CN117771359A - 一种包含双佐剂的rsv疫苗、制备方法及其应用 - Google Patents

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CN117771359A CN202311686080.6A CN202311686080A CN117771359A CN 117771359 A CN117771359 A CN 117771359A CN 202311686080 A CN202311686080 A CN 202311686080A CN 117771359 A CN117771359 A CN 117771359A
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张金灿
程晋霞
刘昕阳
李世崇
王莉
李韵铮
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Abstract

本发明公开了一种包含铝佐剂和CpG佐剂的双佐剂的RSV纳米颗粒疫苗及其制备方法与应用。本发明通过将RSV的Pre‑F相关序列及铁蛋白纳米颗粒进行突变设计，并将Pre‑F突变蛋白和铁蛋白突变体在真核细胞中进行融合表达，得到具备多个Pre‑F在表面集中展示的铁蛋白‑PreF融合蛋白纳米颗粒，并筛选合适的佐剂。通过实验表明：将本发明制备的包含双佐剂的RSV疫苗注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对真病毒可产生较高的中和效价，双佐剂具有协同作用。

Description

一种包含双佐剂的RSV疫苗、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种包含双佐剂的RSV疫苗、制备方法及其应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)于1955年首次被发现，属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)，肺炎病毒属(Pneumovirus)，依据G蛋白的序列可分为A和B两个亚型。RSV为非节段性的负链RNA病毒，其基因组长度为15.2kb，有10个基因，共编码11种蛋白，包括非结构蛋白(NS1，NS2)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、RNA依赖RNA聚合酶(L)、转录延伸因子(M2-1)、调控因子(M2-2)和3种包膜糖蛋白(黏附蛋白(G)、融合蛋白(F)和小疏水蛋白(SH))。
RSV是引起呼吸道感染(Respiratory tract infection，RTI)的病毒性病原体，感染主要引起下呼吸道感染症状，其中严重症状的患者占有相当高的比例(如毛细支气管炎和肺炎)，需要住院治疗，具有较高的死亡率。RSV可以通过人与人之间接触传播，或者通过咳嗽或打喷嚏而吸入传播，也可通过接触污染物而获得感染，主要感染鼻腔以及肺部大、小气道的上皮细胞，也可能感染肺泡巨噬细胞和肺部其它类型的细胞，可引起细胞融合在一起形成合胞体。
疫苗研究是目前防治RSV最为集中的领域，早在20世纪60年代，福尔马林灭活RSV疫苗被研制出来进行临床研究，这也是首个进入临床试验的RSV疫苗，但该疫苗不仅没有产生对RSV疾病的保护作用，且在后来的自然感染中，接种过疫苗的儿童发生了严重的疾病增强(ERD)现象，住院率明显增加，甚至引起死亡，因此，该疫苗最终未能进入临床应用。
佐剂(Adjuvant)又称免疫调节剂或免疫增强剂(Immunepotentiator)，是疫苗的一种添加剂，当它先于抗原或与抗原混合注入机体后，能够增强机体对抗原的免疫应答或者改变免疫反应的类型，属于非特异性的免疫增强剂，而其本身无抗原性。理想的佐剂不仅能够增强免疫反应，而且能使机体获得最佳的保护性免疫。为了进一步提高RSV疫苗的免疫效价，寻找合适的免疫佐剂是有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫效价高包含双佐剂的RSV疫苗。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种包含双佐剂的RSV疫苗，所述RSV疫苗包括RSV的Pre-F蛋白或其突变蛋白和双佐剂，所述双佐剂包括铝佐剂和CpG佐剂。
在一些实施方案中，所述铝佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述蛋白与所述铝佐剂的质量比可为1：(0.5-300)，可以为上述比例的任意值或者范围，例如1：(1-275)、1：(10-200)、1：(30-180)、1：(40-100)、1：(10-80)、1：(25-75)、1：(50-75)、1：50等等。
在一些实施方案中，所述CpG佐剂包括任一的CpG佐剂，例如CpG1018、CpG-cjx等等。
在一些实施方案中，所述蛋白与所述CpG佐剂的质量比可为1：(0.5-300)，可以为上述比例的任意值或者范围，例如1：(1-275)、1：(10-200)、1：(30-180)、1：(40-100)、1：(10-80)、1：(25-75)、1：(50-75)、1：50等等。
在一些实施方案中，所述双佐剂中铝佐剂与CpG佐剂的质量比为(1-5)：(5-1)，可以为上述比例的任意值或者范围，例如1：2、1：1、2：1等等。
在一些实施方案中，所述蛋白：铝佐剂：CpG佐剂的质量比为1:50:50。
