CN1189103A - 改进的病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

改进的哺乳动物病毒疫苗是组合物,该组合物包括致免疫量的灭活病毒(如流感病毒、水痘疱疹病毒、麻疹病毒、Epstein Barr病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感3型病毒、单纯性疱疹1型病毒和单纯性疱疹2型病毒)和致免疫量的源自病毒的纯化的重组包膜蛋白或该蛋白的片段或前体。另外,所述的疫苗可包括灭活病毒和/或包膜蛋白抗原和佐剂如粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子。一种流感疫苗是通过将灭活病毒(优选为三株病毒)和血细胞凝集素(优选为所述的三株病毒的各自的血细胞凝集素)混合而制得的。另一种流感疫苗是通过将灭活病毒(优选为三株病毒)和神经氨糖酸苷酶(优选为所述的三株病毒的各自的神经氨糖酸苷酶)混合而制得的。在第三种实施方案中,疫苗含有灭活病毒和血细胞凝集素和神经氨糖酸苷酶,优选各使用三株。粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子可任意地加入到这些疫苗中。

Description

改进的病毒疫苗
技术领域
本发明涉及针对流感、疱疹病毒等的改进的病毒疫苗。
背景技术
免疫是现代医学防治传染病的最成功和最经济有效的手段之一。通过接种，天花已被彻底消灭；其它致死性疾病如脊髓灰质炎和白喉的发病率通过免疫计划也被极大地降低了。然而，疫苗特别是那些基于采用灭活病毒的疫苗的效果有差异。例如，虽然据报告目前已获准的流感疫苗对青年成人的效果超过80％，但它对65岁以上的成人的效果只有约60％，对不足2岁的幼儿的效果低于50％。据报告，最近已获准的水痘疫苗的效果为将近70％，但目前还没有预防许多重要疾病的有效疫苗，所述的疾病包括那些由呼吸道合胞体病毒、副流感3型病毒、轮状病毒和人免疫缺陷病毒引起的疾病。在某些情况下，已获准的灭活病毒疫苗可能会产生副作用，所述的副作用妨碍了它们以较高的剂量使用来改善效果。
灭活病毒疫苗通过刺激对游离病毒的蛋白产生应答而提供保护。在与病毒接触后，抗游离病毒的成熟包膜蛋白的抗体在防止感染发生的起初阶段(例如病毒与细胞受体结合、附着和进入细胞内)可能是最有效的，但一旦病毒进入到细胞内部，该抗体则可能是次最有效的。一旦感染发生了，细胞和细胞结合的成熟病毒粒子则含有成熟包膜蛋白的前体。当身体的第一道防线——抗游离病毒的抗体没能完全防止所有的病毒侵染细胞的时侯，这些前体蛋白能刺激防止感染进一步扩散和预防临床疾病发生的更加有效的应答。
一般由在动物细胞(如生产流感病毒的鸡胚)中生长的病毒来生产灭活病毒疫苗，通过化学试剂如福尔马林的处理来灭活在细胞中生长的病毒。通过在细胞培养物中培养弱化病毒来生产麻疹和水痘的减毒疫苗。对病毒感染致病机理的进一步的理解和DNA重组技术，导致了用于亚单位病毒疫苗的特异病毒蛋白的鉴定和产生。这些在抗乙型肝炎病毒的亚单位疫苗的制备中特别成功。现存的绝大多数已获准的疫苗和正在研制中的疫苗，无论是基于灭活的病毒还是基于DNA重组技术，它们大都依赖于对成熟病毒的免疫应答；而在极少数的实验中，基于重组DNA的疫苗依赖于对细胞结合形式的病毒抗原或被病毒侵染细胞的免疫应答。尽管灭活病毒和减毒病毒在一方面有了进展而重组DNA在另一方面有了进展，但它们有其有利的一面，也有其局限的一面。虽然细胞培养和鸡胚法用来生长完整的病毒极其便宜，但它们并不是工业生产在被感染的细胞中发现的和细胞结合形式的病毒的病毒前体蛋白的极有效的方法。这是因为这些方法像小型装配流水线，在任何给定的时间，虽然在细胞培养物中或鸡胚中积有大量的成熟病毒，但实际上在装配过程中的病毒却是很少量的。因此，用来制备疫苗的经纯化的病毒含有极少的(如果有的话)包膜前体或其它前体蛋白。另一方面，病毒膜糖蛋白无论以其成熟形式还是以其前体形式均可通过DNA重组技术来有效地制备。当需要天然的构象结构来产生有功能的中性的抗体时，优选采用运用哺乳动物细胞或昆虫细胞的重组技术。然而，通过重组技术在昆虫或哺乳动物细胞中制备病毒疫苗蛋白，以每毫克蛋白计通常比细胞培养和鸡胚生产方法要昂贵些。
疫苗的副作用起因于不纯或起因于导致保护性免疫产生的疫苗蛋白(抗原)的生物学特性。例如，存在于已获准的流感疫苗中的鸡胚污染蛋白可能是这些产品所产生的副作用的主要原因。采用高度纯化的重组亚单位蛋白疫苗，这种副作用可被减少或消除。
存在于疫苗中的成熟病毒蛋白可能具有导致副作用的生物学特性。由血细胞凝集素介导的单核细胞和粒细胞对灭活流感病毒的内吞作用也可能导致副作用的产生。某些抗HIV的实验疫苗中的成熟HIV包膜糖蛋白(gp120)可能与T4淋巴细胞的CD4受体结合并使正常的免疫功能改变。在疫苗的制备中，人们希望通过采用各自的前体蛋白或通过其他途径减少潜在的副作用，如在流感疫苗中采用HA0、在HIV疫苗中采用gp160。
灭活病毒疫苗中的病毒包膜蛋白是基本上被糖基化了的。虽然糖基化对于维持这些蛋白的构象结构很重要，但它也有可能使免疫原性降低。这些蛋白无论是其成熟形式还是其前体形式，均可在培养的昆虫细胞中采用重组的杆状病毒表达载体用经修饰的糖残基来产生。杆状病毒产生的蛋白保留了足以刺激有功能的中和抗体产生的天然构象，并会提供比高度糖基化的天然蛋白更强的免疫原性。
流感病毒的感染引起世界范围内的多种疾病和夭折。用由灭活流感病毒制备的疫苗进行免疫是目前减少由病毒性流感引起的疾病的最有用的方法。这些灭活的疫苗已通过世界各地制定规章的机构的核准。它们通过刺激对血细胞凝集素(HA)、神经氨糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP、M1)以及还可能对成份株系的其他蛋白产生免疫应答而赋予抗感染和防止疾病的保护作用(Murphy，B.R.等人，新英格兰医学杂志，268：1329-1332(1972)和Kendal，A.P.等人，传染病杂志，136：S415-24(1986))。这些当中最重要的是抗HA的中和抗体的产生(Ada，G.I.和Jones，P.D.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.128：1-54(1986))。然而，目前可得到的灭活疫苗有局限性，包括免疫原性不够最好以及在65岁以上的成人和很年幼的孩童中的效果不是最佳，由于认为这些疫苗不是极为有效并且害怕副作用，这些疫苗难以被部分患者接受从而未得到充分利用(Nichol，K.L.等人，Arch.Int.Med.152：106-110(1992))。效果的缺乏部分起因于一年年功效的不同并和伴随流感的非流感呼吸道疾病有关。
