CN101892255B - 由启动子调控两种目的基因表达的重组载体 - Google Patents

Abstract

本发明为由启动子调控两种目的基因表达的重组载体，提高重组载体对肿瘤细胞的钉伤功能。构建方法如下所述：①提取Survivin启动子基因，②提取人的细胞基因mRNA，反转录为cDNA，③在cDNA中扩增第一目的基因，④在cDNA中扩增第二目的基因，⑤将内切酶切开的Survivin启动子基因片断与基本载体分子用连接酶连接成第一中间载体，将内切酶切开的第一目的基因片断与第一中间载体分子用连接酶连接成第二中间载体，将内切酶切开的第二目的基因片断与第二中间载体分子用连接酶连接成第三中间载体，将用内切酶切开的IRES基因片断和第三中间载体用连接酶连接成重组载体，⑥将重组载体转染受体细胞，培养转染后的细胞，使重组载体分子随受体细胞扩增，筛选出含有重组载体分子的受体细胞。提取重组载体，检测其杀伤肿瘤细胞的能力。

Description

由启动子调控两种目的基因表达的重组载体

技术领域：

本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种选择性地在肿瘤细胞内增殖、而在正常细胞内基本不增殖、并在肿瘤细胞高效表达抗癌基因的基因序列，及其构建的方法。以及这类基因序列对肿瘤的杀伤作用。

背景技术：

恶性肿瘤是严重危及生物体生命健康的疾病，目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗。但常规治疗对大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对于大多数化疗药物而言，其治疗剂量与毒性剂量较为接近，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也造成损害，对机体具有较大毒性，包括危及生命的骨髓抑制、肝肾功能受损等。特异性因此，研究选择性杀伤肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要。

人体免疫系统在应对肿瘤过程中发挥重要作用。杀伤性T细胞(CTL)对肿瘤的生长起着重要的抑制作用，已有研究在临床中应用CTL细胞抑制肿瘤细胞增殖。很多免疫治疗研究也着眼于活化的T细胞的相应作用。目前研究表明，颗粒酶是CTL细胞杀伤肿瘤细胞的重要手段。

颗粒酶是人体免疫细胞的分泌的细胞因子，在肿瘤免疫过程中发挥重要作用。现已发现颗粒酶A、B、H、G、M、K等多个成员。其中颗粒酶B发挥重要作用。颗粒酶B合成后，以酶原形式储存在细胞中，当杀伤性T细胞识别靶细胞时，颗粒酶B被切除N端大小为20个氨基酸的酸性二肽，成为活性形式。活性型颗粒酶B进入细胞后，可切割procaspase-8(caspase-8原蛋白)，传导凋亡信号；通过水解Bc1-2家族成员Bid，促进线粒体的细胞色素C释放，激活下游凋亡途径，导致细胞凋亡；可直接切割procaspase-3(caspase-3原蛋白)，生成Caspase-3，作用于CAD(caspase activated DNAse)/ICAD(the inhibitor ofcaspase-activated DNAse)，产生有活性的CAD，最终导致DNA片断化(GOPNG I S，BARRYM，LISTON P，et al.Granzyme B-induced apoptosi s requires both direct caspaseactivation and relief of caspase inhibition[J].Immunity，2003，18(3)：355-365.)。颗粒酶B也可直接激活ICAD及CAD，并启动不依赖于caspase的核凋亡(SHAR IF-ASKAR IE，ALAM A，RH EAUME E，et al.Direct cleavage of the human DNA fragmentation factor-45by granzyme B induces caspase-activated DNase release and DNA fragmentation[J].EMBOJ，2001，20(12)：3101-3113.)。

Caspase家族是一类在进化上非常保守的蛋白酶类分子。刚合成的Caspases是无活性的酶原形式，包括氨基端的prodomain结构和一个蛋白酶区域。Caspase的活化包括各结构域间的蛋白酶解体，大小压机形成有活性的的异二聚体，最后两个异二聚体连接形成四聚体。大小两个亚基对于酶的活性均是必需的。利用Caspase的抑制物已经将一些活化Caspase分子的三维结构研究的比较清楚。如Caspase-8，Caspase-3等。这些研究显示，活化Caspase为四聚体，两个小亚基相邻排列，两个大亚基围绕在小亚基的周围；每一大小亚基形成一球状分子，球状分子的核心为6个d螺旋环绕的6个β片层样结构。两个异二聚体以小亚基相连。每一活化Caspase分子含有两个酶活性中心，这两个活性中心可能独立发挥作用。Caspase活性中心有保守的五肽序列，即Gln-Ala-Cys-x-Gly。结构研究还显示，在Caspase前体到活化Caspase的过程中，大亚基的羧基端和小亚基的氨基端顺势相邻有利于形成正确的酶活性中心(Nicholson DW，et al，Identification and inhibition of the ICE/CED3protease necessary for mammalian apoptosis.Nature 376：37-43，1995.Thornberry NA，et al，A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukinl betaprocessing in monocyte.Nature 356：768-774，1992)。Caspase-3是一个主要的凋亡效应因子。颗粒酶能切割Caspase-3原蛋白，产生一个具有部分酶活性的中间体，该中间体与成熟酶在结构上很相似，然后，中间体进行自我切割，切去prodomain结构，形成活化的Caspase-3，发挥促凋亡作用。

凋亡是程序性细胞死亡的一种形态，是机体在生理或病理条件下，启动自身内部机制，导致细胞死亡的过程。细胞凋亡具有特征性的形态学变化，早期表现为胞浆空泡，染色质浓缩，随后胞浆空泡与细胞膜融合，与细胞分离，引起水分丢失，细胞皱缩。细胞核也出现核固缩、核碎裂、核溶解的过程。最后形成凋亡小体。凋亡细胞脱离组织，被巨噬细胞吞噬，较少产生炎症反应。因此，诱导细胞凋亡为肿瘤治疗提供除化学治疗和放射治疗外的新途径。但在此过程中需要新的方法，特异性诱导肿瘤细胞凋亡，减少对正常细胞的损害。

目前肿瘤基因治疗的主要障碍是不能有效地将目的基因特异性转染所有的肿瘤细胞，并使其在肿瘤细胞中表达。而基因治疗的疗效与肿瘤细胞受基因转染的数量密切相关。因此，研究与发展促使目的基因在肿瘤细胞中表达在肿瘤治疗中至关重要。促使目的基因在肿瘤细胞内特异性地表达并杀伤肿瘤细胞，不仅能提高治疗的效果，也能减少正常细胞受到的伤害。启动子的研究和使用，为此提供了重要方法学基础。启动子是基因的一个组成部分，控制目的基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，决定基因的活动。启动子由核苷酸组成，其本身并不控制基因活动，而是通过与转录因子的结合而控制基因活动。有研究表明，CEA启动子可启动双自杀基因CD和TK在CEA阳性的肿瘤细胞中表达(王天宝，董文广，汪建平，CEA启动子特异性启动双自杀基因CD与TK在CEA+恶性肿瘤中表达中华普通外科学文献(电子版)2008，2(1)：24-27)。人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子可驱动野生型p53基因在人端粒酶阳性人大肠癌细胞株SW620中表达(黄明文，余新，洪葵等，hTERT启动子调控p53基因表达逆转录病毒的抗肿瘤作用中国临床医学，2008，15(3)：429-432)。

