CN1255542C - 融合型幽门螺杆菌粘附素基因工程疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了融合型幽门螺杆菌粘附素基因工程菌疫苗的构建及其制备方法，其特征在于用粘附素HpaA通过基因重组方法构建幽门螺杆菌粘附素与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位或霍乱毒素B亚单位分子内佐剂融合工程菌，经过高密度发酵、包涵体提取、复性及纯化大量获得所需疫苗蛋白，该疫苗可以分别被制备成口服剂、注射剂及滴/喷鼻剂。该基因工程疫苗构建方法独特，制备工艺简捷、容易放大、重复性好，所获疫苗蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的免疫应答和免疫保护作用。

Description

融合型幽门螺杆菌粘附素基因工程疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及融合型幽门螺杆菌粘附素基因工程疫苗的构建及其制备方法

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是定植于人胃粘膜的革兰氏阴性螺杆菌，是导致慢性感染最常见的病原微生物之一，全世界约有50％以上的人感染过Hp。大多数的感染者平时无任何症状，但约有30％的感染者发展为慢性胃炎，10-20％的人发展为消化性溃疡(胃溃疡和十二指肠溃疡)，还有部分感染者可以在慢性活动性胃炎的基础上，出现胃粘膜萎缩和肠上皮化生，其中有少数人还可以发展为胃癌。对于Hp的抗感染治疗尚存在较大问题，单剂药物治疗根除率低，而使用多联药物费用昂贵，治愈率不高且不能有效阻止Hp再感染和复发，此外，耐药菌株的增加也使抗Hp治疗面临越来越复杂的难题。

由于抗生素治疗的局限性，人们开始探索用免疫手段防治Hp感染的可能性。随着该菌功能蛋白的陆续发现，相应基因的克隆及动物模型的不断完善，Hp疫苗研制的可行性大大提高，其中基因工程尿素酶亚单位疫苗已进入II期临床试验阶段。目前采用的基因重组抗原有尿素酶、VacA、CagA、热休克蛋白等，它们基本上着眼于阻断Hp的毒力因素。由于粘附素与Hp定植密切相关，在Hp致病过程中的重要作用也使其越来越受到重视。

Hp的粘附素是位于菌体表面、能与胃上皮细胞发生特异性粘附引起病理损害一组蛋白分子。Evans等首先证明N-乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维血凝素(N-acetylneuraminyl-lactose-binding haemagglutinin，NLBH)是Hp的主要粘附素之一，可与胃粘膜上皮细胞上的特异性受体结合，使Hp紧密粘附于胃上皮细胞，发挥对胃粘膜的损伤作用。Evans等在研究粘附因子时获得了约1.4Kbp的基因片段，通过序列分析发现，该片段含有ORF1、ORF2、ORF3三个开放阅读框(ORF1：360bp；ORF2：549bp；ORF3：177bp)。其中ORF2、ORF3之间有一天然的阅读框内连接，因此ORF2+ORF3构成783bpHpaA基因，可编码260aa组成的HpaA蛋白，其分子量约29,000Da。抗体检测和Western印迹证实该蛋白具有与NLBH亚单位相同的抗原特性以及植物血凝素结合的特点，认为该蛋白是NLBH的亚单位HpaA。

HpaA属于外膜蛋白家族，具有十分保守的含KRTIQK6个氨基酸的涎酸乳糖结合域。我们通过基因分析12株Hp菌株710bp的HpaA基因进行分析，结果显示HpaA核苷酸同源性致性＞94.4％，由核苷酸序列推定的氨基酸同源性＞96.8％，提示HpaA蛋白具有相对的保守性。Evans等用包含RTIQK的十二肽免疫动物所得抗血清能够阻断Hp与人红细胞的凝集，表明该区域具有较理想的免疫原性。同时HpaA在所有的Hp菌株中表达，机体所产生抗HpaA抗体不与人体内的正常菌群和粘膜组织发生交叉反应，因此HpaA蛋白可作为Hp疫苗侯选亚单位组分之一。