成熟的流感病毒在其包膜蛋白中含有HA和NA两种蛋白。每个HA单体由两条多肽(HA1和HA2)组成，所述的两条多肽由二硫键联结。这些多肽来源于在流感病毒成熟过程中一个前体蛋白HA0的断裂。部分因为这些分子是紧密折叠的，HA0与成熟的HA1和HA2在构象和抗原特性方面的差异很小。而且，HA0更为稳定并且难以变性和被蛋白酶解。最近有人报导，杆状病毒/昆虫细胞培养产生的重组HA0赋予抵抗流感的保护性免疫(Winkinson，B.，MicroGeneSysRecombinanat Influenza Vaccine，PMA/CBER病毒性流感大会，1994年12月8日)。重组HA0疫苗的一个局限是，它不能刺激对可提供更强更持久保护的非-HA抗原的免疫应答，特别是对于对免疫应答得不好的那些高危人群而言。
提供改进的病毒疫苗制剂是人们所希望的，使该制剂不再存在采用目前可得疫苗时所观察到的许多局限和缺点。
本发明的一个目的在于提供防止病毒性传染如流感、水痘、麻疹、呼吸道合胞体病毒、传染性单核细胞增多症和单纯性疱疹的改进疫苗，该疫苗较目前可得的疫苗其功效和安全性均有提高。
本发明的另一目的在于提供能提供更强更持久保护(特别是对于免疫应答不好的那些高危人群而言)的病毒疫苗。
本发明的又一而更加具体的目的在于提供对游离病毒和细胞结合病毒均能产生最佳免疫应答的疫苗，提供更好的保护以抗传染和疾病。
本发明的再一具体的目的在于供改进的流感疫苗。
本发明概述
包含至少两种组份：灭活病毒、来源于该灭活病毒的重组包膜蛋白和佐剂的混合疫苗及其使用方法。该疫苗组合物一般包含致免疫量的灭活病毒(如流感病毒、水痘疱疹病毒、麻疹病毒、Epstein Barr病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感3型病毒、单纯性疱疹1型病毒和单纯性疱疹2型病毒)和致免疫量的源自该病毒的经纯化的重组包膜蛋白或该蛋白的片段或前体。
优选的佐剂是集落刺激生长因子。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在某些实施方案中是特别优选的。
改进的流感病毒疫苗一般含有灭活病毒和重组血细胞凝集素、重组神经氨糖酸苷酶或其混合物。在一个实施方案中，人用的改进流感病毒疫苗组合物含有三株灭活病毒和源自所述的三株灭活病毒中的至少一株(优选源自所述三株灭活病毒的各株)的重组血细胞凝集素。在另一个实施方案中，改进流感病毒疫苗含有三株灭活病毒和源自所述的三株灭活病毒中的至少一株(优选源自所述三株灭活病毒的各株)的重组神经氨糖酸苷酶。某些流感疫苗含有血细胞凝集素和神经氨糖酸苷酶。在这些实施方案中，优选含有三株病毒和至少两种(优选两种到六种)相应的包膜蛋白或其片段或前体。
其他的疫苗包括灭活的pstein Barr病毒和重组病毒gp340包膜蛋白；灭活呼吸道合胞体病毒和重组病毒包膜F蛋白、G蛋白和/或FG聚蛋白；灭活的副流感3型病毒和重组病毒包膜F蛋白、HA蛋白和/或F/HA聚蛋白；灭活麻疹病毒和重组病毒包膜F蛋白、HA蛋白和/或F/HA聚蛋白；灭活的单纯性疱疹1型病毒和重组病毒包膜糖蛋白D；灭活的单纯性疱疹2型病毒和重组病毒包膜糖蛋白D。
改进的人用水痘疫苗含有减毒的水痘疱疹病毒和重组的水痘疱疹包膜糖蛋白D。
本发明的详细描述
疫苗组份
通过混合下列组份中的至少两种来制备疫苗：源自游离病毒的抗原、源自细胞结合病毒的前体蛋白的抗原、佐剂。所述的抗原可由包括采用病毒感染的细胞(细胞培养或鸡胚)在内的各种方法或通过重组DNA技术来生产，所述的重组DNA技术包括活的重组载体(牛痘)或重组亚单位蛋白(杆状病毒/昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母或细菌)。
哺乳动物病毒疫苗组合物包括至少两种组份：致免疫量的灭活或减毒的病毒、有效量的佐剂、致免疫量的纯化的重组包膜蛋白或其片段或前体。可制备抗病毒如流感病毒、麻疹病毒、水痘病毒、Epstein Barr病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感3型病毒、单纯性疱疹1型病毒和单纯性疱疹2型病毒的疫苗。
重组抗原的表达系统
采用任何现已建立的表达系统如细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞培养物，可重组制备病毒包膜和包膜前体蛋白(“VEP”)。本文所用的术语“重组(的)”是指采用任何熟知的核酸操作方法产生的任何蛋白或核酸，这些蛋白或核酸的例子将述于下文。这里所述的由核酸操作产生的核酸产生或表达得到的任何蛋白或核酸就是重组产生的蛋白或核酸。
用来产生VEP的DNA可以是基因组DNA，在这种情况下该DNA可包含内含子；或者是采用反转录酶在体外制备的含有可读框的cDNA。分离、克隆或合成DNA和cDNA的方法是本领域的技术人员所熟知的。表达是指核酸被转录和转译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果该核酸来自基因组DNA，表达可包括mRNA的剪接和随后的糖基化作用，如果选择了适当的真核宿主细胞或生物的话。表达载体是指重组的DNA或RNA构建体如质粒、噬菌体、重组的病毒或其他载体；当被导入适当的宿主细胞后，所述的载体引起已被克隆进载体中的核酸分子的转录，然后使转录出的核酸转译成多肽。以可操作地与调控序列连接的方式，将核酸分子克隆到载体内，所述的调控序列影响异源核酸的表达。在选定的宿主细胞或生物体内表达后，如果有适当的调控序列可操作地与该DNA连接或者被包含在异源DNA内的话，表达产物有可能被转运到细胞质中和/或被分泌到细胞外。
适当的表达载体是本领域的技术人员所熟知的，并包括那些在真核细胞和/或原核细胞中能够复制的载体。这样的载体可以附加体的形式存在，也可整合到宿主细胞基因组中。