存活素(Survivin)是凋亡蛋白抑制家族(inhibitor of apoptosis protein，IAP)成员，可抑制由Caspase介导的细胞凋亡。IAP家族在鸡、大鼠、人体内均能检测到，现已发现HIAP1，HIAP2，XIAP(X-chromosome linked IAP)，NAIP(neuronal apoptosisinhibiting protein)和Survivin等成员。现有研究表明，人Survivin基因位于17q25，全长16.5kD，在细胞核、胞浆内均可检测到。Survivin在70％的上皮细胞肿瘤中表达，并与疾病的进展、预后密切相关，而在正常组织中低表达或不表达。Survivin可抑制由于生长因子缺乏、紫外线照射、FasL等因素引起的细胞凋亡。

现有体内、体外研究表明，Survivin启动子在正常细胞组织中几乎完全沉默，使得Survivin在正常组织细胞中没有表达。在胶质瘤、肺癌、乳腺、胃癌、肝癌、卵巢癌及黑色素瘤等肿瘤中Survivin启动子都具有较强的调控能力，表明Survivin启动子是一个广谱的肿瘤特异性启动子，能促使基因在肿瘤细胞中特异性表达。Survivin启动子包括了CDE/CHR位点、E2F-like、TP53和Sp1结合位点。因而，探索研究Survivin启动子调控目的基因的构建方法，并将其用于肿瘤治疗，这正是本发明的目的所在。

启动子是基因(gene)的一个组成部分，是一段DNA序列，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动。启动子由核苷酸组成，其本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的蛋白质结合而控制基因活动的。启动子与转录因子结合后，可被RNA聚合酶识别，开始基因的转录。

基因是携带有遗传信息的DNA序列，由核苷酸组成。基因的表达分为转录和翻译两个相互独立但又紧密联系的阶段。真核生物的mRNA前体转录完成后，要经过5’端加帽的修饰过程，5’帽子结构除了能保护mRNA免遭核酸酶和磷酸酶的攻击外，在随后的翻译起始过程中核糖体小亚基通过识别5’端帽子结构来寻找蛋白质合成的起始位点，而后再与mRNA5’端结合并沿mRNA滑行至第一个AUG进行翻译。但目前研究发现，除了正常的翻译起始机制外，还存在一种不依赖5’帽子结构的翻译起始机制。这种5’非翻译区包含的顺式作用元件本身无启动子活性，但其却能引导mRNA直接进入核糖体开始不依赖于帽子结构的翻译。这种不依赖5’帽子结构的翻译，就是由IRES介导的翻译起始。IRES是5’非编码区的一段DNA序列，这些序列长度因物种不同而各异。具有与18S核糖体RNA的3’末端互补的序列，在上游启动子的控制下，两个基因及IRES序列同时转录成一条单链mRNA。但是，两个基因的翻译是独立的，可以翻译得到两个基因的产物。并且能使在IRES上下游的基因表达更严格地限定在具有Survivin启动子活性的细胞中。

发明内容：

本发明的目的是构建一个核苷酸序列，包括启动子、目的基因和IRES序列。启动子能控制目的基因的表达，使目的基因能在至少一种肿瘤细胞内表达。目的基因能通过翻译转录，得到产物，这种产物能杀伤肿瘤细胞，促使肿瘤细胞凋亡。本发明中的目的基因可人工合成或来自动物体内。本发明中，核苷酸序列内包含一IRES序列，此序列可使两种基因在一个启动子的作用下表达，翻译得到两种基因各自的产物，提高杀伤肿瘤的能力。

本发明是这样来实现的：

本发明由启动子调控两种目的基因表达的重组载体，其特征在于构建方法如下所述：

①提取survivin启动子基因，

②提取人的细胞基因mRNA，反转录为cDNA，

③在cDNA中扩增第一目的基因，

④在cDNA中扩增第二目的基因，

⑤将内切酶切开的Survivin启动子基因片断与基本载体分子用连接酶连接成第一中间载体，将内切酶切开的第一目的基因片断与第一中间载体分子用连接酶连接成第二中间载体，将内切酶切开的第二目的基因片断与第二中间载体分子用连接酶连接成第三中间载体，将用内切酶切开的IRES基因片断和第三中间载体用连接酶连接成重组载体，

⑥将重组载体引入受体细胞，转化或转染，培养转化细胞，使重组载体分子随受体细胞扩增，筛选出含有重组载体分子的受体细胞。

所述的第一目的基因为颗粒酶A或颗粒酶B或颗粒酶M或颗粒酶H或颗粒酶J或颗粒酶K或颗粒酶I或苷激酶，所述的第二目的基因为caspase2或caspase3或caspase6或caspase7或caspase9或caspase 10。

所述的第一目的基因为颗粒酶B，第二目的基因为Caspase3，构建方法如下：

(1)Survivin启动子基因提取

根据GeneBank数据库的Survivin基因启动子序列，合成Survivin基因启动子引物，上游引物：5’-CAGGTACCGCCATAGAACCA-3’，下划线处为Kpn I酶切位点，下游引物：5’-CGGAGCTCCCACCTCTGCCA-3’，下划线处为Sac I酶切位点，以HepG-2细胞基因组DNA为模板，PCR扩增Survivin启动子基因片段，

(2)细胞总mRNA提取

在37℃，5％CO₂的培养箱内培养人CD₈ ⁺细胞，提取细胞总mRNA，

(3)活性型颗粒酶B基因提取

用TAKARA公司的cDNA合成试剂盒将人CD₈ ⁺细胞的mRNA逆转录合成cDNA文库，取逆转录产物为模板，PCR扩增颗粒酶B基因序列，上游引物5’-GCAACGCGTGAGATCA TCG-3’，下划线处为Mlu I酶切位点，下游引物：5’-CGGCTAGCCTTAGTAGCGTTTC-3’，下划线处为Nhe I酶切位点，PCR产物用10％琼脂糖凝胶电泳，Qiaquick柱回收试剂盒回收活性型颗粒酶B基因片段，

(4)caspase-3基因片段提取

以人CD₈ ⁺细胞cDNA为模板，提取caspase-3基因，上游引物5’-GCCTCGAGGTATCCATGGAG-3’，下划线处为Xho I酶切位点，下游引物5’-CCGTAAGCTTTTCTTTAGTGATAA-3’，下划线处为HindIII酶切位点，PCR产物用10％琼脂糖凝胶电泳，Qiaquick柱回收试剂盒回收caspase-3基因片段，