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)和霍乱毒素(CT)是现在研究较多的粘膜免疫佐剂。LT和CT分子结构相似，由一个A亚单位和形成油煎饼状的B亚单位五聚体组成，肠毒素活性主要与A亚单位相关，B亚单位第33位的甘氨酸残基可以与GM1神经节苷脂末端的半乳糖结合，是LTB的活性结合位点，这一特征赋予LTB具有与GM1神经节苷脂结合的能力，能与广泛分布于哺乳动物细胞表面的GM1神经节苷脂结合，通过介导受体之间的相互作用，使具有毒性的A亚单位内在化和吸收。实验证明LT和CT在动物实验中具有粘膜免疫佐剂活性，能够刺激产生针对共服抗原的分泌型IgA，并对同型病原微生物的再次感染具有保护作用。George等认为单独的B亚单位也具有佐剂活性，是LT/CT具有免疫原性和佐剂活性的关键，因而LTB和CTB的佐剂活性越来越受到高度重视。将LTB或CTB与抗原结合在一起免疫动物或人体，可以发挥LTB及CTB的桥梁及锚定作用，有利于激发机体的免疫反应。

发明内容

本发明的目的旨在提供工艺简捷、免疫效果好、成本低、对人无害的融合型幽门螺杆菌粘附素基因工程疫苗的构建及制备方法。

本发明采用了以下的技术路线和步骤：

一、原核表达载体的构建

1.引物设计合成如下(下划线示酶切位点)

根据GenBank公布的Hp HpaA、E.coli LT以及霍乱弧菌基因核苷酸序列设计引物，引入酶切位点。将linker序列设计在上游基因的3’端，同时在需融合的下游基因5’端引入BamHI位点。

LTB    P1      5’    - ccatggctccccagtctattacag-3’(NcoI)

       P2      5’    - ggatcctgcggcgcgtagttttccatactgattgccg-3’(BamHI)

CTB    P3      5’    -cc catgggatgattaaattaaaatttg-3’(NcoI)

       P4      5’    -cg ggatcctgcggcgcgtaaacggtatgattaacgc-3’(BamHI)

HpaA   P5      5’    - ggatcctacgaatgaagtcgctttgaaat-3’(BamHI)

       P6      5’    - Ctcgagtcggtttcttttgcc-3’(XhoI)

分别以大肠杆菌、霍乱弧菌及幽门螺杆菌基因组DNA为模板，用P1和P2扩增LTB基因，用P3和P4扩增CTB基因，用P5和P6扩增HpaA基因。

2.重组质粒的构建

将表达载体与LTB或CTB片段分别进行NcoI和BamHI双酶切回收后，用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒酶切鉴定，用NcoI和BamHI酶切，2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将含LTB或CTB的重组质粒与HpaA进行BamHI和XhoI双酶切回收后，按前述方法连接、转化大肠杆菌，分别采用NcoI+BamHI、BamHI+XhoI、NcoI+XhoI酶切组合进行鉴定。

3.高效表达融合蛋白工程菌的构建及筛选：

将重组工程菌转化大肠杆菌BL21并鉴定后，接种于3mL含Kan的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的工程菌按1％的比例转种于20mL含Kan的LB培养液中，37℃摇床培养，以IPTG诱导，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式和表达量，筛选高效表达菌株。

二、发酵及纯化制备工艺：

(1)发酵：发酵过程中种子菌10％接种，保持70％溶氧、温度37℃、pH 7.0，在A600未达到2时补加补料，之后每3h流加补料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的终浓度分别为0.5％、0.2％和0.2％。在第3次补料后加入IPTG 500μmol/L诱导4h收菌。

(2)包涵体提取：将高效表达的菌体200-500g以TE缓冲液1∶10(W/V)比例混悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀。采用高压均质机在压力为40～70Mpa的条件下破菌(共破菌4～6次)，破菌完毕后，取少量菌液涂片染色，显微镜观察细胞的完整性，确保细胞破碎完全，随后以500g离心25min，弃沉淀，再以15,000g离心40min，弃上清收集沉淀。以1∶10(W/V)的比例分别用洗涤液A和B各洗涤2次。洗涤条件为：4℃搅拌20min，15,000g离心40min，收集包涵体沉淀；最后将包涵体用包涵体溶解液以1∶10(W/V)的比例混合，4℃搅拌3h，15,000g离心45min，取上清作为下一步纯化的原料。