在各种情况下，所述的VEP cDNA或基因均可插入到含有表达调控元件的适当的表达载体中，所述的表达调控元件为(例如)转录起始信号、转译起始信号、起始密码子、终止密码子、转录终止信号、多聚腺苷酸化信号等等。合适的载体可从许多公司购得。当含有VEP-编码DNA的重组载体转染进宿主细胞后，该重组载体或者以染色体外DNA的形式存在，或者它们可被整合到宿主基因组中。在每一种情况下，它们都能指导重组VEP在宿主细胞中的合成。一些异源基因表达的例子被描述于《酶学的方法》第153卷、第23--34章(Wu和Grossman编辑，Academic出版社，1987)。合成VEP的宿主细胞的大规模培养和该蛋白的纯化可形成成本有效的生产VEP的商业方法。大规模生产蛋白的方法是本领域的技术人员所熟知的。对重组表达VEP有用的许多方法和试剂被描述于The 1995 Lab Manual Source Book(冷泉港实验室出版社，纽约，1995)。
一些可能有用的VEP表达系统的例子包括(但不限于)采用大肠杆菌或其他细菌作为宿主的那些系统。许多哺乳动物的cDNA已在大肠杆菌中表达，而且许多具有不同的启动子、操纵基因和其他调控元件的表达载体是可商购的。Lin和Tang在J.Biol.Chem.264：4482--4489(1989)中描述了一般载体的构建和表达。一些真核蛋白在大肠杆菌的胞液中的表达产生不溶性的内涵体，并需要重组蛋白的再折叠。然而，引导序列如omp(由Duffaud等人描述于《酶学中的方法》153：492--506(Wu和Grossman编辑，Academic出版社，1987))的使用会引导适当的折叠，而且还会将重组的VEP运到细菌的周质腔中。
另外，酵母可用作宿主。重组的VEP在酵母中表达的原则与在大肠杆菌中的相似。由Bitter等人在《酶学中的方法》153：492--506(Wu和Grossman编辑，Academic出版社，1987)中给出了这方面的例子。象大肠杆菌一样，酵母宿主细胞可在胞液中表达外源基因或者将外源基因表达成分泌蛋白。与大肠杆菌不一样的是，在酵母中的分泌表达不能糖基化。
真菌也可用作宿主。已有少量的真菌表达载体成功地用来表达异源基因。如Cullen等人在A Survey of Molecular Cloning Vectorsand their Uses(Butterworth出版社，Stoneham，MA1986)中指出的，现存的真菌表达载体在转染后会整合到宿主的基因组中。当在表达蛋白的密码子之前存在引导序列时，分泌的重组蛋白可被糖基化。一些成功表达的例子包括牛凝乳酶(由Cullen等人描述于Bio/Technology 5：369--378(1987))和来自不同真菌的酸性蛋白酶(由Gray等人描述于：基因8：41-53(198))。
昆虫细胞可被用作宿主，并且在某些实施方案中是优选的。用于在昆虫细胞中合成外源基因的杆状病毒表达载体已被成功地用于表达许多真核蛋白和病毒蛋白。该系统能够进行糖基化，也能高水平地表达重组蛋白。该系统的用途已由Luckow和Summer详细综述于1987年9月11日的Bio/Technology，由Luckow综述于the LaboratoryManual for Baculovirus Expression System(1994)。重组的VEP还可采用其他的表达载体如昆虫痘(Entomopox)病毒和细胞质多角体病病毒(CPV)在昆虫细胞中表达。
最后，哺乳动物细胞可用作宿主。许多异源基因已以商业规模在哺乳动物细胞中表达。重组的人组织血纤维蛋白溶酶源活化因子的商业化生产就是个例子。这些表达载体中的大多数含有：1)或者为哺乳动物启动子如金属花青苷或生长激素启动子，或者为病毒启动子如SV40早期启动子和病毒基因的长末端重复；2)多聚腺苷酸化信号；和3)包括抗生素抗性基因在内的用于克隆大肠杆菌的适当的调控元件。在将VEP基因插在启动子的下游之后，可将该载体首先克隆进大肠杆菌，然后分离和转染到哺乳动物细胞中。新霉素或类似的抗性选择标记可用另一载体共转染或用同一载体转染。对于高水平的表达，基因扩增系统是有利的。例如，所述的表达载体可含有编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的基因。当使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的dhrf品系时，通过使转化的细胞适应增高的氨甲喋呤浓度，克隆的基因可与二氢叶酸还原酶基因一起共扩增。凭借酶测定或蛋白质(Western)印迹，分泌VEP的转化克隆可被鉴定出来。这方面成功的例子包括重组的前凝乳酶和人免疫干扰素的合成，前者由Poorman等人描述于Proteins 1：139-145(1986)，后者由Scahill等人描述于Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.80：4654--4658(1983)。
纯化重组VEP的方法是人们所熟知的，并且一般可分为色谱法如离子交换色谱、分子筛分离、高压液相色谱、亲合色谱和电泳法如琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦。这些方法中的任何一种均可用来纯化VEP。
优选的纯化方法是亲合色谱法。在亲合色谱法中，抗VEP的抗体被固定在色谱基质上，含有VEP的混合物在允许抗体与VEP结合的条件下被施用到基质中，未结合的物质通过洗涤而被除去，采用如高或低pH的蛋白质变性剂或离液序列高的物质(chaotropes)，将结合的VEP洗脱下来。
例如，采用如下文描述的与琼脂糖珠共价结合的固定抗体或通过羊-抗鼠IgM抗体与金黄色酿脓葡萄球菌G蛋白珠非共价结合的固定抗体中的一种或其组合，通过亲合色谱可纯化VEP。例如，通过将细胞提取物与抗-VEP的抗体温育，还可实现VEP的分离，所述的抗-VEP抗体如下文所述附着于固相上，如与琼脂糖珠化学轭合连接。温育后，洗涤该琼脂糖珠，将蛋白质变性并在聚丙烯酰胺凝胶上分离之。
为了制备疫苗，将VEP或致免疫的VEP片段和各自的灭活病毒配合，如上所述，所述的VEP来源于所述的灭活病毒。采用疫苗领域的技术人员已知的方法和材料，可配制和包装灭活病毒和VEP组合的制剂，这方面的例子将述于下文。如本文所用，蛋白质的致免疫片段是指在动物或人体中产生免疫应答的具有至少5-8个氨基酸的蛋白质片段，一般少于100个氨基酸，通常少于25-40个氨基酸。
佐剂
可任意地使用佐剂，在某些实施方案中佐剂是优选的。上述的组合疫苗可以和有效量的佐剂配合使用，以增强免疫应答。在人中广泛使用的常见佐剂是明矾、磷酸铝或氢氧化铝。皂苷及其纯化的组份QuilA、弗洛因德完全佐剂和其他在研究和兽医应用方面使用的佐剂具有毒性，限制了他们在人疫苗中的可能应用。也可使用化学限定的制剂如胞壁酰基二肽、单磷酰基类脂A和磷脂共轭物如Goodman-Snitkoff等人在J.Immunol.147：410-415(1995)(该文献引入本文做参考)描述的那些。