(5)质粒制备

将Survivin启动子基因片段和PGL-3Basic质粒用Kpn I与Sac I双酶37℃消化3小时，琼脂糖凝胶电泳，回收片段，取消化后的Survivin启动子基因片段和PGL-3Basic质粒，以1∶3的比例，在16℃时，用T4DNA连接酶连接16小时，此质粒为PGL3-Sur-Luc，以相同方法用Mlu I与Nhe I双酶消化活性型颗粒酶B基因片段和PGL3-Sur-Luc，将活性型颗粒酶B基因片段连接到此质粒中，命名为PGL3-Sur-颗粒酶B-Luc，以相同方法用XhoI和HindIII双酶消化caspase-3基因片段和PGL3-Sur-颗粒酶B-Luc，将caspase-3基因片段连接到质粒中，构成PGL3-Sur-颗粒酶B-caspase-3-Luc质粒，将该质粒和pIRES-vector用Nhel和Xmal双酶切，用相同方法将IRES连接至该质粒中，构成PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒，

(6)质粒转化及提取将步骤5的最终连接产物转化大肠杆菌Jm109，Vitagene试剂盒抽提质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性质粒，获得的质粒即为所需重组质粒。

重组载体在治疗肝癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌的药物中的应用。

所述的药物由重组载体与抗肿瘤物质组成的药物，抗肿瘤物质为顺铂、紫杉醇、喜树碱中的一种或我种，药物直接应用于患部，或者通过静脉、肌肉、腹腔内或皮下注射，口服、使用饲管、血管内给予等导入到生物体中，作用于相应细胞组织，药物所含的重组载体和具有杭肿瘤物质同时给予；或者通过先给予一方，然后经过一定时间后给予另一方的方法导入生物体，重组载体或者是病毒载体，或者是非病毒载体或噬菌体。

重组载体包含的核苷酸可以是单链或双链的DNA/RNA或两者的混合物，Survivin启动子、颗粒酶B和caspase-3基因除序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID NO.6所示的碱基序列之外，还可以是与SEQID NO.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID NO.6的DNA互补的碱基序列DNA杂交、且编码具有颗粒酶B和Caspase-3的活性的蛋白质的碱基序列，上述碱基序列可如下获得：以分别含有SEQ ID NO.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID NO.6所示碱基序列的多核苷酸或其片段作为探针，通过集落杂交或噬菌斑杂交或DNA印迹杂交方法，由cDNA文库和基因组文库获得。

本发明提供一类能在肿瘤细胞中特异性表达抗癌基因的核苷酸序列其构建方法，即该核苷酸序列能选择性地在有能表达Survivin的肿瘤细胞内复制及表达，而在不能表达Survivin的正常细胞内基本不复制或基本不增殖，从而特异性抑制或杀灭肿瘤细胞。以及利用这种方法构建的核苷酸序列杀伤肿瘤细胞。基因转录的调节受反式作用因子(如转录因子)与顺式作用元件相互作用的影响，当缺乏或出现某些转录因子时会影响基因的转录水平。Survivin启动子在肿瘤细胞内特异性地与转录因子结合，从而使该启动子控制的基因产生转录。本发明应用Survivin启动子控制抗肿瘤基因，从而使抗肿瘤基因只能在表达Survivin的肿瘤细胞中表达，直接导致肿瘤细胞的凋亡，而不会诱导正常细胞发生凋亡。因此，将本发明构建的核苷酸序列转染到体外肿瘤细胞和体内肿瘤细胞内，可使颗粒酶B基因和caspase-3基因特异性表达，杀伤肿瘤细胞。这种核苷酸序列可通过多种途径导入肿瘤细胞，例如病毒载体、非病毒载体等。本发明采用肿瘤细胞特异性的反应元件是Survivin基因启动子。

本发明提出的能在肿瘤细胞中特异性表达抗癌基因的基因序列构建方法如下，提取肿瘤细胞DNA，通过聚合酶链式反应(PCR)技术克隆Survivin启动子序列，并设计特异性酶切位点，连接到质粒中。提取人CD₈ ⁺mRNA，反转录成cDNA，利用特异性上下游引物序列，通过PCR，提取目的基因(活性型颗粒酶B基因和caspase-3基因)的片段，连接至Survivin启动子的下游。将2条目的基因间的特异性酶切位点用IRES序列连接，形成特异性表达抗癌基因的基因序列。将该序列转录到载体中，用载体感染肿瘤细胞，使颗粒酶B基因和caspase-3基因在肿瘤细胞内表达，得到颗粒酶B蛋白和Caspase-3原蛋白。颗粒酶可激活不依赖caspase的凋亡信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，Caspase-3原蛋白可被颗粒酶或其他Caspase蛋白激活，诱导肿瘤细胞凋亡。

本发明与现有技术相比具有以下主要特点及效果：1、本发明的启动子具有在肿瘤细胞中靶向性表达活性型人颗粒酶基因和caspase-3基因的功能。2、本发明的质粒载体含有由肿瘤特异性Survivin启动子驱动表达活性型人颗粒酶基因和caspase-3基因。4、本发明利用IRES序列，使活性型人颗粒酶基因和caspase-3基因能在一个启动子的调控下表达，有较高的杀伤肿瘤细胞的能力。5、本发明的质粒载体将置于Survivin启动子控制之下，只有在表达Survivin蛋白的细胞环境中，才具有该启动子的激活因子，启动子才被激活，目的基因才开始复制及表达；而在正常的细胞中，不存在这样的激活因子，目的基因将不能复制表达，这样就造成了对肿瘤细胞的选择性杀伤，而不导致正常细胞的凋亡。

具体实施方式：

实施例1：

本发明采用由以下措施构成的技术方案来实现的。

本发明Survivin启动子调控人颗粒酶B基因和caspase-3前体基因的构建方法，包括以下工艺步骤：

(1)Survivin启动子扩增：设计引物，以HepG细胞的基因组DNA为模板，PCR扩增Survivin启动子片段；

(2)人颗粒酶B基因和caspase-3前体基因提取：提取人CD₈ ⁺T细胞mRNA，反转录为cDNA。合成引物，以人CD₈ ⁺T细胞cDNA为模板，PCR扩增活性型颗粒酶B基因和caspase-3基因；

(3)构建由Survivin启动子启动荧质粒：Kpn I与Sacl消化双酶切Survivin启动子和PGL3-Basic质粒，胶回收酶切片段，连接片段并转染JM109感受态细胞，挑选阳性克隆，命名为PGL3-Sur-Luc；