在一些实施方案中，所述Pre-F蛋白的突变蛋白包括将Pre-F蛋白氨基酸序列进行如下a1)-a18)中至少一种突变后得到的蛋白：
a1)将Pre-F蛋白氨基酸序列第67位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；
a2)将Pre-F蛋白氨基酸序列第88位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
a3)将Pre-F蛋白氨基酸序列第110位的半胱氨酸突变为丙氨酸；
a4)将Pre-F蛋白氨基酸序列第144位的天冬酰胺突变为甘氨酸，且在第144位和第145位氨基酸之间插入半胱氨酸；
a5)将Pre-F蛋白氨基酸序列第159位的酪氨酸突变为半胱氨酸；
a6)将Pre-F蛋白氨基酸序列第173位的半胱氨酸缺失；
a7)将Pre-F蛋白氨基酸序列第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸；
a8)将Pre-F蛋白氨基酸序列第227位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；
a9)将Pre-F蛋白氨基酸序列第236位的丝氨酸突变为精氨酸；
a10)将Pre-F蛋白氨基酸序列第248位的丝氨酸突变为半胱氨酸；
a11)将Pre-F蛋白氨基酸序列第289位的谷氨酸突变为天冬酰胺；
a12)将Pre-F蛋白氨基酸序列第309位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
a13)将Pre-F蛋白氨基酸序列第334位的精氨酸突变为酪氨酸；
a14)将Pre-F蛋白氨基酸序列第344位的天冬酰胺突变为谷氨酸；
a15)将Pre-F蛋白氨基酸序列第370位的丝氨酸突变为甘氨酸；
a16)将Pre-F蛋白氨基酸序列第389位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；
a17)将Pre-F蛋白氨基酸序列第420位的半胱氨酸突变为酪氨酸；
a18)将Pre-F蛋白氨基酸序列第469位的精氨酸突变为天冬酰胺；
在一些实施方案中，所述Pre-F蛋白为如下任一种：
(A1)SEQ ID No.1所示的蛋白；
(A2)在(A1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(A3)将(A1)-(A2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(A4)与(A1)-(A2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
在一些实施方案中，所述Pre-F蛋白的突变蛋白为如下任一种：
(M1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示的蛋白；
(M2)在(M1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(M3)将(M1)-(M2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(M4)与(M1)-(M2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
在一些实施方案中，所述Pre-F蛋白或其突变蛋白与其他蛋白形成融合蛋白。
在一些实施方案中，所述其他蛋白包括铁蛋白或其突变体，所述融合蛋白包括铁蛋白-PreF融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包括上述Pre-F蛋白或其突变蛋白和铁蛋白突变体；
在一些实施方案中，所述铁蛋白突变体为将铁蛋白氨基酸序列进行如下b1)-b3)中至少一种突变后得到的蛋白：
b1)将铁蛋白氨基酸序列第15位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺；
b2)将铁蛋白氨基酸序列第96位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
b3)将铁蛋白氨基酸序列第119位的酪氨酸突变为精氨酸；
在一些实施方案中，所述铁蛋白为如下任一种：
(B1)SEQ ID No.10所示的蛋白；
(B2)在(B1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(B3)将(B1)-(B2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(B4)与(B1)-(B2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
在一些实施方案中，所述铁蛋白突变体为如下任一种：
(N1)SEQ ID No.11所示的蛋白；
(N2)在(N1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(N3)将(N1)-(N2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(N4)与(N1)-(N2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
在一些实施方案中，所述融合蛋白为如下任一种：
