CN112526136A - 一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液及试剂盒 - Google Patents

一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液及试剂盒。所述样本预处理液，所述预处理液为含有螯合剂、高浓度盐离子、蛋白变性剂、还原剂和表面活性剂的缓冲溶液。并利用该样本预处理液构建了联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的试剂盒。本试剂盒可有效的破除病毒壳而释放出三种相关抗原，大大提高了样本的检测灵敏度，具有极高的临床应用价值，并能广泛适用于各类型样本检验。

Description

一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液及 试剂盒
技术领域
本发明涉及乙型肝炎病毒抗原检测技术领域，更具体地，涉及一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液及试剂盒。
背景技术
乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病。乙型肝炎病毒(HBV)呈世界流行，全球有20亿人曾感染过HBV，其中约3.5亿人为慢性HBV感染，每年约有100万人死于HBV相关的肝衰竭或原发性肝癌。慢性乙型肝炎病毒感染是一个全球性的健康问题。
血液HBV DNA检测作为检测肝脏组织中HBV载量的常见方法存在如下几个问题：(1)HBV DNA检测通常价格昂贵且操作过于复杂；(2)药物抑制HBV-DNA的合成与释放，HBVDNA检测虽然使用PCR(Polymerase Chain Reaction)及TMA(Transcription-MediatedAmplification)等基因扩增法，但是在服用拉米夫定及阿德福韦酯等抗病毒药物时，DNA合成会受到抑制，并会抑制包含HBV DNA的病毒颗粒的释放，也就是说，即使肝脏组织中有HBV，使用上述基因扩增法进行的HBV DNA检测结果也可能呈阴性。另外，虽然通过活组织检查(采集肝脏组织)检测cccDNA(covalently closed circular DNA)的方法可以有效了解肝脏组织中HBV量，但是由于其对人体侵害过高，所以实施起来并不容易。因此血清学标志物对慢性HBV感染治疗前后的病人的诊断、预后和监测起着重要作用。近年来，乙型肝炎相关核心抗原(HBcrAg)作为一种新的血清学标志在患者病情的发展评价中被寄予厚望。
乙型肝炎病毒核心相关抗原(HBcrAg)：包括乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)以及分子量为22kD的前核心蛋白(p22cr)三种蛋白质，它们有149个相同的氨基酸序列，结构示意图见附图1。在血清中，HBcAg主要存在于三种颗粒结构中，包括完整病毒颗粒、空病毒颗粒以及RNA病毒颗粒，其中以空病毒颗粒的数量最多。HBeAg非结构蛋白，为分泌性蛋白，主要功能是免疫调节，促使病毒持续感染，存在于血流中。含有HBV-DNA的完整病毒颗粒dane颗粒只占所有病毒颗粒的一小部分，而绝大部分是一种不含核酸的“空病毒颗粒”。在这种病毒颗粒中，HBcAg平均只占10.5％，而p22cr大约占89.5％。日本Kimura等和Rokuhara等(Tatsuji Kimura，Akinori Rokuhara，Yoko Sakamoto，etal.Sensitive Enzyme Immunoassay for Hepatitis B Virus Core-Related Antigensand Their Correlation to Virus Load[J].J Clin Microbiol.2002Feb；40(2):439–445)先后开发和发展了检测血清HBcrAg即变性开解为一级结构的HBeAg和HBcAg的EIA和CLEIA试剂；随后Kimura等(Tatsuji Kimura,Nobuhiko Ohno,Nobuo Terada,etal.Hepatitis B virus DNA-negative dane particles lack core protein butcontain a 22-kDa precore protein without C-terminal arginine-rich domain[J].JBiol Chem.2005Jun；280(23):21713-9)发现，CLEIA检测的血清HBcrAg不仅包括HBeAg和HBcAg，而且覆盖HBeAg形成前的中间产物P22cr蛋白。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液及试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液。