关于口服施用，人们知道痕量的霍乱毒素(CT)或者霍乱毒素亚单位A或霍乱毒素亚单位B或者其二者以及第二抗原的混合物刺激粘膜对共同施给的抗原产生免疫。而且，对第二抗原有极强的体液免疫应答，而没有单独口服该抗原时产生的免疫耐受。因此，粘膜传递的CT起到了粘膜和体液免疫强有力的免疫刺激剂或佐剂的作用。因此，优选将CT包括在疫苗中来增强口服施给抗原的免疫原性。
关于胃肠外施用，佐剂包括胞壁酰基二肽、胞壁酰基三肽、细胞因子、白喉类毒素和外毒素A。可自市售购得的佐剂包括可从CambridgeBiosciences(Worcester，WA)  购得的QS-21和可从RibiImmunochem.购得的单磷脂酰类脂A(MPLA)。
一组被称为集落刺激因子的生长因子也可用作佐剂，所述的集落刺激因子支持造血干细胞的存活、集落扩增和分化。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是这组的成员，并诱导部分的原母(progenitor)细胞分裂并按粒细胞-巨噬细胞的途径分化。GM-CSF还能活化成熟的粒细胞和巨噬细胞。各种细胞的应答(即分裂、成熟、活化)是通过GM-CSF与在靶细胞表面表达的特异性受体的结合来诱导的。重组形式的GM-CSF可从Immunex公司(Seattle，WA)购得，它以LEUKINE为商品名出售。LEUKINE是127个氨基酸的糖蛋白，其特征在于有3个主要的分子，分子量分别为19500、15800和15500道尔顿。LEUKINE的氨基酸序列不同于天然的人GM-CSF，它在第23位为一亮氨酸的取代，而且其糖基部分也可能不同于天然的蛋白质(LEUKINE Product Insert，Immunex公司，1992)。
GM-CSF过去一直用来使患有非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)和何杰金氏病进行了自体骨髓移植(BMT)的患者加快髓样组织的恢复。患有NHL、ALL或何杰金氏病的患者进行了自体骨髓移植后，已经发现GM-CSF可安全有效地加速骨髓移入物的恢复、缩短施给抗生素的持续时间、减少感染发作的持续时间以及缩短住院的时间。最近已经发现，当GM-CSF和重组癌胚(carcinoembyonic)抗原(rCEA)一起施给癌症患者时，对rCEA的免疫应答明显强于患者只接受rCEA时的免疫应答。在科技文献中已经报道过，肿瘤细胞可被转化为表达GM-CSF。实验动物对这些转化细胞的免疫应答强于对非-GM-CSF转化细胞的应答。
可从Immunex公司购得的GM-CSF是无菌的白色的不含防腐剂的冻干粉，在用注射用的1ml的无菌水(美国药典)对其重建后，该GM-CSF用于静脉内的输注。该重建的等渗溶液的pH为7.4±0.3。在常规的人骨髓集落测验中，LEUKINE的特异性活性为约5×107集落形成单位/毫克。当用作佐剂时，LEUKINE可用无菌水或疫苗制剂重建。如果是用水重建，则通过在疫苗免疫的同一部位肌内注射施给LEUKINE；或者先与疫苗制剂混合。然后，用疫苗制剂直接重建GM-CSF或者通过将用水重建的GM-CSF和疫苗混合得到的疫苗/GM-CSF混合物，通过肌内、皮下或真皮内注射施给。一次使用的每一小瓶LEUKINE含有250微克或500微克的源自酵母的重组人GM-CSF。
在以前的组合病毒疫苗的各实施例中，疫苗的配方通过加入有效量的GM-CSF而得到进一步的改进，以提高免疫原性。这是通过用1毫升上述的组合疫苗制剂对一瓶500微克的GM-CSF的重建来实现的。或者，一瓶500微克的GM-CSF可用1毫升的无菌水重建，并将0.5ml该重建的GM-CSF和0.5ml的组合疫苗制剂混合。
GM-CSF还可用作灭活病毒疫苗和不含VEP的减毒病毒疫苗的佐剂。可将有效量的GM-CSF如上文加入到可自市售购得的用于预防病毒性流感的灭活疫苗中，以提高免疫原性。这对于幼童和65岁或更老的成人而言尤其重要。有效量的GM-CSF可加入到可自市售购得的用于预防水痘疱疹的疫苗中，以改善功效。这对于患有白血病的儿童而言特别重要，这种感染对于该儿童是致命的。一瓶500微克的GM-CSF可用1毫升市售的流感病毒疫苗或者1毫升市售的水痘疱疹疫苗来重建。或者，一瓶500微克的GM-CSF可用1毫升的无菌水重建，并将0.5ml该重建的GM-CSF和0.5ml市售的流感病毒疫苗或者0.5毫升市售的水痘疱疹疫苗混合。
GM-CSF还可用作已获准的乙型肝炎疫苗(包括重组的和非重组形式的疫苗)的佐剂。这对于50岁以上的成人特别重要，因为该已获准的乙型肝炎疫苗在年长的成人中的功效较低。以GM-CSF作为佐剂的乙型肝炎疫苗还可用于治疗被乙型肝炎病毒感染的个体。
GM-CSF也可与重组的病毒膜蛋白如流感HA0抗原一起用作佐剂。如下文的实施例所述，有效量的重组HA0可通过直接重建或者通过与用水重建的GM-CSF混合(如上文所述)而加入到GM-CSF中。对于大多数人，含有10微克HA0和100微克GM-CSF的疫苗提供了改进的保护。对于幼童和65岁以上的成人，含有50微克HA0和250微克GM-CSF的疫苗提供了改进的保护。
GM-CSF也可与来源于各种病毒的重组的VEP一起用作佐剂，以产生日前还不能自市售购得的疫苗。这些包括用有效量的GM-CSF配合有效量的HIV gp160和/或gp120蛋白产生AIDS疫苗，用有效量的GM-CSF配合有效量的呼吸道合胞体病毒F蛋白和/或G蛋白，用有效量的GM-CSF配合有效量的副流感3型病毒F蛋白和/或HA蛋白，用有效量的GM-CSF配合有效量的麻疹病毒F蛋白和/或HA蛋白，以及用有效量的GM-CSF配合有效量的麻疹病毒的糖蛋白D。在有关麻疹病毒的情况下，GM-CSF佐剂在预防和治疗疫苗中均可使用。
GM-CSF还可与自身抗原配合使用。人绒毛膜促性腺素(HCG)的α亚单位其本身和在各种配方(包括与白喉类毒素共轭连接的HCGα亚单位和用佐剂MDP微胶囊包装的HCG的α亚单位)作为潜在的避孕剂苗(vaccine)已被广泛地测试过。然而，在人中还需要更高的免疫原性。这一点通过采用有效量的GM-CSF与有效量的与白喉类毒素载体共轭连接的HCGα亚单位的配合或者与有效量的含有HCGα亚单位和白喉类毒素的聚蛋白的配合来实现。其他的作为避孕剂苗来研究过的自身抗原是HP-20和HP-30分子。要使该方法有效需要大量的抗体。这一点通过采用有效量的GM-CSF和有效量的HP-20和HP-30蛋白的配合来实现。