(C1)SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.15或SEQ IDNo.16或SEQ IDNo.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19所示的蛋白；
(C2)在(C1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(C3)将(C1)-(C2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(C4)与(C1)-(C2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
上述(A2)或(M2)或(B2)或(N2)或(C2)所述的融合蛋白中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述(A3)或(M3)或(B3)或(N3)或(C3)所述的融合蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为在上述a1)-a18)或b1)-b3)所述氨基酸突变位点以外进行不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述任一所述蛋白或融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种生物材料。
本发明提供的生物材料为下述D1)-D5)中至少一种：
D1)编码上述蛋白或融合蛋白的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的重组细胞系、含有D2)所述表达盒的重组细胞系、或含有D3)所述重组载体的重组细胞系。
上述生物材料中，编码所述蛋白的核酸分子为E1)或E2)：
E1)SEQ ID No.20第1-1422位或SEQ ID No.21第1-1422位或SEQ ID No.22第1-1422位或SEQ IDNo.23第1-1422位或SEQ ID No.24第1-1422位或SEQ ID No.25第1-1422位或SEQ ID No.26第1-1422位或SEQ ID No.27第1-1422位所示的DNA分子；
E2)与E1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述融合蛋白的DNA分子。
编码所述融合蛋白的核酸分子为F1)或F2)：
F1)SEQ ID No.20或SEQ ID No.21或SEQ ID No.22或SEQ ID No.23或SEQ IDNo.24或SEQ IDNo.25或SEQ ID No.26或SEQ ID No.27所示的DNA分子；
F2)与F1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述融合蛋白的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白或融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述蛋白或融合蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述蛋白或融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
所述同一性是指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8或SEQ ID No.9或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ IDNo.15或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白或融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动上述蛋白或融合蛋白编码基因序列转录的启动子，还可包括终止上述蛋白或融合蛋白编码基因序列转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述生物材料中，所述细胞可为原核生物细胞或真核生物细胞。
本发明还提供一种上述疫苗的制备方法，所述制备方法包括将所述蛋白或融合蛋白与双佐剂混合。
在一些实施方案中，所述制备方法包括上述任一的蛋白或者融合蛋白的制备步骤。
在一些实施方案中，所述蛋白或者融合蛋白的制备步骤包括使编码上述任一蛋白或融合蛋白的核酸分子在生物或生物细胞中进行表达，得到所述蛋白或融合蛋白。
进一步的，所述方法包括如下步骤：将编码所述蛋白或融合蛋白的核酸分子导入CHO K1Q细胞，得到重组细胞；培养所述重组细胞，得到所述蛋白或融合蛋白。
更进一步的，所述蛋白或融合蛋白的核酸分子通过重组质粒导入CHO K1Q细胞。
所述重组质粒为将所述蛋白或融合蛋白的核酸分子插入载体质粒后得到的质粒。
在本发明的具体实施例中，所述载体质粒为pKS001载体质粒。所述重组质粒为重组质粒pKS001-RSV-PreF-A-NP、pKS001-RSV-PreF-B-NP、pKS001-RSV-PreF-C-NP、pKS001-RSV-PreF-D-NP、pKS001-RSV-PreF-E-NP、pKS001-RSV-PreF-F-NP、pKS001-RSV-PreF-G-NP或pKS001-RSV-PreF-H-NP。