本发明的另一个目的是提供一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液，所述预处理液为含有螯合剂、盐离子、蛋白变性剂和表面活性剂的缓冲溶液。
优选地，所述含有螯合剂为浓度为1～10mM的EDTA。
更优选地，所述含有螯合剂为浓度为10mM的EDTA。
优选地，所述盐离子为浓度为0.25～0.5M的NaCl或KCl。
更优选地，所述盐离子浓度为0.5M的NaCl或KCl。
进一步优选地，所述盐离子浓度为0.5M的NaCl。
优选地，所述蛋白变性剂为浓度为2～4M的尿素或盐酸胍。
更优选地，所述蛋白变性剂浓度为2.5M的尿素或盐酸胍。
进一步优选地，所述蛋白变性剂浓度为2.5M的尿素。
优选地，所述表面活性剂为浓度为5～10％(w/v)的十二烷基硫酸钠(SDS)、浓度为0.5～4％(w/v)的十二烷基磺基甜菜碱(SB)、浓度为0.5～6％(w/v)的吐温、浓度为0.05～1％(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、浓度为0.05～1％(w/v)的十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)中的一种或几种，其中所述十二烷基磺基甜菜碱(SB)为SB 10、SB12、SB14、或SB16中的一种或几种，吐温为吐温-20、吐温-40、吐温-60、或吐温-80中的一种或几种。
最优选地，所述表面活性剂为2％(w/v)SB和/或0.5％(w/v)CTAB。
进一步优选地，所述表面活性剂为2％(w/v)SB16和0.5％(w/v)CTAB。
优选地，所述缓冲溶液pH 6.5～7.4的0.01～0.1M的PB。
更优选地，所述缓冲溶液pH为7.4的0.02M的PB。
最优选的，所述样本预处理液，所述预处理液为20mM PB pH 7.4+0.5MNaCl+2％SB16+0.5％CTAB+2.5M尿素+10mM EDTA。
本发明还要求保护一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的试剂盒，所述试剂盒包括任一所述的(1)样本处理液。
待测样本经过样本处理液进行预处理(工作原理如图2所示)，使包含在乙型肝炎病毒颗粒中的HBcAg和p22cr释放处理，同时将乙型肝炎病毒e抗体(anti-HBe)和乙型肝炎病毒核心抗体(anti-HBc)变性失活，使得本试剂盒能够联合检测乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)以及分子量为22kD的前核心蛋白(p22cr)。
优选地，所述试剂盒还包括(2)偶联有抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体的固相载体、(3)吖啶酯标记的抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体、(4)校准品、(5)质控品。
更优选地，所述校准品和质控品分别为含一系列浓度的乙型肝炎病毒e抗原前体(Pro-HBeAg)的工作溶液。
本试剂盒提供可与乙型肝炎病毒相关抗原特异结合的第一抗HBeAg抗体，第一抗HBcAg抗体和第一抗p22cr抗体，将第一抗HBeAg抗体，第一抗HBcAg抗体和第一抗p22cr抗体作为捕捉抗体结合到相同固相载体上，形成第一抗体-载体结合物；经过预处理的待测样本与第一抗体-载体结合物接触，使得样本中的乙型肝炎病毒核心相关抗原：HBeAg、HBcAg以及p22cr被捕获，形成抗原-第一抗体-载体结合物；使第二抗HBeAg抗体，第二抗HBcAg抗体和第二抗p22cr抗体的产物接触，形成第二抗体-抗原-第一抗体-载体结合物；通过检测被结合的第二抗体上标记的吖啶酯产生的信号来计算乙型肝炎病毒核心相关抗原的量。
优选地，所述固相载体为磁珠。
优选地，所述磁珠为含有-COOH、-NH2、或-HS任意一种或几种官能团的顺磁纳米颗粒。
对于(2)偶联有已标记抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体的磁珠中抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体分别抗三个抗原的抗体，也可以是抗三个抗原共有片段的同一个抗体，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，可以是抗线性表位抗体，也可以是抗空间表位抗体。