(4)构建含有Survivin启动子，活性型人颗粒酶B基因、人caspase-3基因和IRES序列的质粒载体；

(5)检测此质粒载体对肿瘤细胞的杀伤作用和对正常细胞生长的影响

Survivin启动子基因的提取

根据GeneBank数据库的Survivin基因启动子序列，合成Survivin基因启动子引物。上游引物：5’-CAGGTACCGCCATAGAACCA-3’，下划线处为Kpn I酶切位点。下游引物：5’-CGGAGCTCCCACCTCTGCCA-3’，下划线处为Sac I酶切位点。以1μgHepG-2细胞基因组DNA为模板，Pyrobest DNA聚合酶2.5U，10mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)10μl，10pmol/μl上下游引物各5μl，补水到100μl，扩增Survivin启动子基因片段。PCR仪循环参数：94℃4min，60℃1min，72℃90s，30个循环。72℃延伸8min。产物在10％琼脂糖凝胶中电泳，Qiaquick柱回收试剂盒回收PCR产物，得到Survivin启动子基因片段。

细胞总mRNA提取

在37℃，5％CO₂的培养箱内培养人CD₈ ⁺细胞，当细胞长满培养瓶底部后，倒出瓶内液体，加入磷酸盐缓冲液(PBS)2-3ml，冲洗2-3次，倒出PBS液。加TRIZOL试剂2ml。3-5min后将瓶内的细胞裂解液吸到经DEPC处理过的1.5ml EP管中，加新的氯仿0.2ml，轻摇15s。室温静置2-3min后，在冷冻离心机中，以4℃，12000转/分离心15min。然后取上清无色液体(约0.6ml)到EP管(DEPC处理过)，加0.5ml异丙醇，室温下静置10min。在冷冻离心机中，以4℃，12000转/分离心10min。弃去上层液体，保留沉淀，加入75％乙醇1.0ml后，在冷冻离心机中，以4℃，7500转/分离心5min。弃去上层液体，5-10min后加入DEPC处理后的纯净水20-30μl，混匀，在水浴锅内，55-60℃放置10min，溶解总RNA。用QIAGEN公司的mRNA提取试剂盒(Oligotex mRNA Mini Kit，Cat.no.：70022)提取细胞总mRNA。

活性型颗粒酶B基因提取

用TAKARA公司的cDNA合成试剂盒将人CD₈ ⁺细胞的mRNA逆转录合成cDNA文库。取逆转录产物2μl做为模板，PCR扩增颗粒酶B基因序列。上游引物5’-GCAACGCGTGAGATCA TCG-3’，下划线处为Mlu I酶切位点。下游引物：5’-CGGCTAGCCTTAGTAGCGTTTC-3’，下划线处为NheI酶切位点。10倍PfU酶缓冲液5μl，4倍dNTP200μl/L，上下游引物各1μmol/L，PfU DNA聚合酶3U，加水至50μl。PCR循环参数：94℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物用10％琼脂糖凝胶电泳，Qiaquick柱回收试剂盒回收活性型颗粒酶B基因片段。

caspase-3基因片段提取

以人CD₈ ⁺细胞cDNA为模板，提取caspase-3基因。上游引物5’-GCCTCGAGGTATCCATGGAG-3’，下划线处为Xho I酶切位点。下游引物5’-CCGTAAGCTTTTCTTTAGTGATAA-3’，下划线处为HindIII酶切位点。10倍PfU酶缓冲液5μl，4倍dNTP200μl/L，上下游引物各1μmol/L，PfU DNA聚合酶3U，加水至50μl。PCR循环参数：95℃40s，57℃30s，70℃1min，30个循环，70℃延伸10min。PCR产物用10％琼脂糖凝胶电泳，Qiaquick柱回收试剂盒回收caspase-3基因片段。

质粒制备

将Survivin启动子基因片段和PGL-3Basic质粒用Kpn I与Sac I双酶37℃消化3小时，琼脂糖凝胶电泳，回收片段，取消化后的Survivin启动子基因片段和PGL-3Basic质粒(美国promega公司)，以1∶3的比例，在16℃时，用T4DNA连接酶连接16小时，此质粒为PGL3-Sur-Luc。以相同方法用Mlu I与Nhe I双酶消化活性型颗粒酶B基因片段和PGL3-Sur-Luc，将活性型颗粒酶B基因片段连接到此质粒中，命名为PGL3-Sur-颗粒酶B-Luc。以相同方法用XhoI和HindIII双酶消化caspase-3基因片段和PGL3-Sur-颗粒酶B-Luc，将caspase-3基因片段连接到质粒中。构成PGL3-Sur-颗粒酶B-caspase-3-Luc质粒。将该质粒和pIRES-vector(Clontech公司)用Nhel和Xmal双酶切，用相同方法将IRES连接至该质粒中，构成PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒。

质粒转化及提取

将连接产物转化大肠杆菌Jm109。取10μl连接产物，加入到100μl Jm109大肠杆菌中，冰浴1小时，42℃热休克2min，置冰水中2min，加入900μlLB培养液，37℃、250转/分振摇1小时。取200μl铺于氨苄青霉素抗性的选择性平板上，室温平放30min后，倒置培养14小时。挑取待测的单菌落于含有200mg/L氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡过夜，Vitagene试剂盒抽提质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性质粒。获得的质粒即为所需重组质粒。

Western Blot检测颗粒酶B、caspase-3表达情况

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养人肝癌HepG2细胞(以下简称HepG2细胞)。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。细胞分为给药组和对照组。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入给药组细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，对照组加入空白脂质体Lipofectamine2000。更换含血清培养液继续孵育72小时。培养的细胞用0.5％胰酶消化。用Western Blot法检测活性型颗粒酶B和caspase-3表达情况。在细胞中加入细胞裂解液，冰浴30min，收集细胞裂解物于EP管中，4℃，12000转/分，离心20min。取5倍上样缓冲液40μl，加160μl细胞裂解物，混匀，煮沸5min，将此混合物加入加样孔，每孔25μl。浓缩胶电压65V，分离胶电压90V，直到蓝色溴酚蓝条带泳动至距凝胶底部1cm处，停止电泳。切下分离胶部分，浸泡在转移缓冲液中15分钟。剪裁与凝胶同大小的PVDF膜，滤纸16张，同样浸泡于转移缓冲液。将滤纸，凝胶和膜，按照滤纸-凝胶-膜-滤纸的顺序，从负极到正极依次铺在转移槽中，接通电源，稳流状态，60mA转膜2小时。取出PVDF膜，用1倍的TBST洗膜3次，每次10min。用5％脱脂奶粉封闭，4℃过夜。鼠抗人颗粒酶B抗体和兔抗人caspase-3抗体用1倍TBST做1∶250稀释，将封闭后的膜浸入一抗稀释液，4℃过夜。用1倍TBST洗膜3次，每次10min。羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP用TBS做1∶1000稀释，将洗好后的膜浸入此溶液，室温避光孵育50min。用1倍TBST洗膜3次，每次10min。加入ECL液以显色，将胶片底片曝光。曝光后的胶片进行扫描，用Bio Rad quantity-one 4.1.0软件分析密度积分。积分值越高，说明该蛋白含量越多。结果表明，给药组颗粒酶B和caspase-3密度积分提高，说明加入该重组质粒后，细胞内颗粒酶B和caspase3蛋白增加，该重组质粒的颗粒酶B和caspase-3基因能在细胞中表达。