GM-CSF一般用来改善许多疫苗的效果和可靠性，所述的疫苗包括可自市售购得的预防流感嗜血杆菌的多糖和共轭连接的多糖疫苗。这对于两岁以下的对可自市售购得的疫苗不能产生可靠应答的幼童而言特别重要。
GM-CSF还可用来改善对源自传染源的抗原的免疫应答，所述的传染源引起慢性寄生虫性疾病包括疟疾、梅毒、钩虫病和血吸虫病。因为这些寄生虫必须在宿主内停留一段时间，它们进化的途径使它们对宿主的免疫原性降低。例如，重组的恶性疟原虫circumsporozooite抗原在实验动物中具有很高的免疫原性，但在人中不致免疫。有效量的GM-CSF和有效量的恶性疟原虫circumsporozooite抗原的配合改善了在人中的免疫原性。
GM-CSF的优选的量为从单剂使用的一瓶500微克的LEUKINE中获得的500微克的GM-CSF，所述的KEUKINE可自Immunex公司购得。除非另有说明，包括在疫苗制剂中的各抗原的量优选为100微克。
载体
施给疫苗组合物所用的许多载体是已知的。这些载体包括(但不限于)简单的液体载体、聚合的和类脂组合物。简单的液体载体如水和缓冲盐水可单独使用或与其他载体配合使用。
所述的载体还可是聚合的迟延-释放系统。在配制使抗原得到有控制释放的疫苗方面，合成的聚合物特别有用。这方面的例子由Kreuter描述于Microcapsules and Nanoparticles in Medicine andPharmacology，125-148页(M.Donbrow编辑，CRC出版社出版)。其他颗粒的采用已经证明这些聚合物的佐剂效果取决于颗粒的大小和疏水性。
微胶囊包装已用于微胶囊包装的药物的注射，以得到药物的有控制的释放。用于微胶囊包装的特定聚合物的选择与许多因素有关。聚合物合成和微胶囊包装过程的可再现性、微胶囊包装材料和方法的成本、其毒理学特征、可变释放动力学的要求以及该聚合物和抗原的生理化学相容性都是必须考虑的因素。有用的聚合物的例子是多糖、聚酯、聚氨基甲酸乙酯、聚原酸酯和酰胺，那些可生物降解的聚合物特别有用。
经常用作药物的载体和最近用作抗原的载体的载体是聚(d，l-丙交酯-乙交酯)(PLGA)。它是可生物降解的聚酯，在可蚀缝合、骨夹板和其他临时的修复术中已有很长的药用历史，在这些修复术中它没有毒性。各种各样的药物包括肽和抗原已被配制到PLGA微胶囊中。关于使PLGA适于抗原的有控制的释放大量数据已经积累起来，例如，如Eldridge  等人在Current Topics in Microbiology andImmunology 146：59-66(1989)中所作的综述。该PLGA微胶囊包装方法采用水-油乳化相分离原理。在该方法中，组合疫苗中的灭活病毒和各VEP以水溶液的形式制备，而将PLGA溶解于适当的有机溶剂如二氯甲烷和乙酸乙酯中。通过高速搅拌使这两种不能相互混合的溶液共乳化。然后加入聚合物的非-溶剂，在含水液滴的周围引起聚合物的沉淀，形成微胶囊的雏形。收集该微胶囊，并用分配剂聚乙烯醇(PVA)、明胶、藻酸盐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或甲基纤维素中的一种稳定之，通过真空干燥或通过溶剂萃取而将溶剂除去。
蛋白体(蛋白质和脂质体的结合体)也可用作组合疫苗的载体，所述的组合疫苗采用灭活病毒和各自的VEP作为蛋白质组份。使用蛋白体的步骤和材料如Lowell等人在Science(科学)240：800(1988)、Lowell等人在New Generation Vaccines(新一代的疫苗)(Woodrow和Levine编辑，Marcel Dekker，NY，1990)第12章141--160页和Orr等人在In fect.iMMUN.61：2390(1993)中所描述的一样，这些文献的内容引入本文作参考。
本领域的技术人员应明白的是，该致免疫的疫苗组合物还可包含生理上可接受的其它成分如水、盐水、或矿物油(如DrakeolTM、MarkolTM)、鲨烯以形成乳液，或者与含水缓冲液配合使用，或者将该疫苗组合物包在胶囊或肠溶衣中以防止蛋白质在途经胃时被降解掉。
在优选的实施方案中，该疫苗以用于胃肠外途径免疫的单一剂量包装，所述的胃肠外途径是肌肉内、真皮内或皮下施给，或者通过鼻咽部即鼻内施给。采用标准的技术如抗体效价测定来确定有效剂量。可将抗原冻干，而在施给时重悬在液体中或溶于溶液中。如果施给佐剂，该佐剂可与疫苗一起施给或者在施给疫苗的附近施给。
致免疫应答的测定
采用检测和定量与VEP结合的抗体的检验来测量免疫。细胞免疫采用测量特异的T-细胞应答如迟发型过敏反应(DTH)和淋巴细胞增殖的检验来测量。通过抗原的负载和用来确定剂量的标准技术和各抗原施用的方案，基于施给抗原所产生抗体的滴定度，来确定剂量。本文所用的术语“导致免疫应答的有效剂量”是指，采用任何已知的测抗体效价的方法，与未经处理的动物和人相比引起抗体效价增高的剂量。
采用重组的VEP作为抗原，通过酶免疫测定来检测循环中的抗重组VEP的抗体。这种测定描述于下文。简言之，可用每孔1微克的重组VEP包被测定板。采用1∶1000稀释的与马辣根过氧化物酶(HRP)共轭连接的羊抗狗IgG抗体。还可通过免疫荧光法(IFA)、双向琼脂糖扩散法和Western/免疫印迹法(由LiuShu-Xian等人描述于SE AsianJ.Trop.Med.Pub.Health 24：61--65(1993))进行免疫应答的测量。
在一个实施方案中制备了改进的流感疫苗。致免疫量的灭活流感病毒和致免疫量的重组流感病毒包膜蛋白或包膜蛋白的片段或前体配合。术语“致免疫”是指能够导致抗体产生。
任何流感病毒的包膜蛋白或蛋白片段或前体均可采用。在优选的实施方案中，采用了血细胞凝集素、神经氨糖酸苷酶或者血细胞凝集素和神经氨糖酸苷酶的混合物。如上文所述采用标准的方式，采用杆状病毒载体在昆虫细胞培养物(如Powers，D.C.等人描述的鳞翅目昆虫细胞培养物)中进行生产，制备该重组蛋白。另外，该蛋白质的制备还可采用哺乳动物表达系统，如那些采用COS细胞或CHO细胞表达载体的表达系统(如由Ausubel，F.M.等人描述于Short Proctocols in MolecularBiology，第二版，John Wiley，New York，1992，16--53至16--62页)。在一个实施方案中采用了杆状病毒/鳞翅目昆虫细胞方法。