同样的对于(3)吖啶酯标记的抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体中三个抗体可以是分别抗三个抗原的抗体，也可以是抗三个抗原共有片段的同一个抗体，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，可以是抗线性表位抗体，也可以是抗空间表位抗体。
优选地，偶联有抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体的磁珠溶于含有牛血清白蛋白以及表面活性剂的Tris-HCl缓冲液中。
更优选地，所述表面活性剂是吐温-20。
优选地，吖啶酯标记的抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体溶于含有牛血清白蛋白以及表面活性剂的Tris-HCl缓冲液中。
更优选地，所述表面活性剂是吐温-20。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的乙型肝炎病毒核心相关抗原：HBeAg、HBcAg以及p22cr的检测试剂盒可有效的破除病毒壳而释放出三种相关抗原，大大提高了样本的检测灵敏度，具有极高的临床应用价值，并能广泛适用于各类型样本检验。
附图说明
图1为乙型肝炎核心相关抗原结果示意图。
图2为乙型肝炎核心相关抗原检测试剂盒检测示意图。
图3为HBcrAg浓度与HBV-DNA含量的相关性。
图4为相对健康人HBcrAg浓度(kU/mL)的频率分布(n＝200)。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1乙型肝炎病毒核心相关抗原检测试剂盒
一、制备方法
(一)、制备偶联有抗HBeAg、HBcAg以及p22cr抗体的磁珠包被物
将特异性抗体通过共价偶联的方式连接到磁珠上制备得到的磁珠包被物。抗体表面的氨基或羧基与磁珠表面的化学基团在化学交联剂的作用下发生化学反应，形成抗体--磁珠的共价结合物，该共价结合物经过洗涤和封闭，去除未反应的抗体，以及封闭非特异性结合的位点，最终制备成试剂盒磁珠包被物。
操作过程如下：
1、取含有某种官能团(选自-COOH、-NH2、-HS等官能团中的一种)的顺磁纳米颗粒溶液500μL，用偶联缓冲液(MES缓冲液，pH 5.0～6.0)进行洗涤，将顺磁纳米磁珠的缓冲液成分置换成偶联缓冲液；
2、称取交联剂EDC和NHS各10mg，分别溶解于1mL偶联缓冲液中，配制终浓度为10mg/mL的EDC溶液和配制终浓度为10mg/mL的NHS溶液；
3、将步骤1洗涤后的纳米磁珠溶液与步骤2制备的EDC溶液和NHS溶液充分混合，用磁性微球混合器旋转30分钟；
4、将步骤3中的纳米磁珠溶液加入抗HBeAg、HBcAg以及p22cr抗体各0.5mg，室温振荡120分钟，使抗体与磁珠通过共价偶联的方式结合在一起，用含有吐温-20的Tris-HCl缓冲液对制备好的纳米磁珠混悬液进行洗涤，将反应瓶置于磁分离架上约5分钟，小心移去上清；
5、将步骤4中的纳米磁珠溶液加入含有牛血清白蛋白以及表面活性剂的缓冲液，定容，室温振荡过夜。
6、用含有表面活性剂的缓冲液对步骤5制备好的纳米磁珠混悬液进行洗涤，将反应瓶置于磁分离架上约5分钟，小心移去上清；加入含有蛋白以及表面活性剂的缓冲液，定容，制得磁珠混悬液，保存至2～8℃环境中。
(二)、制备吖啶酯抗体结合物
1、抗体的预处理：将抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体保存液置换为磷酸缓冲液(pH 6.0～7.0)。
2、抗体的标记：用预处理后的抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体与吖啶酯按40:1的质量比充分混匀，室温避光震荡16～20小时即可。然后经纯化仪进行纯化所得。将标记吖啶酯的抗体用含有蛋白以及表面活性剂的缓冲液稀释至终浓度，存放于2～8℃。
(三)、制备校准品和质控品
校准品和质控品均为一系列浓度乙型肝炎病毒e抗原前体(Pro-HBeAg)的工作溶液。Pro-HBeAg含有乙型肝炎病毒核心相关抗原氨基酸序列。
制备的最终浓度为：
校准品：A：0kU/mL；B：1kU/mL；C：25kU/mL；D：250kU/mL；E：2500kU/mL；F：10000kU/mL；
质控品：C1：50kU/mL；C2：500kU/mL；C3：3000kU/mL。
(四)、制备样本处理液
按照如下配方配制制备样本处理液：
20mM PB pH 7.4+0.5M NaCl+2％SB16+0.5％CTAB+2.5M尿素+10mM EDTA
二、组成
上文制备的偶联有抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体的磁珠包被物、吖啶酯抗体结合物、校准品、质控品和制备样本处理液