表1颗粒酶B和Caspase-3蛋白在细胞内的表达(x±s)

^※与对照组比较p＜0.05

实验例1：对人肝癌细胞生长的影响

MTT检测HepG2细胞生长情况

为了分析本发明对癌细胞的抗肿瘤效果，进行MTT检测。在培养箱中，37℃，5％CO₂培养HepG2。转染前2天，用0.5％胰酶消化细胞，细胞计数。将细胞加入96孔细胞培养板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液，混合均匀成500μl培养液，室温孵育20min。用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。每孔加入MTT液(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，终止培养，吸弃上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A值)。A值越低，细胞生长越差。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，HepG2细胞的生长受到抑制。说明该重组质粒对HepG2细胞生长有抑制作用。

表2PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对HepG2细胞生长的影响(x±s)

*与对照组比较p＜0.05

流式细胞术检测细胞凋亡情况

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养HepG2细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，形单细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞凋亡率上升，说明该重组质粒能诱导HepG2细胞的凋亡。

表3 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对肿瘤细胞凋亡率的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

检测Caspase-3活性

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养HepG2细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI 1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，用Caspase3活性检测试剂盒(南京凯基Cat：KGA202)检测Caspase3活性。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞内Caspase-3活性增加，对诱导细胞凋亡有促进作用。

表4 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对Caspase3活性的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

实验例2：对人肺癌细胞生长的影响

MTT检测A549细胞生长情况

为了分析本发明对癌细胞的抗肿瘤效果，进行MTT检测。在培养箱中，37℃，5％CO₂培养人肺癌A549细胞(以下简称A549细胞)。转染前2天，用0.5％胰酶消化细胞，细胞计数。将细胞加入96孔细胞培养板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液，混合均匀成500μl培养液，室温孵育20min。用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。每孔加入MTT液(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，终止培养，吸弃上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A值)。A值越低，细胞生长越差。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，A549细胞生长受到抑制。说明该重组质粒对A549细胞的生长有抑制作用。

表5PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对HepG2细胞生长的影响(x±s)

*与对照组比较p＜0.05

流式细胞术检测细胞凋亡情况

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养A549细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，形单细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞凋亡率上升，说明该重组质粒能诱导A549细胞的凋亡。

表6 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对肿瘤细胞凋亡率的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

检测Caspase-3活性

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养A549细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，用Caspase3活性检测试剂盒(南京凯基Cat：KGA202)检测Caspase3活性。吸光度越高，说明Caspase-3活性越大。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞内Caspase-3活性增加，对诱导细胞凋亡有促进作用。

表7 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对Caspase3活性的影响(x±s)

*与对照组比较p＜0.05

实验例3：对人宫颈癌细胞生长的影响

MTT检测HeLa细胞生长情况

为了分析本发明对癌细胞的抗肿瘤效果，进行MTT检测。在培养箱中，37℃，5％CO₂培养人宫颈癌HeLa细胞(以下简称HeLa细胞)。转染前2天，用0.5％胰酶消化细胞，细胞计数。将细胞加入96孔细胞培养板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液，混合均匀成500μl培养液，室温孵育20min。用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。每孔加入MTT液(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，终止培养，吸弃上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A值)。A值越低，细胞生长越差。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，HeLa细胞的生长受到抑制。说明该重组质粒对HeLa细胞生长有抑制作用。

表8 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对HeLa细胞生长的影响(x±s)

*与对照组比较p＜0.05

流式细胞术检测细胞凋亡情况

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养HeLa细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，形单细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞凋亡率上升，说明该重组质粒能诱导HeLa细胞的凋亡。

表9 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对肿瘤细胞凋亡率的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

检测Caspase-3活性

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养HeLa细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，用Caspase3活性检测试剂盒(南京凯基Cat：KGA202)检测Caspase3活性。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后细胞内Caspase-3活性增加，对诱导细胞凋亡有促进作用。

表10 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对Caspase3活性的影响(x±s)

实验例4：对人乳腺癌细胞生长的影响

MTT检测MCF-7细胞生长情况

为了分析本发明对癌细胞的抗肿瘤效果，进行MTT检测。在培养箱中，37℃，5％CO₂培养人乳腺癌MCF-7细胞(以下简称MCF-7细胞)。转染前2天，用0.5％胰酶消化细胞，细胞计数。将细胞加入96孔细胞培养板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液，混合均匀成500μl培养液，室温孵育20min。用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。每孔加入MTT液(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，终止培养，吸弃上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A值)。A值越低，细胞生长越差。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，MCF-7细胞的生长受到抑制。说明该重组质粒对MCF-7细胞生长有抑制作用。

表11 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对MCF-7细胞生长的影响(x±s)

*与对照组比较p＜0.05

流式细胞术检测细胞凋亡情况

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养MCF-7细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血消培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，形单细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞凋亡率上升，说明该重组质粒能诱导MCF-7细胞的凋亡。

表12 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对肿瘤细胞凋亡率的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

检测Caspase-3活性

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养MCF-7细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，用Caspase3活性检测试剂盒(南京凯基Cat：KGA202)检测Caspase3活性。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞内caspase-3活性增加，对诱导细胞凋亡有促进作用。

表13 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对Caspase3活性的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

实验例5：对人前列腺癌细胞生长的影响

MTT检测LNCap细胞生长情况

为了分析本发明对癌细胞的抗肿瘤效果，进行MTT检测。在培养箱中，37℃，5％CO₂培养人前列腺癌LNCap细胞(以下简称LNCap细胞)。转染前2天，用0.5％胰酶消化细胞，细胞计数。将细胞加入96孔细胞培养板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液，混合均匀成500μl培养液，室温孵育20min。用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。每孔加入MTT液(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，终止培养，吸弃上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A值)。A值越低，细胞生长越差。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，LNCap细胞的生长受到抑制。说明该重组质粒对LNCap细胞生长有抑制作用。

表14 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对HepG2细胞生长的影响(x±s)

*与对照组比较p＜0.05

流式细胞术检测细胞凋亡情况

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养LNCap细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，形单细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞凋亡率上升，说明该重组质粒能诱导LNCap细胞的凋亡。

表15 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对肿瘤细胞凋亡率的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