(3)包涵体复性：用8mol/L尿素调整蛋白浓度为10-15mg/ml溶液在80-180分钟内缓慢加入复性缓冲液，4℃平衡48小时，然后用阴离子柱层析缓冲液A透析或经超滤平衡去除复性缓冲液，得到重组蛋白。

(4)阴离子柱纯化：选择阴离子柱进行初级纯化，使用50mmol/L Tris在pH 7.0～9.0条件下对目标蛋白进行纯化，采用NaCl梯度洗脱。

(5)凝胶过滤层析纯化：步骤(4)所获目标蛋白经葡聚糖PEG透析袋内浓缩或超滤浓缩后用凝胶过滤柱纯化，用凝胶过滤平衡缓冲液平衡，收集目标峰。

(6)将纯化所获LTB-HpaA或CTB-HpaA分别制备成液体剂型、冷冻干燥剂型及胶囊剂，供口服、注射或滴(喷)鼻使用。

步骤(1)所述的发酵过程在级联溶氧控制的分批培养的基础上，流加补料。

步骤(1)所述的发酵过程使用培养基为改良M9-CAA培养基，在M9-CAA的基础上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl 2·4H2O、2mg/L CoCl 2·4H2O、4mg/LFeSO4·16H2O、5mg/L H3BO3、1.6mg/L MnCl 2·4H2O、4mg/L CuSO4而成。

步骤(2)所述采用生产或中试纯化中使用的高压破菌技术，破菌至细菌破解率大于98％，差速离心获得包涵体沉淀物。

步骤(2)所述包涵体溶解液使用6～8mol/L尿素或6～7mol/L盐酸胍。

步骤(4)所述阴离子纯化填料为Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL之一。

步骤(5)所述所用凝胶过滤层析柱为Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR10/30之一。

步骤(5)所述将离子交换层析的重组蛋白加入凝胶过滤平衡缓冲液中上柱并洗脱，至紫外吸收峰为零时停止。

步骤(6)中所述液体剂型、冷冻干燥剂型及胶囊剂型的制备方法为：①将纯化所获LTB-HpaA或CTB-HpaA加上5％～20％的蛋白稳定剂甘露醇或果糖或山梨醇，经低温冷冻干燥，或分装入肠溶胶囊口服使用或经纯化水稀释后直接口服；②将纯化所获LTB-HpaA或CTB-HpaA直接无菌过滤分装或加入适当比例(0.1％～0.5％)稳定剂甘露醇混匀，无菌过滤分装，冷冻干燥后待注射使用；③将纯化所获LTB-HpaA或CTB-HpaA加入稳定剂制备为液体滴鼻剂或冷冻干燥后制备为喷鼻剂。

发明效果：通过上述工艺处理不同批次的融合型幽门螺杆菌LTB-HpaA及CTB-HpaA融合蛋白，作12％SDS-PAGE，均呈现单一条带，分子质量分别约为39KD和41KD。HPLCC4柱分析均呈现单一的峰，纯度在95％以上，N端15个氨基酸序列与预期一致。不同批次融合蛋白图谱各峰峰数均保持一致，各峰的保留时间均在±10s内波动，肽图谱重视性好。动物试验证明LTB-HpaA和CTB-HpaA以不同途径和剂型免疫小鼠和沙鼠可有效刺激机体产生较高的免疫应答和免疫预防保护作用。

附图说明

图1rLTB-HpaA纯度分析和UVP扫描曲线

图2rLTB-HpaA纯化标本HPLC纯度检测结果

图3rHpaA-LTB UVP测定相对分子量报告

图4连续三批rLTB-HpaA纯化样品肽图分析结果

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细描述：

实施例一、LTB/HpaA基因工程疫苗的构建及制备方法

一、基因工程菌的构建

1、引物设计与合成

分别以野生型产毒大肠杆菌H44815(购自中国药品生物制品检定所，本室保存)、幽门螺杆菌SS1(Hp悉尼株，澳大利亚Lee A等命名，本室保存)基因组DNA为模板，用P1和P2、P5和P6扩增LTB、HpaA基因，细菌基因组抽提按常规方法(颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南.科学出版社，1998，P39)进行。PCR扩增体系为：10×不含镁离子扩增缓冲液10μL，MgCl₂(25mmol/L)10μL，dNTPs(2.5mmol/Leach)8μL，上下游引物(P1和P2或P5和P6)各2μL，上述LTB基因组2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(3单位/μL)1μL，加灭菌水至100μL。