对于流感，优选的组合疫苗含有一定的流行季节的三株灭活的流感病毒，如可自市售购得的和在下文的实施例中描述的那些病毒。由FDA和CDC选出的代表流行季节的病毒株列于下表中。病毒株    1992/93             1993/94              1994/95HINI    A/德克萨斯/36/91    A/德克萨斯/36/91    A/德克萨斯/36/91H3N2    A/北京/353/89       A/北京/32/92        A/山东/9/93B       B/巴拿马/45/90      B/巴拿马/45/90      B/巴拿马/45/90
抗FDA和CDC选出的代表流行季节的H1N1、H3N2和B株的已获准疫苗是优选的。在这些实施方案中，在组合疫苗中采用了致免疫量的重组包膜蛋白如HA0或NA中的至少一种，优选对于每一选出的病毒株采用一种蛋白(或片段或前体)。当在重组蛋白组份中采用蛋白质片段或前体时，该疫苗可含有蛋白质和片段或前体的混合物。
在另一实施方案中，该组合疫苗含有两种包膜蛋白如血细胞凝集素和神经氨糖酸苷酶。当疫苗中含有三株病毒时，该组合疫苗含有至少一种血细胞凝集素和至少一种神经氨糖酸苷酶。优选的组合疫苗含有对应于各病毒株的血细胞凝集素和对应于各病毒株的神经氨糖酸苷酶。
将存在于组合疫苗中的各株灭活病毒的量加以调节，使疫苗中一般含有约12-18微克的各病毒株包膜蛋白；在一个实施方案中，灭活病毒的量被调节到每剂该疫苗中含有15微克的各株病毒HA(HA1+HA2)。在另一实施方案中，各病毒株的重组HA0均采用了15微克。
虽然可能存在单体形式的和其它多聚体形式的HA0以及可能存在单体形式的和其它形式的NA，优选所用的HA0主要是三聚体形式的，所用的NA主要是四聚体形式的；所用的HA0或NA或其两者是采用重组杆状病毒载体在鳞翅目昆虫细胞培养物中产生、提取并在非-变性条件下纯化到至少90％的纯度。
灭活的/重组组合流感疫苗的益处在于：与其中的任一产物相比，预期它的成本较低、更安全和更有效；与HAO疫苗本身相比，它能更快地获得批准。该组合疫苗将最适于刺激对游离病毒抗原(如HA1、HA2)的免疫和对细胞结合病毒抗原以及病毒感染的细胞(如HA0)产生免疫，该组合疫苗进一步还最适于刺激通过天然糖基化的(灭活的流感病毒)和修饰糖基化的(杆状病毒/昆虫细胞产生的HA0)抗原的免疫。
另一益处在于：通过对灭活病毒组份和包膜蛋白组份的操作，可提供健康成人所需的几种剂量水平的、以及老年成人和年幼儿童使用的高剂量水平的预防流感的改进疫苗。
例如，预防水痘的病毒疫苗，可通过混合减毒的水痘疱疹病毒和重组的水痘疱疹病毒包膜糖蛋白D(或片段或前体)来制备。
通过将灭活的麻疹病毒和重组的麻疹病毒包膜F蛋白、病毒包膜HA蛋白、病毒包膜F/HA聚蛋白或这些包膜蛋白(或其片段或前体)的混合物加以混合来制备麻疹疫苗。
其它的疫苗包括(但不限于)：灭活的Epstein Barr病毒和重组的病毒gp 340包膜蛋白(或其片段或前体)的组合；灭活的呼吸道合胞体病毒和病毒包膜F蛋白、病毒包膜G蛋白、病毒包膜FG聚蛋白或这些蛋白质(其片段或前体)的混合物的组合；灭活的副流感3型病毒和病毒包膜HA蛋白、病毒包膜HA蛋白、病毒包膜F/HA聚蛋白或这些蛋白质(其片段或前体)的混合物的组合；灭活的单纯性疱疹1型病毒和重组的病毒包膜糖蛋白D(或其片段或前体)的组合；以及灭活的单纯性疱疹2型病毒和重组的病毒包膜糖蛋白D(或其片段或前体)的组合。
在改进流感疫苗的情况下，通过简单的等价测验即可满足FDA许可对组合疫苗的要求，而不需进行完全规模的III期群体试验。在高危人群中的测验将被简化，因为该组合疫苗包含已获准的疫苗组份，预计在年轻和年老个体中的功效将有提高。与不含其它组份的重组蛋白疫苗如HA0疫苗所需的抗原相比，(组合疫苗)需要较少的抗原，因此大规模的生产需求不大。佐剂如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的掺入极大地增加了疫苗的功效。
实施例
下面的实施例进一步对本发明作了解释和说明，在任何意义上不应将之看成对本发明的限制。除非另有说明，所有的份数和百分数均为重量份和重量百分数，并以所在加工阶段的组合物的重量为基础给出。实施例1：组合流感疫苗
该实施例描述了组合流感疫苗的配方，该组合疫苗采用了可自市售购得的三种灭活流感病毒疫苗中的任何一种，所述的灭活流感病毒疫苗是采用标准的方法自鸡胚分离得到的。
三种流感疫苗是来自Connaught Laboratories(Swiftwater，PA)的Fluzone、来自Parke Davis(Morris Plains，NJ)的Fluagen和来自Wyeth Ayerst Laboratories(Philadelphia，PA)的Flushield。这些产品的说明包括剂量、药方信息、副作用、服用方法和生产方法均公开于Physicians Desk Reference，第49版，Medical Economics Data Production Company，Montvale，NY，1995(908、2660、2740页)和随市售产品附送的产品介绍插页中。(产品的其它信息还可根据信息自由法案，从Food and DrugAdiministration(食品和药品管理局)得到，包括各获准流感疫苗得到批准的纲要。)
向标准成人剂量的上述已获准的任一流感疫苗中加入0.5ml HA0三价抗原的磷酸盐缓冲液溶液(PH＝7，该溶液的制备如Powers，D.C.等人(1995)所述)，来制备灭活病毒/重组HA0组合流感疫苗。简言之，在用含有编码HA基因的cDNA的杆状病毒载体感染后，用鳞翅目昆虫细胞的培养物来生产重组的HA0。在非变性的条件下，纯化该表达的蛋白，使纯度达到95％以上，用定量扫描光密度测定法测量在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳的大量抗原的纯度。肽的一致性由氨基酸分析、N-末端测序和采用抗-流感病毒血清的Western印迹分析来确实。三聚体形式的HA0抗原是优选的(虽然可采用单体形式的HA0或其他寡聚形式的HA0抗原)。
该HA0三价抗原含有三株流感病毒的各株的HA0，所述的流感病毒存在于市售疫苗中，可用来制备一定流行性季节的组合疫苗：A/北京/353/89、A/德克萨斯/36/91和B/巴拿马/45/90；A/北京/32/92、A/德克萨斯/36/91和B/巴拿马/45/90；或者A/山东/9/93、A/德克萨斯/36/91和B/巴拿马/45/90。将各HA0在所述抗原制剂中的量调整到终浓度为30微克每毫升，以便在将所述的三价抗原加入到灭活病毒疫苗中后，该组合物疫苗含有15微克的各重组HA0。
以一剂1毫升的剂量将该组合疫苗注射进三角肌中，以此方式来施用该疫苗。在如果注射是在秋季在流行性流感爆发之前，则效果最好。实施例2：组合水痘疱疹疫苗