检测Caspase-3活性

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养LNCap细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，用Caspase3活性检测试剂盒(南京凯基Cat：KGA202)检测Caspase3活性。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞内caspase-3活性增加，对诱导细胞凋亡有促进作用。

表16 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对Caspase3活性的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

实验例6：对人胃癌细胞生长的影响

MTT检测人胃癌BGC823细胞生长情况

为了分析本发明对癌细胞的抗肿瘤效果，进行MTT检测。在培养箱中，37℃，5％CO₂培养人胃癌BGC823细胞(以下简称BGC823细胞)。转染前2天，用0.5％胰酶消化细胞，细胞计数。将细胞加入96孔细胞培养板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液，混合均匀成500μl培养液，室温孵育20min。用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。每孔加入MTT液(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，终止培养，吸弃上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A值)。A值越低，细胞生长越差。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，BGC823细胞的生长受到抑制。说明该重组质粒对BGC823细胞生长有抑制作用。

表17 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对HepG2细胞生长的影响(x±s)

*与对照组比较p＜0.05

流式细胞术检测细胞凋亡情况

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养BGC823细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI 1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，形单细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞凋亡率上升，说明该重组质粒能诱导BGC823细胞的凋亡。

表18 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对肿瘤细胞凋亡率的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

检测Caspase-3活性

在培养箱中，37℃，5％CO₂培养BGC823细胞。转染前2天，胰酶消化细胞并计数，细胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液中，混合，室温孵育20min，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞培养瓶，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。培养的细胞分别用胰酶消化，用Caspase3活性检测试剂盒(南京凯基Cat：KGA202)检测Caspase3活性。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，细胞内caspase-3活性增加，对诱导细胞凋亡有促进作用。

表19 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对Caspase3活性的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

实验例7：对体内生长肿瘤的抑制作用。

将HepG2细胞以3×10⁷/ml的浓度，接种于BALB/c裸鼠腹外侧皮下。待肿瘤长至直径约1mm³时，分为给药组、对照组和联合用药组，每组5只鼠。对照组每只小鼠瘤内注射空白质粒悬液约0.1ml；给药组每只小鼠瘤内注射重组质粒0.1ml，浓度500μg/ml；联合用药组小鼠尾静脉注射顺铂3mg/kg，药物浓度0.3mg/ml，同时小鼠瘤内注射重组质粒0.1ml，浓度500μg/ml。每周2次，连续5周。试验结束，取出瘤块，称重。结果表明，给药组和联合用药组瘤重均低于对照组，说明该质粒单独使用和联合化疗药物使用，均能使瘤重减轻，能抑制肿瘤生长。

表20 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对体内肿瘤生长的影响(x±s)

^※与对照组比较p＜0.01

实验例8：对正常细胞的作用

为了分析本发明对正常细胞生长的影响，进行MTT检测。在培养箱中，37℃，5％CO₂培养人L-02细胞(以下简称L-02细胞)。转染前2天，用0.5％胰酶消化细胞，细胞计数。将细胞加入96孔细胞培养板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培养基培养，使其在转染日能达到85％的融合。取6μg质粒和10μl Lipofectamine2000，各加入250μl无血清RPMI1640培养液，混合均匀成500μl培养液，室温孵育20min。用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，将转染液加入细胞，37℃，5％CO₂中孵育5小时，更换含血清培养液继续孵育48小时。每孔加入MTT液(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，终止培养，吸弃上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A值)。A值越低，细胞生长越差。结果表明，给予PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒后，L-02细胞的生长未受到抑制。说明该重组质粒对L-02细胞生长没有抑制作用。

表21 PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒对L-02细胞生长的影响(x±s)

本发明的核苷酸序列表如下：

一、可采用的survivin启动子序列：

SEQ ID No.1来自于GenBank编号U75285.1的核苷酸序列第1824-2800位核苷酸。

U75285.1(Homo sapiens apoptosis inhibitor survivin gene，complete cds)编码survivin的核苷酸序列。

gccatag aaccagagaa gtgagtggat gtgatgccca

gctccagaag tgactccaga acaccctgtt ccaaagcaga ggacacactg attttttttt

taataggctg caggacttac tgttggtggg acgccctgct ttgcgaaggg aaaggaggag

tttgccctga gcacaggccc ccaccctcca ctgggctttc cccagctccc ttgtcttctt

atcacggtag tggcccagtc cctggcccct gactccagaa ggtggccctc ctggaaaccc

aggtcgtgca gtcaacgatg tactcgccgg gacagcgatg tctgctgcac tccatccctc

ccctgttcat ttgtccttca tgcccgtctg gagtagatgc tttttgcaga ggtggcaccc

tgtaaagctc tcctgtctga cttttttttt ttttttagac tgagttttgc tcttgttgcc

taggctggag tgcaatggca caatctcagc tcactgcacc ctctgcctcc cgggttcaag

cgattctcct gcctcagcct cccgagtagt tgggattaca ggcatgcacc accacgccca

gctaattttt gtatttttag tagagacaag gtttcaccgt gatggccagg ctggtcttga

actccaggac tcaagtgatg ctcctgccta ggcctctcaa agtgttggga ttacaggcgt

gagccactgc acccggcctg cacgcgttct ttgaaagcag tcgagggggc gctaggtgtg

ggcagggacg agctggcgcg gcgtcgctgg gtgcaccgcg accacgggca gagccacgcg

gcgggaggac tacaactccc ggcacacccc gcgccgcccc gcctctactc ccagaaggcc

gcggggggtg gaccgcctaa gagggcgtgc gctcccgaca tgccccgcgg cgcgccatta

accgccagat ttgaatcgcg ggacccgttg gcagaggtgg

SEQ ID No.2来自于U75285第2541-2810位核苷酸

cacgcgttct ttgaaagcag tcgagggggc gctaggtgtg

ggcagggacg agctggcgcg gcgtcgctgg gtgcaccgcg accacgggca gagccacgcg

gcgggaggac tacaactccc ggcacacccc gcgccgcccc gcctctactc ccagaaggcc

gcggggggtg gaccgcctaa gagggcgtgc gctcccgaca tgccccgcgg cgcgccatta

accgccagat ttgaatcgcg ggacccgttg gcagaggtgg cggcggcggc

SEQ ID No.3来自于U75285第2211-2810位核苷酸

ggtggcaccc

tgtaaagctc tcctgtctga cttttttttt ttttttagac tgagttttgc tcttgttgcc

taggctggag tgcaatggca caatctcagc tcactgcacc ctctgcctcc cgggttcaag

cgattctcct gcctcagcct cccgagtagt tgggattaca ggcatgcacc accacgccca

gctaattttt gtatttttag tagagacaag gtttcaccgt gatggccagg ctggtcttga

actccaggac tcaagtgatg ctcctgccta ggcctctcaa agtgttggga ttacaggcgt

gagccactgc acccggcctg cacgcgttct ttgaaagcag tcgagggggc gctaggtgtg

ggcagggacg agctggcgcg gcgtcgctgg gtgcaccgcg accacgggca gagccacgcg

gcgggaggac tacaactccc ggcacacccc gcgccgcccc gcctctactc ccagaaggcc

gcggggggtg gaccgcctaa gagggcgtgc gctcccgaca tgccccgcgg cgcgccatta

accgccagat ttgaatcgcg ggacccgttg gcagaggtgg cggcggcggc

二、采用的活性型GranzymeB序列来自于GenBank编号NM_004131.4的核苷酸序列的第124-810位核苷酸。NM_004131.4为编码颗粒酶B的核苷酸序列