本发明还提供一种上述疫苗在如下Y1)-Y3)任一种中的应用：
Y1)制备抗呼吸道合胞病毒的产品；
Y2)制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的产品；
Y3)制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的产品。
本发明的有益效果如下：
1、本发明通过对佐剂的筛选，获得适合的佐剂组合以及有效的浓度范围，双佐剂之间具有协同作用，可以显著性提高RSV疫苗的免疫效果。
2、在优选的方案中，本发明通过特异性的抗原突变设计增强了Pre-F蛋白的有效免疫原性、稳定性和安全性，并通过在纳米颗粒表面的展示将所需要的表位外露，进一步增强了免疫原性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或者可通过已知方法制备得到。
实施例1、铁蛋白-PreF融合蛋白的设计、制备与纯化
参见申请人之前公开的专利CN115850396 A的实施例1-4，获得稳定，安全性能高，具有一定免疫力的铁蛋白-PreF融合蛋白，本发明涉及的序列结构和该专利中的序列相同，专利CN115850396 A整体引用，作为本申请的一部分。
实施例2、铁蛋白-PreF融合蛋白的佐剂筛选
将实施例1纯化得到的铁蛋白-PreF(RSV-PreF-D-NP，SEQ ID No.15)融合蛋白(下述表格中以RSV-NP表示)。选择使用溶剂为20mM磷酸缓冲液，0.15M NaCl,pH 4.5)，得到RSV铁蛋白-PreF融合蛋白抗原。
一、分组
疫苗组：
1：铝佐剂疫苗配置
室温条件下将0.4mg/ml的稀释抗原与氢氧化铝佐剂混悬液或磷酸铝佐剂混悬液(其中铝含量10mg/ml，溶质为氢氧化铝或磷酸铝，溶剂为PBS；购自长春生物制品研究所)按照不同体积置于加有转子的玻璃瓶中80rpm/min混合均匀，得到不同铝盐佐剂疫苗，其中抗原与佐剂的质量比如表5或表6所示。
2：CpG佐剂疫苗配置
室温条件下将0.4mg/ml的稀释抗原和10mg/ml表7所示各个CpG1018的溶液(溶剂为生理盐水，溶质为CpG1018，表7中以CpG表示)按照不同体积置于加有转子的玻璃瓶中80rpm/min混合均匀，得到不同配比的CpG佐剂疫苗，其中抗原与佐剂的质量比如表7所示。
3：双佐剂疫苗配置
室温条件下将0.4mg/ml的稀释抗原、铝佐剂(氢氧化铝混悬液(其中铝含量10mg/ml)、10mg/ml浓度CpG的溶液按照不同体积置于加有转子的玻璃瓶中低速混合均匀，得到不同双佐剂疫苗，其中抗原与佐剂的质量比如表4或表5所示。
将上述制备的疫苗，无菌条件下分装入2ml西林瓶内(或预填充玻璃注射器内)，每瓶0.5ml(或1.0ml)，密封后放置于2～8℃避光保存。
佐剂组：
4、纯佐剂组制备
同上3、双佐剂疫苗配置的方法，仅是不含有抗原。
蛋白组：
5、无佐剂组制备
仅包含抗原。
6、PBS对照组
PBS对照组配制：取出PBS powder(购自索莱宝，货号：P1003)，每袋用2L无菌蒸馏水溶解。
二、免疫
取出上述一制备的各组，以C57BL/6小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)为动物模型开展了免疫原性研究。
选择6-8周龄C57BL/6小鼠随机分组，每组8只小鼠，大腿肌肉注射上述制备的各组，并设置疫苗组、无佐剂组和佐剂组，在0d、21d(以第一次免疫当天记作第0天，免疫当天起的一周，记作免疫的第1周)进行二次免疫(免疫剂量和方式如下述四中所示)，二次免疫间隔21天。
在免疫第3、5周采血，第5周取脾脏。
三、ELISA法检测血清中的抗体
免疫后第28天(约5周)采取小鼠血清用于ELISA分析，ELISA分析具体步骤如下：使用每孔200ng的RSV的F蛋白(义翘神州，货号：11049-V08B)进行包被，小鼠血清作为一抗，按照250倍、1250倍、6250倍、31250倍、156250倍、781250倍、3906250倍进行梯度稀释，二抗为鼠二抗(Cell Signaling Technology，货号：7076S)，使用酶标仪(上海科华，货号：RD-SH-012)进行信号读取。
经过2次免疫后的小鼠血清在ELISA中产生的效价检测结果：
A：筛选最佳的铝佐剂
表1不同铝盐佐剂配制的重组疫苗免疫小鼠的ELISA效价
从表1可以看出，相对于不添加铝佐剂组，两种常用的铝佐剂均可以显著性增加抗体效价，氢氧化铝佐剂与RSV-NP的组合产生更高的血清ELISA。
B：筛选最佳的铝佐剂剂量
表2筛选最佳的铝佐剂剂量的ELISA效价
结果如表2所示，30-70μg的铝佐剂均可提高抗体效价，以50μg铝佐剂的免疫效果最佳。
C：筛选到最佳的CpG佐剂剂量
表3筛选到最佳的CpG佐剂剂量的ELISA效价
结果如表3所示，25-100μg均可提高抗体效价，以50μg CpG1018佐剂的免疫效果最佳
D：筛选到最佳的双佐剂剂量
表4筛选到最佳的双佐剂剂量的ELISA效价
结果如表4所示，CpG佐剂的剂量在50μg时达到了一个平台期；相对于25μg的剂量，免疫效价显著性的提高，其后增加CpG佐剂剂量，免疫效价维持在稳定的水平。
D：探索最佳的抗原剂量
表5小鼠上探索最佳的抗原剂量的ELISA效价
结果如表5所示，抗原剂量在1μg左右达到平台期(24组与23组的P<0.01，24组与25组、26组的P>0.05)，更高的抗原剂量并没有显著提升ELISA效价值。