PCR扩增反应：94℃预变性5min，94℃变性50s，60℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环，72℃完全延伸10min。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。

2.重组质粒的构建

将载体pET28a(购自美国Novagen公司，本室保存)与LTB片段分别进行NcoI和BamHI双酶切回收后，LTB纯化回收产物2μL，载体片段1μL，酶连接缓冲液5μL，加灭菌水至10μL，16℃连接16小时。转化大肠杆菌DH5α，提取质粒酶切鉴定，用NcoI和BamHI酶切，2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果可见，除5kb左右的载体条带，还可看见约320bp的LTB条带，说明LTB已插入了载体(pET28a-LTB)。

将含LTB的重组质粒与HpaA进行BamHI和XhoI双酶切回收后，按前述方法连接、转化大肠杆菌，分别采用NcoI+BamHI、BamHI+XhoI、NcoI+XhoI酶切组合进行鉴定，酶切条带依次为：320bp、690bp、1010bp，与实验设计的酶切片段大小相符。核苷酸序列测定证明重组融合质粒构建成功(pET28a-LTB/HpaA)，核苷酸序列测定采用DNA自动测序仪，在专业DNA测序公司完成。

3.融合蛋白的表达及鉴定

将重组工程菌转化大肠杆菌BL21并鉴定后，接种于3mL Kan+LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20mL Kan+LB培养液中，37℃摇床培养(200r/min)待OD600≈0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L开始诱导，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达。

超声破菌和包涵体洗涤证实融合蛋白LTB-HpaA以包涵体形式表达，表达量约占全菌的25.6％，western blotting显示融合蛋白具有与兔抗Hp、LTB血清发生抗原抗体反应的能力。

二、发酵与纯化

根据本发明构建的融合型幽门螺杆菌粘附素工程菌，通过高密度发酵，目标蛋白表达率为23％，离心收集菌体，将其悬浮于10倍体积的TE缓冲液中，经高压均质破菌后，差速离心收集包涵体，包涵体洗涤后溶解于包涵体溶解液中(1mmol/L EDTA、20mmol/LTris、10mmmol/L DTT、8mol/L尿素pH7.0～9.0)。复性后的样品选择阴离子柱Q SepharoseFF进行初级纯化，使用50mmol/L Tris在pH 7.0～9.0条件下对目标蛋白进行纯化，采用NaCl梯度洗脱，收集目标峰样品经超滤浓缩后用凝胶过滤柱Superdex 75纯化，平衡缓冲液使用50mmol PB，50mmol NaCl和1mmol EDTA pH7.0～9.0收集目标峰。12％SDS-PAGE，目标蛋白呈现单一条带，分子质量约为39KD。HPLC C4柱分析呈现单一的峰，纯度为95.3％。

三、剂型制备

上述方法获得的重蛋白分别被制备成液体剂型、冷冻干燥剂型或胶囊剂。其中液体剂型供口服、滴鼻或注射使用；冷冻干燥剂型加纯化水或注射用水溶解后供口服、滴鼻或注射使用；胶囊剂型供口服使用。液体剂型制备方法为：向纯化所获得的LTB-HpaA中加入适当比例(0.1％～0.5％)的稳定剂甘露醇，混匀，除菌过滤后分装，其中用于滴鼻的液体剂型中还加入1％的卡泊波(carbopol)；冷冻干燥剂型制备方法为：向纯化所获得的LTB-HpaA中加入适当比例(5％～20％)的稳定剂甘露醇(果糖或山梨醇)，混匀，除菌过滤分装后冷冻干燥；胶囊剂型制备方法为：首先向纯化所获得的LTB-HpaA中加入适当比例(5％～20％)的稳定剂甘露醇，混匀，除菌过滤分装后冷冻干燥，再装填入肠溶胶囊。

四、动物试验

将不同剂型LTB-HpaA直接口服、滴鼻或注射免疫BALB/c小鼠，能刺激小鼠产生特异性sIgA分泌，蒙古沙鼠攻毒保护试验证实不同剂型LTB-HpaA能有效诱导沙鼠预防Hp感染，保护率为80％以上。