SEQ ID No.4

gagatca tcgggggaca tgaggccaag ccccactccc gcccctacat ggcttatctt

atgatctggg atcagaagtc tctgaagagg tgcggtggct tcctgatacg agacgacttc

gtgctgacag ctgctcactg ttggggaagc tccataaatg tcaccttggg ggcccacaat

atcaaagaac aggagccgac ccagcagttt atccctgtga aaagacccat cccccatcca

gcctataatc ctaagaactt ctccaacgac atcatgctac tgcagctgga gagaaaggcc

aagcggacca gagctgtgca gcccctcagg ctacctagca acaaggccca ggtgaagcca

gggcagacat gcagtgtggc cggctggggg cagacggccc ccctgggaaa acactcacac

acactacaag aggtgaagat gacagtgcag gaagatcgaa agtgcgaatc tgacttacgc

cattattacg acagtaccat tgagttgtgc gtgggggacc cagagattaa aaagacttcc

tttaaggggg actctggagg ccctcttgtg tgtaacaagg tggcccaggg cattgtctcc

tatggacgaa acaatggcat gcctccacga gcctgcacca aagtctcaag ctttgtacac

tggataaaga aaaccatgaa acgctactaa

三、采用的Caspase-3序列来自于GenBank编号NM_032991.2的核苷酸序列第91-934位核苷酸。NM_032991.2为编码Caspase-3的核苷酸序列。

