測量1 OD₆₀₀的細胞密度。

以連續稀釋將細胞懸浮液濃度稀釋至1細胞/μl。以培養皿計數測量稀釋後的細胞懸浮液，結果顯示10μl細胞懸浮液中，約含10個細菌細胞，並同時進行磁珠放大偵測法的分析。

在本實施例方法中，將10μl稀釋的細胞懸浮液再稀釋至300μl，並平分至30個孔中。每一個孔再以磁珠放大偵測法測定是否含有金黃色葡萄球菌。記錄呈陽性的孔洞，並將呈陽性的孔洞視為含有一細菌細胞，結果如第6a圖所示。

本實施例共進行四次個別獨立的分析，在第6a圖中，標示星號的為呈陽性的孔洞，圖面右側三組為陰性對照組。在四個個別獨立的分析中，呈陽性的孔洞分別為12、19、8和18。

同時比較磁珠放大偵測法和培養皿細胞計數細胞數目，四次試驗分別為培養皿細胞計數：磁珠放大法的細胞數目：11：12、16：19、11：8和16：18。此二組細胞數目的平均值，如第6b圖所示，磁珠放大法所偵測到的細胞數目為14.3，而培養皿計數的細胞數目為13.5。R值為0.89，具有關聯性。此一結果證實，本發明之偵測方法具有高靈敏度，可偵測單一金黃色葡萄球菌的細菌細胞。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。