预防水痘疱疹(水痘)的组合疫苗在该实施例中是优选的。
在配方中采用的疫苗是由Merckand Co.(West Point，PA)制造最近被食品药品管理局批准的减毒水痘(水痘疱疹)疫苗，据报道该疫苗的有效性为70％。该产品的说明包括剂量、药方信息、副作用、施用方法、生产方法均公开于随该市售产品附送的产品介绍插页中。(产品的其它信息还可根据信息自由法案，从Food and DrugAdiministration(食品和药品管理局)得到，包括该疫苗得到批准的纲要。)
向标准剂量的上述已获准的水痘疫苗中加入重组水痘疱疹抗原的磷酸盐缓冲液溶液(PH＝7)0.5ml，来制备减毒病毒/重组包膜蛋白的水痘疱疹组合疫苗。该抗原含有重组的水痘疱疹病毒包膜糖蛋白D，其浓度为100微克每毫升。
该糖蛋白D抗原的制备是采用重组的杆状病毒载体在鳞翅目昆虫细胞培养物中产生相应前体蛋白，从纯化的细胞膜中提取并在非变性条件下纯化到至少90％的纯度。如此获得的存在于水痘疱疹抗原中的包膜糖蛋白D优选为四聚体形式的(虽然也可采用单体、二聚体或其他寡聚形式的包膜糖蛋白D)。
组合疫苗的优选剂量为一剂1ml对三角肌肌注。在初始免疫一个月后，进行第二剂加强注射。实施例3：其他组合病毒疫苗的制备
该实施例描述了本发明的其他几种组合疫苗的制备，包括麻疹组合疫苗、Epstein Barr病毒组合疫苗、呼吸道合胞体病毒组合疫苗、副流感3型病毒组合疫苗、单纯性疱疹1型病毒组合疫苗和单纯性疱疹2型病毒组合疫苗的制备。将高度纯化的重组病毒包膜蛋白(成熟形式或前体形式的)与相应的灭活病毒疫苗混合来制备所述的组合疫苗。
用由Merk and Co.生产的市售减毒麻疹病毒疫苗制备麻疹组合疫苗。按本领域技术人员已知的方式制备其它病毒的灭活制剂。总的说来，这些病毒都易于在哺乳动物细胞培养物中生长。收获病毒并以切线流(tangential flow)过滤浓缩之。利用离心和基于分子排阻或植物凝集素亲合的柱层析法对病毒进一步纯化。通过各种方法对纯化的病毒进行灭活，优选在用补骨脂(psoralin)处理以使病毒DNA交联后采用光灭活，这样外层的包膜蛋白不会变性。
已经描述了导致细胞结合和细胞融合的上述各病毒的病毒包膜蛋白及其各自的前体蛋白。采用一种或多种包括杆状病毒/昆虫细胞培养和哺乳动物表达系统在内的重组方法生产这些蛋白质也已经描述过了。收获这些蛋白质的优选方法是，先纯化含该重组蛋白的细胞膜，然后在非变性的条件下从所述的膜中提取该蛋白质。该纯化的蛋白质通常形成较高级的结构(二聚体、三聚体或四聚体)，就如同它们在病毒中存在的时候一样。虽然单体形式也可采用，但在组合疫苗中优选采用这些寡聚形式的蛋白质。重组抗原的纯度为至少约90％(虽然较低或更高纯度的抗原也可采用)。
优选的其他病毒的重组包膜抗原如下：
病毒                   包膜抗原
Epstein Barr病毒       gp340
呼吸道合胞体病毒    F蛋白、G蛋白、FG聚蛋白
副流感3型病毒    F蛋白、HA蛋白、F/HA聚蛋白
麻疹病毒         F蛋白、HA蛋白、F/HA聚蛋白
水痘疱疹病毒         包膜糖蛋白D
单纯性疱疹1型病毒    包膜糖蛋白D
单纯性疱疹2型病毒    包膜糖蛋白D
将溶在磷酸盐缓冲液(PH＝7)中的重组抗原和各自的灭活病毒(也在PH＝7的磷酸盐缓冲液中)混合。调整在组合疫苗中含有的抗原的量和灭活病毒的量，使1毫升的疫苗中含有各50微克的存在于抗原制剂中的各包膜蛋白，计算病毒的量，使疫苗中含有50微克导致与细胞受体结合的成熟包膜蛋白。
各组合疫苗的优选剂量为一剂1ml在三角肌内肌注，在一个月后，对所述的三角肌进行肌内第二剂加强注射。实施例4：高剂量的流感组合疫苗
该实施例描述了高剂量的流感组合疫苗。对于65岁以上的成人和2岁以下的儿童，优选实施例1所述的灭活病毒/重组HA0流感组合疫苗的配方包含各150微克的每种重组HA0或各100微克的每种重组HA0，而不是如实施例1所述的15微克的量。
将各HA0在所述抗原制剂中的量调整到每毫升300微克或200微克的终浓度，以便在将所述的三价抗原加入到灭活病毒疫苗中后，该组合疫苗含有各150微克或100微克的各重组HA0。
为了使重组HA0的浓度达到200微克或以上的浓度，通过将层析柱的大小和装填的树脂床体积减小50-75％，以及适当的成比例地减小洗脱缓冲液的体积，通过重复最后一步洗脱步骤而进一步浓缩从层析柱上洗脱下来的洗脱物。或者，通过在搅拌池中加压透析来浓缩各重组的HA0。
高剂量组合疫苗的优选剂量为一剂1ml在三角肌肌内注射该组合疫苗。优选在秋季在流行性流感爆发之前进行该注射。实施例5：组合流感疫苗
该实施例描述了含有rHA0和rNA的流感组合疫苗。
灭活流感疫苗中神经氨糖酸苷酶的含量倾向于可变，这部分是因为对终产物中的灭活病毒的浓度进行了调整，以产生所需的血细胞凝集素浓度。虽然在美国FDA对批准的疫苗没有关于神经氨糖酸苷酶最低含量的要求，但在欧洲要求在批准的疫苗中包含神经氨糖酸苷酶。将规定量的重组NA加入到现已获准的疫苗中或加入到实施例1所描述的组合疫苗中或加入到实施例4所描述的高剂量组合疫苗中，提供了抵抗源自病毒性流感的疾病的额外的保护作用。
用重组杆状病毒表达载体和鳞翅目昆虫细胞的培养物来生产、提取和在非变性的条件下纯化重组的NA，使纯度达到90％以上(虽然纯度较低或更高的NA也可采用)。该NA抗原为四聚体形式的(虽然也可采用寡聚形式或单体形式的NA)。
向标准成人剂量的市售流感疫苗(如实施例1所述)中加入重组NA三价抗原的磷酸盐缓冲液溶液(PH＝7)0.5ml，来制备灭活病毒/重组NA流感疫苗的组合疫苗。该NA三价抗原制剂含有在用来制备该组合疫苗的市售疫苗中存在的三株流感病毒的各自的NA。将该抗原制剂中的各重组NA调整到每毫升10微克的终浓度，以便在将该三价抗原加入到灭活病毒疫苗中后，所述的组合疫苗含有各5微克的各重组NA。
按照实施例1所述的灭活病毒/重组HA0组合疫苗和实施例4所述的高剂量组合疫苗，通过将重组的NA三价抗原的磷酸盐缓冲液溶液(PH＝7)加入到上述实施例所述的HA0三价抗原中，来制备灭活病毒/重组HA0/重组NA流感疫苗的组合疫苗。如上文所述，将所得的HA0/NA三价抗原制剂加入到已获准的灭活疫苗中。在用按照实施例1所述的组合疫苗制备疫苗的情况下，将HA0/NA三价抗原制剂中的各NA调整到每毫升10微克的浓度，以便在该三价抗原加入到灭活病毒疫苗中后，该组合疫苗含有各5微克的各重组NA和各15微克的各重组HA0。