SEQ ID No.5

gtatccatgg agaacactga aaactcagtg

gattcaaaat ccattaaaaa tttggaacca aagatcatac atggaagcga atcaatggac

tctggaatat ccctggacaa cagttataaa atggattatc ctgagatggg tttatgtata

ataattaata ataagaattt tcataaaagc actggaatga catctcggtc tggtacagat

gtcgatgcag caaacctcag ggaaacattc agaaacttga aatatgaagt caggaataaa

aatgatctta cacgtgaaga aattgtggaa ttgatgcgtg atgtttctaa agaagatcac

agcaaaagga gcagttttgt ttgtgtgctt ctgagccatg gtgaagaagg aataattttt

ggaacaaatg gacctgttga cctgaaaaaa ataacaaact ttttcagagg ggatcgttgt

agaagtctaa ctggaaaacc caaacttttc attattcagg cctgccgtgg tacagaactg

gactgtggca ttgagacaga cagtggtgtt gatgatgaca tggcgtgtca taaaatacca

gtggaggccg acttcttgta tgcatactcc acagcacctg gttattattc ttggcgaaat

tcaaaggatg gctcctggtt catccagtcg ctttgtgcca tgctgaaaca gtatgccgac

aagcttgaat ttatgcacat tcttacccgg gttaaccgaa aggtggcaac agaatttgag

tccttttcct ttgacgctac ttttcatgca aagaaacaga ttccatgtat tgtttccatg

ctcacaaaag aactctattt ttatcactaa agaa

四、可采用的Caspase-3序列，来自于NM_004346.3

SEQ ID No.6

gta tccatggaga acactgaaaa ctcagtggat tcaaaatcca

ttaaaaattt ggaaccaaag atcatacatg gaagcgaatc aatggactct ggaatatccc

tggacaacag ttataaaatg gattatcctg agatgggttt atgtataata attaataata

agaattttca taaaagcact ggaatgacat ctcggtctgg tacagatgtc gatgcagcaa

acctcaggga aacattcaga aacttgaaat atgaagtcag gaataaaaat gatcttacac

gtgaagaaat tgtggaattg atgcgtgatg tttctaaaga agatcacagc aaaaggagca

gttttgtttg tgtgcttctg agccatggtg aagaaggaat aatttttgga acaaatggac

ctgttgacct gaaaaaaata acaaactttt tcagagggga tcgttgtaga agtctaactg

gaaaacccaa acttttcatt attcaggcct gccgtggtac agaactggac tgtggcattg

agacagacag tggtgttgat gatgacatgg cgtgtcataa aataccagtg gaggccgact

tcttgtatgc atactccaca gcacctggtt attattcttg gcgaaattca aaggatggct

cctggttcat ccagtcgctt tgtgccatgc tgaaacagta tgccgacaag cttgaattta

tgcacattct tacccgggtt aaccgaaagg tggcaacaga atttgagtcc ttttcctttg

acgctacttt tcatgcaaag aaacagattc catgtattgt ttccatgctc acaaaagaac

tctattttta tcactaaaga aatggttggt

SEQ ID No.7采用的IRES序列

gctagc  ctcgagaatt cacgcgtcga  gcatgcatct  agggcggcca  attccgcccc tctccccccc

ccccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt

ctatatgtga ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc

ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg

aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc

cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa

ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca

aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt

tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga

aaaacacgat gataagcttg ccacaacccg gg

SEQ ID No.8最终合成的Survivin启动子-颗粒酶B-IRES-caspase-3序列

gccatag aaccagagaa gtgagtggat gtgatgccca

gctccagaag tgactccaga acaccctgtt ccaaagcaga ggacacactg attttttttt

taataggctg caggacttac tgttggtggg acgccctgct ttgcgaaggg aaaggaggag

ttgccctga gcacaggccc ccaccctcca ctgggctttc cccagctccc ttgtcttctt

atcacggtag tggcccagtc cctggcccct gactccagaa ggtggccctc ctggaaaccc

aggtcgtgca gtcaacgatg tactcgccgg gacagcgatg tctgctgcac tccatccctc

ccctgttcat ttgtccttca tgcccgtctg gagtagatgc tttttgcaga ggtggcaccc

tgtaaagctc tcctgtctga cttttttttt ttttttagac tgagttttgc tcttgttgcc

taggctggag tgcaatggca caatctcagc tcactgcacc ctctgcctcc cgggttcaag

cgattctcct gcctcagcct cccgagtagt tgggattaca ggcatgcacc accacgccca

gctaattttt gtatttttag tagagacaag gtttcaccgt gatggccagg ctggtcttga

actccaggac tcaagtgatg ctcctgccta ggcctctcaa agtgttggga ttacaggcgt

gagccactgc acccggcctg cacgcgttct ttgaaagcag tcgagggggc gctaggtgtg

ggcagggacg agctggcgcg gcgtcgctgg gtgcaccgcg accacgggca gagccacgcg

gcgggaggac tacaactccc ggcacacccc gcgccgcccc gcctctactc ccagaaggcc

gcggggggtg gaccgcctaa gagggcgtgc gctcccgaca tgccccgcgg cgcgccatta

accgccagat ttgaatcgcg ggacccgttg gcagaggtgg gagctcttac gcgtgagatca tcgggggaca

tgaggccaag ccccactccc gcccctacat ggcttatctt atgatctggg atcagaagtc tctgaagagg

tgcggtggct tcctgatacg agacgacttc gtgctgacag ctgctcactg ttggggaagc tccataaatg

tcaccttggg ggcccacaat atcaaagaac aggagccgac ccagcagttt atccctgtga aaagacccat

cccccatcca gcctataatc ctaagaactt ctccaacgac atcatgctac tgcagctgga gagaaaggcc

aagcggacca gagctgtgca gcccctcagg ctacctagca acaaggccca ggtgaagcca gggcagacat

gcagtgtggc cggctggggg cagacggccc ccctgggaaa acactcacac acactacaag aggtgaagat

gacagtgcag gaagatcgaa agtgcgaatc tgacttacgc cattattacg acagtaccat tgagttgtgc

gtgggggacc cagagattaa aaagacttcc tttaaggggg actctggagg ccctcttgtg tgtaacaagg

tggcccaggg cattgtctcc tatggacgaa acaatggcat gcctccacga gcctgcacca aagtctcaag

ctttgtacac tggataaaga aaaccatgaa acgctactaa gctagccctcgagaatt cacgcgtcga

gcatgcatct agggcggcca attccgcccc tctccccccc ccccctctcc ctcccccccc cctaacgtta

ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtga ttttccacca tattgccgtc

ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct

ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac

aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca

aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt

gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc

attgtatggg atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg

tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataagcttg ccacaacccg

ggctcgaggtatccatgg agaacactga  aaactcagtg

gattcaaaat ccattaaaaa tttggaacca aagatcatac atggaagcga atcaatggac

tctggaatat ccctggacaa cagttataaa atggattatc ctgagatggg tttatgtata

ataattaata ataagaattt tcataaaagc actggaatga catctcggtc tggtacagat

gtcgatgcag caaacctcag ggaaacattc agaaacttga aatatgaagt caggaataaa

aatgatctta cacgtgaaga aattgtggaa ttgatgcgtg atgtttctaa agaagatcac

agcaaaagga gcagttttgt ttgtgtgctt ctgagccatg gtgaagaagg aataattttt

ggaacaaatg gacctgttga cctgaaaaaa ataacaaact ttttcagagg ggatcgttgt

agaagtctaa ctggaaaacc caaacttttc attattcagg cctgccgtgg tacagaactg

gactgtggca ttgagacaga cagtggtgtt gatgatgaca tggcgtgtca taaaatacca

gtggaggccg acttcttgta tgcatactcc acagcacctg gttattattc ttggcgaaat

tcaaaggatg gctcctggtt catccagtcg ctttgtgcca tgctgaaaca gtatgccgac

aagcttgaat ttatgcacat tcttacccgg gttaaccgaa aggtggcaac agaatttgag

tccttttcct ttgacgctac ttttcatgca aagaaacaga ttccatgtat tgtttccatg

ctcacaaaag aactctattt ttatcactaa agaa

Claims (3)

1.由启动子调控两种目的基因表达的重组载体，其特征在于第一目的基因为颗粒酶B，第二目的基因为Caspase3基因，构建方法如下：

(1)Survivin启动子基因提取

根据GenBank数据库的Survivin基因启动子序列，合成Survivin基因启动子引物，上游引物：5’-CAGGTACCGCCATAGAACCA-3’，下划线处为Kpn I酶切位点，下游引物：5’-CGGAGCTCCCACCTCTGCCA-3’，下划线处为Sac I酶切位点，以HepG-2细胞基因组DNA为模板，PCR扩增Survivin启动子基因片段，

(2)细胞总mRNA提取

在37℃，5％CO₂的培养箱内培养人CD₈ ⁺细胞，提取细胞总mRNA，

(3)活性型颗粒酶B基因提取

用TAKARA公司的cDNA合成试剂盒将人CD₈ ⁺细胞的mRNA逆转录合成cDNA文库，取逆转录产物为模板，PCR扩增颗粒酶B基因序列，上游引物5’-GCAACGCGTGAGATCATCG-3’，下划线处为Mlu I酶切位点，下游引物：5’-CGGCTAGCCTTAGTAGCGTTTC-3’，下划线处为Nhe I酶切位点，PCR产物用10％琼脂糖凝胶电泳，Qiaquick柱回收试剂盒回收活性型颗粒酶B基因片段，

(4)caspase3基因片段提取

以人CD₈ ⁺细胞cDNA为模板，提取caspase-3基因，上游引物5’-GCCTCGAGGTATCCATGGAG-3’，下划线处为Xho I酶切位点，下游引物5’-CCGTAAGCTTTTCTTTAGTGATAA-3’，下划线处为HindIII酶切位点，PCR产物用10％琼脂糖凝胶电泳，Qiaquick柱回收试剂盒回收caspase-3基因片段，

(5)质粒制备

将Survivin启动子基因片段和PGL-3Basic质粒用Kpn I与Sac I双酶37℃消化3小时，琼脂糖凝胶电泳，回收片段，取消化后的Survivin启动子基因片段和PGL-3Basic质粒，以1∶3的比例，在16℃时，用T4DNA连接酶连接16小时，此质粒为PGL3-Sur-Luc，以相同方法用Mlu I与Nhe I双酶消化活性型颗粒酶B基因片段和PGL3-Sur-Luc，将活性型颗粒酶B基因片段连接到此质粒中，命名为PGL3-Sur-颗粒酶B-Luc，以相同方法用Xho I和HindIII双酶消化caspase3基因片段和PGL3-Sur-颗粒酶B-Luc，将caspase-3基因片段连接到质粒中，构成PGL3-Sur-颗粒酶B-caspase-3-Luc质粒，将该质粒和pIRES-vector用Nhel和Xmal双酶切，用相同方法将IRES连接至该质粒中，构成PGL3-Sur-颗粒酶B-IRES-caspase-3-Luc质粒，(6)质粒转化及提取将步骤5的最终连接产物转化大肠杆菌Jm109，Vitagene试剂盒抽提质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性质粒，获得的质粒即为所需重组质粒。

2.权利要求1所述的由启动子调控两种目的基因表达的重组载体在制备用于治疗肝癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的药物由所述重组载体与抗肿瘤物质组成，抗肿瘤物质为顺铂、紫杉醇或喜树碱。