三、使用方法
将制备的乙型肝炎病毒核心相关抗原检测试剂盒与全自动化学发光仪Caris200、DR-CL2000配套使用，其流程如下：
第一步，将待测样本(血清或血浆)与样本处理液于等体积混合，37℃处理30min；
第二步，偶联有抗HBeAg、HBcAg以及p22cr抗体的磁珠包被物同待测样本加入反应杯中，37℃孵育15分钟，待测样本中抗乙型肝炎病毒核心相关抗原与磁珠包被的抗HBeAg、HBcAg以及p22cr抗体结合，孵育完成后，固相置于一个磁场内被吸住，结合在固相上的物质被保留，而其他未结合的物质被冲洗除去。
第三步，将吖啶酯结合物添加到反应管在37℃孵育10分钟抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体，吖啶酯标记的抗HBeAg抗体、抗HBcAg抗体以及抗p22cr抗体与第一步反应的磁珠-抗体-核心相关抗原复合物结合，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物；孵育完成后，该复合物被一个磁场吸住，而其他未结合的物质被冲洗除去。
第四步，在第三步反应得到的抗体-抗原-抗体夹心复合物中加入预激发液(Pre-Trigger)和激发液(Trigger)；最后测量化学发光反应的相对光单位(RLU/s)，样本中HBcrAg的量和光学系统所测量出的相对光单位(RLU/s)成正比关系。
仪器自动计算得出每份样本的测定浓度，报告单位为kU/mL。样本中是否含有HBcrAg，需要将样本的测试结果与参考值进行比较，如果小于1，表示样本中不含有HBcrAg，如果大于或等于1，表示样本中含有HBcrAg。
实施例2样本处理液的制备
样本处理液的作用是将HBcAg，p22cr从Dane病毒颗粒释放出来，HBcAg，p22cr，HBeAg均变性为线性抗原，同时样本中的anti-HBe，anti-HBc都变成失活的抗体。Dane颗粒是具有感染性的完整的HBV颗粒，呈球形，直径42nm，具有双层衣壳。其外衣壳相当于一般病毒的包膜，由脂质双层与蛋白质组成，可用去垢剂去除病毒的外衣壳后，可暴露直径为27nm的20面体核心结构，核心的表面为病毒的内衣壳，内衣壳蛋白为HBcAg。样本处理液既要充分裂解病毒颗粒但又要足够温和以致影响后续试剂盒中固相载体上包被抗体的活性。
一、配制不同组分的样本处理液
处理液1：20mM PB pH 7.4+2％SB16(m/v)+2.5M尿素+10mM EDTA；
处理液2：20mM PB pH 7.4+0.1M NaCl+2％SB16(m/v)+2.5M尿素+10mM EDTA；
处理液3：20mM PB pH 7.4+0.5M NaCl+2％SB16(m/v)+2.5M尿素+10mM EDTA；
处理液4：20mM PB pH 7.4+0.5M NaCl+2％SB16(m/v)+0.5％CTAB+2.5M尿素+10mMEDTA；
处理液5：20mM PB pH 7.4+0.5M NaCl+2％SB10(m/v)+0.5％CTAB+2.5M尿素+10mMEDTA；
处理液6：20mM PB pH 7.4+0.5M NaCl+2％SB12(m/v)+0.5％CTAB(m/v)+2.5M尿素+10mM EDTA；
处理液7：20mM PB pH 7.4+0.5M NaCl+2％SB14(m/v)+0.5％CTAB(m/v)+2.5M尿素+10mM EDTA；
处理液8：20mM PB pH 7.4+5％SDS(m/v)+10mM EDTA；
处理液9：20mM PB pH 7.4+10％SDS(m/v)+10mM EDTA；
处理液10：20mM PB pH 7.4+2％吐温-20(v/v)+10mM EDTA；
处理液11：20mM PB pH 7.4+2％吐温-40(v/v)+10mM EDTA；
处理液12：20mM PB pH 7.4+2％吐温-60(v/v)+10mM EDTA；
处理液13：20mM PB pH 7.4+2％吐温-80(v/v)+10mM EDTA；
处理液14：20mM PB pH 7.4+2％tritonx-100(v/v)+10mM EDTA。
二、比较不同配方样本处理液的裂解效果
将50μL血清或血浆样本加入50μL配制的样本处理液1到14分别于37℃处理30min后，再接着按实施例1中的乙型肝炎病毒核心相关抗原检测试剂盒进行检测，并以日本Fujirebio公司的HBcrAg试剂盒中的样本处理液作为对照处理液。
表1不同样本处理液裂解样本后HBcrAg检测结果统计：
Figure BDA0002758966170000081
Figure BDA0002758966170000091