结论：疫苗制剂处方检测中发现，抗原含量1μg最佳；氢氧化铝佐剂50μg，CpG佐剂50μg最佳。
四、小鼠血清CPE中和试验
使用Hep-2细胞在10％牛血清的DMEM培养基中培养RSV病毒A型Long株(RSV病毒A型Long株记载于文献：Cultures of HEp-2cells persistently infected by humanrespiratory syncytial virus differ in chemokine expression and resistance toapoptosis as compared to lytic infections of the same cell type中)的TCID50为2.81E+07。选取表5中的第24组，参照表6删除相应的组分，制备各实验组，各组小鼠血清各8份，使用2％牛血清的DMEM培养基进行稀释。从40倍稀释开始，按照3倍稀释梯度稀释至174960倍，与等体积200TCID50的病毒液混合，37℃放置1小时，每孔200ul铺到Hep-2细胞板，每只小鼠血清设置3个复孔，37℃培养5-7天，观察细胞病变情况。
结果如表6所示。结果表明：本发明中的双佐剂组中和效价远超出单佐剂组，达到73152，Log2为16.5(表6)。
表6RSV病毒A型中和效价均值
编号 组别 中和效价均值
1 双佐剂疫苗组 73152
2 铝佐剂疫苗组 5217
3 CpG佐剂疫苗组 12054
4 仅佐剂组 <64
5 仅蛋白组 1563
6 PBS对照组 <100
RSV病毒的主要流行株分A型和B型。按照上述实验方法，将RSV病毒A型Long株替换为RSV病毒B型株(记载于文献：Genetic Diversity and Molecular Epidemiology ofCirculating Respiratory Syncytial Virus in Central Taiwan,2008–2017中)，使用上述各组小鼠血清进行同样程序的效价分析，得出表7数据。
表7RSV病毒B型中和效价均值
编号 组别 中和效价均值
1 双佐剂组 62746
2 铝佐剂组 4359
3 CPG佐剂组 9183
4 仅佐剂组 <64
5 仅蛋白组 1031
6 PBS对照组 <100
如表7所示，双佐剂组的中和效价相对于单佐剂组具有显著性的提高，两者具有协同作用。
采用其他PreF突变体的融合蛋白(例如RSV-PreF-A-NP(SEQ ID No.12)、RSV-PreF-B-NP(SEQ ID No.13)、RSV-PreF-C-NP(SEQ ID No.14)、RSV-PreF-E-NP(SEQ IDNo.16)等等)观察到类似的效价和效价趋势。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种包含双佐剂的RSV疫苗，其特征在于，所述RSV疫苗包括RSV的Pre-F蛋白或其突变蛋白和双佐剂，所述双佐剂包括铝佐剂和CpG佐剂。
2.根据权利要求1所述的RSV疫苗，其特征在于，所述铝佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝中的一种或多种，优选的，所述蛋白与所述铝佐剂的质量比可为1：(0.5-300)。
3.根据权利要求1-2任一所述的RSV疫苗，其特征在于，所述CpG佐剂包括任一的CpG佐剂，例如CpG1018、CpG-cjx等等，优选的，所述蛋白与所述CpG佐剂的质量比可为1：(0.5-300)。
4.根据权利要求1-3任一所述的RSV疫苗，其特征在于，所述双佐剂中铝佐剂与CpG佐剂的质量比为(1-5)：(5-1)。
5.根据权利要求1-4任一所述的RSV疫苗，其特征在于，所述Pre-F蛋白的突变蛋白包括将Pre-F蛋白氨基酸序列进行如下a1)-a18)中至少一种突变后得到的蛋白：
a1)将Pre-F蛋白氨基酸序列第67位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；
a2)将Pre-F蛋白氨基酸序列第88位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
a3)将Pre-F蛋白氨基酸序列第110位的半胱氨酸突变为丙氨酸；
a4)将Pre-F蛋白氨基酸序列第144位的天冬酰胺突变为甘氨酸，且在第144位和第145位氨基酸之间插入半胱氨酸；
a5)将Pre-F蛋白氨基酸序列第159位的酪氨酸突变为半胱氨酸；
a6)将Pre-F蛋白氨基酸序列第173位的半胱氨酸缺失；
a7)将Pre-F蛋白氨基酸序列第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸；
a8)将Pre-F蛋白氨基酸序列第227位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；
a9)将Pre-F蛋白氨基酸序列第236位的丝氨酸突变为精氨酸；
a10)将Pre-F蛋白氨基酸序列第248位的丝氨酸突变为半胱氨酸；
a11)将Pre-F蛋白氨基酸序列第289位的谷氨酸突变为天冬酰胺；
a12)将Pre-F蛋白氨基酸序列第309位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
a13)将Pre-F蛋白氨基酸序列第334位的精氨酸突变为酪氨酸；
a14)将Pre-F蛋白氨基酸序列第344位的天冬酰胺突变为谷氨酸；
a15)将Pre-F蛋白氨基酸序列第370位的丝氨酸突变为甘氨酸；