实施例二、CTB/HpaA基因工程疫苗的构建及制备方法

一、基因工程菌的构建

1、引物设计与合成

分别以大肠杆菌0139(来源于美国典型培养物保藏中心，ATCC31165)、幽门螺杆菌SS1基因组DNA为模板，用P3和P4、P5和P6扩增CTB、HpaA基因，基因组抽提方法同实施例一。PCR扩增体系为：10×不含Mg+离子扩增缓冲液10μL，MgCl2(25mmol/L)10μL，dNTPs(2.5mmol/L each)8μL，上下游引物(P1和P2)各2μL，上述CTB基因组2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(3单位/μL)1μL，加灭菌水至100μL。

PCR扩增反应：94℃预变性5min，94℃变性50s，60℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环，72℃完全延伸10min。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。

2.重组质粒的构建

将载体pET28a与CTB片段分别进行NcoI和BamHI双酶切回收后，LTB纯化回收产物2μL，载体片段1μL，酶连接缓冲液5μL，加灭菌水至10μL，16℃连接16小时。转化大肠杆菌DH5α，提取质粒酶切鉴定，用NcoI和BamHI酶切，2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果可见，除5kb左右的载体条带，还可看见约370bp的LTB条带，说明CTB已插入了载体(pET28a-CTB)。

将含CTB的重组质粒与HpaA进行BamHI和XhoI双酶切回收后，按前述方法连接、转化大肠杆菌，分别采用NcoI+BamHI、BamHI+XhoI、NcoI+XhoI酶切组合进行鉴定，酶切条带依次为：370bp、690bp、1060bp，与实验设计的酶切片段大小相符。核苷酸序列测定证明重组融合质粒构建成功(pET28a-CTB/HpaA)。

3.融合蛋白的表达及鉴定

将重组工程菌转化大肠杆菌BL21并鉴定后，接种于3mL Kan+LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20mL Kan+LB培养液中，37℃摇床培养(200r/min)待OD600≈0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L开始诱导，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达。

超声破菌和包涵体洗涤证实融合蛋白CTB-HpaA以包涵体形式表达，表达量约占全菌的20％，western blotting显示融合蛋白具有与兔抗Hp、CTB血清发生反应的能力。

二、发酵与纯化

根据本发明构建的融合型幽门螺杆菌粘附素工程菌，通过高密度发酵，目标蛋白表达率为20％，离心收集菌体，将其悬浮于10倍体积的TE缓冲液中，经高压均质破菌后，离心收集包涵体，包涵体洗涤后溶解于包涵体溶解液中(1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、10mmmol/L DTT、8mol/L尿素，pH7.0～9.0)。复性后的样品选择阴离子柱Q SepharoseHP进行初级纯化，使用50mmol/L Tris在pH 7.0～9.0条件下对目标蛋白进行纯化，采用NaCl梯度洗脱，收集目标峰样品经超滤浓缩后用凝胶过滤柱Superdex 200纯化，平衡缓冲液使用50mmol PB，50mmol NaCl和1mmol EDTA pH 8.0～9.0收集目标峰。12％SDS-PAGE，目标蛋白呈现单一条带，分子质量约为41KD。HPLC C4柱分析呈现单一的峰，纯度为97.8％。

三、剂型制备

剂型种类及制备方法同实施例一。

四、动物实验

将不同剂型CTB-HpaA直接口服、滴鼻或注射免疫BALB/c小鼠，能刺激小鼠产生特异性sIgA分泌，蒙古沙鼠攻毒保护试验证实不同剂型CTB-HpaA能有效诱导沙鼠预防Hp感染，保护率为80％以上。

以下是工艺所涉及的溶液配方以及发明效果的检测：

(一)工艺所涉及的溶液配方：

1.TE缓冲液：50mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 7.5-9.0。

2.包涵体洗涤液A：5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH 8.5

3.包涵体洗涤液B：20mmol/LTris、2mol/L Urea，pH 8.5

4.包涵体溶解液：1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、10mmmol/L DTT、8mol/LUrea(pH 8.5)或6～7mol/L盐酸胍。