在用按照实施例4所述的组合疫苗制备疫苗的情况下，分别将HA0/NA三价抗原制剂中的各NA调整到每毫升100微克或67微克的浓度，以便在该三价抗原加入到灭活病毒疫苗中后，该组合疫苗或含有50微克的每种重组NA和150微克的每种重组HA0，或者含有各33.5微克的每种重组NA和100微克的每种重组HA0。在所述的NA三价抗原制剂中，含有在用来制备该组合疫苗的市售疫苗中存在的三株流感病毒的各自的NA。
该组合疫苗的剂量为一剂1ml在三角肌肌内注射该组合疫苗。优选在秋季在流行性流感爆发之前进行该注射。
以上描述的意图是使本领域的技术人员能够实施本发明，本文所引用的所有的文献均引入本文作参考。在此不打算详尽所有可能的改进和变化，本领域的技术人员在阅读了本说明书之后，这些改进和变化是显而易见的。然而这些改进和变化应包括在由权利要求所限定的本发明的范围之内。除非在上下文中明确做出了相反的说明，权利要求意欲覆盖以有效满足本发明目的的任何序列和顺序排列的所述要素和步骤。

Claims (26)

1.人用流感病毒疫苗组合物，含有致免疫量的灭活流感病毒和致免疫量的来自该病毒的纯化的重组包膜蛋白或该蛋白的片段或前体。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述的重组包膜蛋白是血细胞凝集素。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述的血细胞凝集素是未断裂的HA0。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述的血细胞凝集素是用杆状病毒载体在鳞翅目昆虫细胞培养物中产生、提取并在非变性条件下纯化出来的，其纯度至少为90％。
5.根据权利要求1的组合物，其中所述的灭活流感病毒包括该病毒的三个株系，所述的重组包膜蛋白至少包括源自一株病毒的一种血细胞凝集素。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述的重组包膜蛋白包括对应于每一株病毒的血细胞凝集素。
7.根据权利要求1的组合物，其中所述的重组包膜蛋白是神经氨糖酸苷酶。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述的神经氨糖酸苷酶是四聚体。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述的神经氨糖酸苷酶是用杆状病毒载体在鳞翅目昆虫细胞培养物中产生、提取并在非变性条件下纯化出来的，其纯度至少为90％。
10.根据权利要求7的组合物，其中所述的灭活流感病毒包括该病毒的三个株系，所述的重组包膜蛋白至少包括源自一株病毒的一种神经氨糖酸苷酶。
11.根据权利要求10的组合物，其中所述的重组包膜蛋白包括对应于每一株病毒的神经氨糖酸苷酶。
12.根据权利要求1的组合物，其中所述的重组包膜蛋白包括神经氨糖酸苷酶和血细胞凝集素。
13.根据权利要求10的组合物，其中所述的灭活病毒组份包括该病毒的三个株系，所述的包膜蛋白包括三株病毒中至少一株病毒的血细胞凝集素和三株病毒中至少一株病毒的神经氨糖酸苷酶。
14.根据权利要求1的组合物，还含有佐剂集落刺激因子。
15.根据权利要求14的组合物，其中所述的佐剂是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
16.哺乳动物疫苗组合物，含有包含至少两种组份的组合，所述组合的组份选自致免疫量的灭活病毒、致免疫量的来自该病毒的纯化的包膜蛋白或其片段或前体、和有效量的集落刺激因子。
17.根据权利要求16的组合物，其中所述的集落刺激因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
18.根据权利要求16的组合物，其中所述的病毒是水痘疱疹病毒，所述的重组蛋白是水痘疱疹病毒包膜糖蛋白D，所述的集落刺激因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
19.根据权利要求16的组合物，其中所述的病毒是麻疹病毒，所述的集落刺激因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，所述的重组蛋白选自病毒包膜F蛋白、病毒包膜G蛋白、病毒包膜FG聚蛋白、或其混合物。
20.根据权利要求16的组合物，含有三株灭活的流感病毒和该三株病毒中各株的血细胞凝集素，其中所述的血细胞凝集素是未断裂的HA0，该HA0是用重组杆状病毒载体在鳞翅目昆虫细胞培养物中产生、提取并在非变性条件下纯化出来的，其纯度至少为90％。
21.根据权利要求16的组合物，含有三株灭活的流感病毒和该三株病毒中各株的神经氨糖酸苷酶，其中所述的神经氨糖酸苷酶是四聚体，是用重组杆状病毒载体在鳞翅目昆虫细胞培养物中产生、提取并在非变性条件下纯化出来的，其纯度至少为90％。
22.根据权利要求16的组合物，其中所述的组合选自：
(a)灭活的Epstein Barr病毒和重组的病毒gp 340包膜蛋白的组合；
(b)灭活的呼吸道合胞体病毒和重组蛋白的组合，所述重组蛋白选自病毒包膜F蛋白、病毒包膜G蛋白、病毒包膜FG聚蛋白或其混合物；
(c)灭活的副流感3型病毒和重组蛋白的组合，所述重组蛋白选自病毒包膜F蛋白、病毒包膜G蛋白、病毒包膜FG聚蛋白或其混合物；
(d)灭活的单纯性疱疹1型病毒和重组的病毒包膜糖蛋白D的组合；和
(e)灭活的单纯性疱疹2型病毒和重组的病毒包膜糖蛋白D的组合。
23.根据权利要求21的组合物，还包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
24.用于使人抗病毒感染的免疫方法，所述病毒感染选自流感、水痘，该方法包括给人接种疫苗组合物，该疫苗组合物含有包含至少两种组份的组合，所述组合的组份选自致免疫量的引起所述感染的相应的减毒病毒、有效量的集落刺激生长因子、和致免疫量的源自该病毒的纯化的重组包膜蛋白或其片段或前体。
25.根据权利要求21的方法，其中所述的病毒是流感病毒，所述的集落刺激生长因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，所述的重组包膜蛋白选自血细胞凝集素、神经氨糖酸苷酶或其混合物。
26.根据权利要求24的方法，其中所述的疫苗组合物含有三株病毒和对应于每一病毒株的至少一种包膜蛋白。
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