a16)将Pre-F蛋白氨基酸序列第389位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；
a17)将Pre-F蛋白氨基酸序列第420位的半胱氨酸突变为酪氨酸；
a18)将Pre-F蛋白氨基酸序列第469位的精氨酸突变为天冬酰胺；
优选的，所述Pre-F蛋白为如下任一种：
(A1)SEQ ID No.1所示的蛋白；
(A2)在(A1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(A3)将(A1)-(A2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(A4)与(A1)-(A2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白，
更优选的，Pre-F蛋白的突变蛋白为如下任一种：
(M1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQID No.7或SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示的蛋白；
(M2)在(M1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(M3)将(M1)-(M2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(M4)与(M1)-(M2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
6.根据权利要求1-5任一所述的RSV疫苗，其特征在于，所述Pre-F蛋白或其突变蛋白与其他蛋白形成融合蛋白，
优选的，所述其他蛋白包括铁蛋白或其突变体，所述融合蛋白包括铁蛋白-PreF融合蛋白，
更优选的，所述融合蛋白，其包括铁蛋白突变体；
进一步优选的，所述铁蛋白突变体为将铁蛋白氨基酸序列进行如下b1)-b3)中至少一种突变后得到的蛋白：
b1)将铁蛋白氨基酸序列第15位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺；
b2)将铁蛋白氨基酸序列第96位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
b3)将铁蛋白氨基酸序列第119位的酪氨酸突变为精氨酸；
更优选的，所述铁蛋白为如下任一种：
(B1)SEQ ID No.10所示的蛋白；
(B2)在(B1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(B3)将(B1)-(B2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(B4)与(B1)-(B2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
7.根据权利要求6所述的RSV疫苗，其特征在于：所述铁蛋白突变体为如下任一种：
(N1)SEQ ID No.11所示的蛋白；
(N2)在(N1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(N3)将(N1)-(N2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(N4)与(N1)-(N2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白；
或，所述融合蛋白为如下任一种：
(C1)SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.15或SEQ ID No.16或SEQ IDNo.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19所示的蛋白；
(C2)在(C1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(C3)将(C1)-(C2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(C4)与(C1)-(C2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
8.权利要求1-7任一所述的RSV疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将所述蛋白或融合蛋白与双佐剂混合。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括上述任一的蛋白或者融合蛋白的制备步骤，
优选的，所述蛋白或者融合蛋白的制备步骤包括使编码权利要求1-7任一所述蛋白或融合蛋白的核酸分子在生物或生物细胞中进行表达，得到所述蛋白或融合蛋白。
10.权利要求1-7任一所述的疫苗在如下Y1)-Y3)任一种中的应用：
Y1)制备抗呼吸道合胞病毒的产品；
Y2)制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的产品；
Y3)制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的产品。
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