5.复性缓冲液：2mol/L Urea，Tris-HCl，50mmol/L NaCl pH8.5

6.阴离子柱层析缓冲液A：50mmol/L Tris，pH 7.0～9.0

7.阴离子柱层析缓冲液B：50mmol/L Tris，pH 7.0～9.0

8.凝胶过滤平衡缓冲液：50mmol NaH₂PO₄，50mmol NaCl和1mmol EDTA pH7.0～9.0

(二)发明效果的检测

1.层析样品的纯度分析

①SDS-PAGE分析：参见附图1，采用12％SDS-PAGE分析，电泳后进行CBB染色。以UVP凝胶扫描分析仪分析目标蛋白的纯度。按常规方法制备12％SDS-PAGE胶(分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度5％)，样品处理及电泳方法也按常规操作进行，电泳时加蛋白分子量标准。以UVP凝胶成像系统进行扫描分析，rHpaA-LTB蛋白纯度为96.8％。

②HPLC纯度分析：

纯化后的目标蛋白经SephadexG-25凝胶柱脱盐复性处理，样品置透析袋内，HPLC流动相buffer(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0)透析置换缓冲液，Lowry法测定蛋白质含量后调整蛋白浓度为1mg/ml进行HPLC蛋白纯度分析，分析条件如下：

(1)色谱柱：OHpak SB-805HQ凝胶过滤柱，8.0mm I.D.×300mm；

(2)流动相：20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0；

(3)柱温：25℃；

(4)流速：0.3ml/min；

(5)洗脱时间：40min；

(6)检测波长：280nm；

(7)上样量：10μl；

结果HPLC C4柱分析呈现单一的峰，纯化后目标蛋白rLTB-HpaA纯度为96.3％，参见附图2。

2.相对分子量测定：

蛋白样品处理同前所述，目标蛋白上样量控制在2～5ug，低分子量蛋白标准LMW作为参比，15％SDS-PAGE分析，电泳后进行CBB染色。UVP凝胶扫描分析仪分析其相对分子量，测得rLTB-HpaA相对分子量为38.531KD，参见附图3。

3.HPLC肽图分析

连续三批次纯化样品，分别经胰蛋白酶酶解后进行HPLC肽图分析比较。

①色谱条件：

A.色谱柱：Zorbax 300SB-C18，5μm，4.6mm I.D.×150mm

B.保护柱：Zorbax 300SB-C18，5μm，4.6mm I.D.×12.5mm

C.流动相：A相    1000ml超纯水(含1％三氟乙酸)

          B相    1000ml乙腈(含0.9％1三氟乙酸)

D.柱温：30℃

E.检测波长：210nm

F.流速：1.0ml/min

G.洗脱梯度：B相0-65％(40min)

H.进样量：100μl

②酶解条件：

处理过(除去尿素、EDTA)的样品1ml加入20μl胰蛋白酶溶液，37℃保温10h，加入10μl三氟乙酸终止反应，经0.45μm孔径滤膜过滤待用，同时做空白对照。

结果，在确定的酶解条件和色谱条件下，不同批次的rLTB-HpaA(批号为：20021107、20021126、20021208)得到的肽图谱各峰峰数均保持一致。不同批次融合蛋白图谱各峰峰数均保持一致，各峰的保留时间均在±10s内波动，肽图谱重视性好，参见附图4。

4.动物实验

①BALB/c小鼠免疫后特异性免疫应答

小鼠经不同剂型rLTB-HpaA、rCTB-HpaA免疫后30天处死采取血液、胃冲洗液和肠冲洗液。用ELISA方法检测针对粘附素rHpaA的特异性抗体。不同剂型的融合蛋白rLTB-HpaA组、rCTB-HpaA组及将CT和LTB作为外粘膜佐剂的CT+HpaA组和LTB+HpaA组中血清标本、胃冲洗液和肠冲洗液中IgA和IgG含量明显高于单独HpaA组和缓冲液对照组，差异非常显著(P＜0.01)。

②蒙古沙鼠口服免疫攻毒保护实验

将不同剂型rLTB-HpaA、rCTB-HpaA免疫(第1、2、4周各免疫1次)沙鼠，末次免疫后9天，以幽门螺杆菌标准菌株SS1株攻毒，攻毒后2周剖杀动物，进行细菌培养和病理切片检查。结果对照组感染率为100％，各组接种保护率80％以上。

Claims (9)

1.一种融合型幽门螺杆菌粘附素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：

首先克隆LTB或CTB、HpaA基因，克隆LTB、CTB、HpaA基因的引物为：

LTB      P1      5’- ccatggctccccagtctattacag-3’(NcoI)