阳性样本的浓度越高，说明释放的核心相关抗原越高，且阴性样本测值应小于1kU/mL，样本处理液的效果越好(用“+”评价，阳性样本浓度越高，“+”个数相应越多)。从实验结果可以看出，样本不处理时，有两份阳性样本不能检测出HBcrAg，使用一系列含不同剂量不同种类的表面活性剂的缓冲液可以有效的裂解病毒颗粒，提高HBcrAg的检测灵敏度，和对照处理液比较，处理液3、4、5、6、7处理效果更佳，处理液4效果最好。
实施例3乙型肝炎病毒核心相关抗原与PCR定量检测的相关性
一、试剂盒的准备
用实施例1的乙型肝炎病毒核心相关抗原检测试剂盒检测样本的HBcrAg的含量，用购自达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒核酸PCR定量检测试剂盒检测样本的HBV-DNA含量。
二、检测标本
标本来源于达安临床检验中心的39例HBV-DNA阳性血清样本，-20℃冷冻保存。
三、检测项目及结果分析
检测样本的HBV-DNA含量和HBcrAg的含量，分析两者的浓度相关性，相关性结果见图3。经统计，两者相关性r值为0.482，95％CI为0.1963～0.6922，说明HBcrAg浓度和DNA水平具有明显的平行关系，通过检测外周血HBcrAg水平可简单有效的动态观察慢性HBV感染者病毒复制及抗病毒过程中HBV动态变化情况，是不同于现有监测指标的有益于慢性乙型肝炎彻底治疗的有效评价途径。
实施例4乙型肝炎病毒核心相关抗原检测试剂盒的特异性
用乙型肝炎病毒核心相关抗原检测试剂盒检测200例相对健康人血清样本(临床查体者)，经统计分析乙型肝炎病毒核心相关抗原的浓度分布情况。
对200份查体者血清样本检测结果进行统计分析，结果见表2～3和图4所示。从结果可以看出，大多数相对健康人(没有患有乙型肝炎病的人)样本的浓度值≤0.4kU/mL(95％)，最大值为0.92kU/mL，均值为0.16±0.159kU/mL，HBcrAg检测均为阴性。
表2相对健康人血清样本HBcrAg浓度统计分析
Figure BDA0002758966170000101
表3相对健康人血清HBcrAg检测结果统计表(n＝200)
Figure BDA0002758966170000102

Claims (10)

1.一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液，其特征在于，所述预处理液为含有螯合剂、盐离子、蛋白变性剂和表面活性剂的缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的样本预处理液，其特征在于，所述含有螯合剂为浓度为1～10mM的EDTA。
3.根据权利要求1所述的样本预处理液，其特征在于，所述盐离子为浓度为0.25～0.5M的NaCl或KCl。
4.根据权利要求1所述的样本预处理液，其特征在于，所述蛋白变性剂为浓度为2～4M的尿素或盐酸胍。
5.根据权利要求1所述的样本预处理液，其特征在于，所述表面活性剂为浓度为5～10％(w/v)的十二烷基硫酸钠、浓度为0.5～4％(w/v)的十二烷基磺基甜菜碱、浓度为0.5～6％(w/v)的吐温、浓度为0.05～1％(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵、浓度为0.05～1％(w/v)的十二烷基三甲基溴化铵中的一种或几种，其中所述十二烷基磺基甜菜碱为SB 10、SB12、SB14、或SB16中的一种或几种，吐温为吐温-20、吐温-40、吐温-60、或吐温-80中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的样本预处理液，其特征在于，所述缓冲溶液pH6.5～7.2的0.01～0.1M的PB。
7.一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1到6任一所述的(1)样本处理液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括(2)偶联有抗HBeAg抗体、HBcAg抗体以及p22cr抗体的固相载体、(3)吖啶酯标记的抗HBeAg、HBcAg以及p22cr抗体、(4)校准品、(5)质控品。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，偶联有抗HBeAg抗体、HBcAg抗体以及p22cr抗体的磁珠溶于含有牛血清白蛋白以及表面活性剂的Tris-HCl缓冲液中。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，吖啶酯标记的抗HBeAg、HBcAg以及p22cr抗体溶于含有牛血清白蛋白以及表面活性剂的Tris-HCl缓冲液中。
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