         P2      5’- ggatcctgcggcgcgtagttttccatactgattgccg-3’(BamHI)

CTB      P3      5’-cc catgggatgattaaattaaaatttg-3’(NcoI)

         P4      5’-cg ggatcctgcggcgcgtaaacggtatgattaacgc-3’(BamHI)

HpaA     P5      5’- ggatcctacgaatgaagtcgctttgaaat-3’(BamHI)

         P6      5’- ctcgagtcggtttcttttgcc-3’(XhoI)

下划线部分为酶切位点；在上游基因LTB和CTB的3’端，即在引物P2和P4上设计linker序列，连接LTB和HpaA，或CTB和HpaA，构建LTB-HpaA或CTB-HpaA融合表达载体和高效表达菌株；

然后，用发酵方式高密度表达融合蛋白；

最后，采用包涵体提取，复性，离子交换层析、凝胶过滤层析纯化技术的顺序组合，大量获得LTB-HpaA或CTB-HpaA，并将该疫苗分别制备成口服剂、注射剂及滴/喷鼻剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：构建融合LTB-HpaA或CTB-HpaA表达载体和高效表达菌株的步骤是：先将LTB或CTB与表达质粒连接后，再与HpaA基因连接，转化大肠杆菌，经酶切、测序分析得到含有LTB-HpaA和CTB-HpaA的重组表达质粒。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是其发酵、纯化包括下述顺序的步骤：

(1)发酵：发酵过程中种子菌10％接种，保持70％溶氧、温度37℃、pH 7.0，在A600未达到2时不加补料，之后每3h流加补料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的终浓度分别为0.5％、0.2％和0.2％，在第3次补料后加入IPTG 500μmol/L诱导4h收菌；

(2)包涵体提取：将高效表达的菌体200-500g以TE缓冲液按1∶10(W/V)比例混悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀，采用高压均质机破菌4～6次，差速离心获得包涵体沉淀。包涵体沉淀用包涵体洗涤液A、B各洗涤2次后溶解于包涵体溶解液中；

(3)包涵体复性：将8mol/L尿素液调整蛋白浓度为10-15mg/ml溶液在80-180分钟内缓慢加入复性缓冲液中，4℃搅拌48小时，然后用阴离子柱层析缓冲液A透析或经超滤平衡去除复性缓冲液，得到重组蛋白；

(4)阴离子柱纯化：选择阴离子柱进行初级纯化，使用50mmol/L Tris在pH 7.0～9.0条件下对目标蛋白进行纯化，采用NaCl梯度洗脱；

(5)Superdex凝胶过滤层析纯化：步骤(4)所获目标蛋白经葡聚糖PEG透析袋内浓缩或超滤浓缩后用凝胶过滤柱Superdex纯化，用凝胶过滤平衡缓冲液平衡。

4.如权利要求3中所述制备方法，其特征在于步骤(1)所述的发酵过程在级联溶氧控制的分批培养的基础上，流加补料；发酵过程使用培养基为改良M9-CAA培养基。

5.如权利要求3中所述制备方法，其特征在于步骤(2)所述采用生产或中试纯化中使用的高压破菌技术，破菌至细菌破解率大于98％，差速离心获得包涵体沉淀物；包涵体溶解液使用6～8mol/L尿素或6～7mol/L盐酸胍。

6.如权利要求3中所述制备方法，其特征在于步骤(4)所述阴离子纯化填料为QSepharose HP、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL之一；步骤(5)所述所用凝胶过滤层析柱为Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR 10/30之一，将离子交换层析的重组蛋白加入凝胶过滤平衡缓冲液中上柱并洗脱，至紫外吸收值为零时停止。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：将纯化所获LTB-HpaA或CTB-HpaA加上蛋白稳定剂，经低温冷冻干燥，或分装入肠溶胶囊制备为口服剂。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：将纯化所获LTB-HpaA或CTB-HpaA直接无菌过滤分装或加入适当比例稳定剂混匀，无菌过滤分装，冷冻干燥制备为注射剂。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：将纯化所获LTB-HpaA或CTB-HpaA加入稳定剂制为液体滴鼻剂或冷冻干燥后制备为喷鼻剂。

Images