CN105854009A - 应用番鸭肝炎病毒制备灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种应用番鸭肝炎病毒GS14株制备番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗的制备方法。它以番鸭肝炎病毒GS14株为免疫原，以重组鸡集落刺激因子为佐剂制得疫苗。番鸭肝炎病毒GS14株，于2016年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No:V201623。本发明的有益效果是该疫苗在使用时可肌肉或皮下注射，疫苗吸收快，无肉芽肿形成，对雏番鸭基本无应激反应，与蜂胶、油佐剂疫苗比较具有更好的安全性。用于预防，保护率90％以上，保护期长达3个月。且疫苗中作为免疫佐剂的重组鸡集落刺激因子有刺激机体免疫细胞发育作用，能非特异性增强机体免疫功能。

Description

应用番鸭肝炎病毒制备灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种疫苗的制备方法，特别涉及一种应用番鸭肝炎病毒GS14株制备番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗的制备方法。
背景技术
自2013年以来，我国部分地区番鸭流行一种以临床症状为采食量猛增而后基本绝食，精神沉郁，喜伏卧，拉黄绿色稀便，偶见呼吸啰音，病鸭脱水、消瘦，死亡前有类似鸭病毒性肝炎的神经症状；剖检症状为偶见心包积液、心肌出血和胰腺坏死，常见肝脏肿大、比同日龄正常番鸭肝脏大至少20％，整个肝脏背景颜色为暗黄色或灰白色而非肝脏正常的暗红色，肝脏局部有密集出血点而出血点区域外则苍白或整个肝脏有散在的针尖大小血点，胆囊内有深绿色胆汁、体积比同日龄正常番鸭胆囊增大2-5倍，脾脏肿大、有白色坏死点的疾病，番鸭发病日龄最早为4-6日龄，发病率90％以上，死亡率30％以上，临床上称为番鸭“白肝病”。
番鸭肝炎病毒(“白肝病”)一旦感染，整群番鸭发病率大于90％，死亡率大于30％。临床发病后按常规抗病毒结合抗菌的治疗方案，效果不佳，治愈率低于40％，病程长，耐过番鸭发育受阻，料肉比正常番鸭高20％以上，出栏时间延长15天以上，发育不整齐，严重影响了番鸭养殖的经济效益。
发明内容
本发明提出了一种番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗的制备方法，该疫苗在使用时可肌肉或皮下注射，疫苗吸收快，无肉芽肿形成，对雏番鸭基本无应激反应，与蜂胶、油佐剂疫苗比较具有更好的安全性。用于预防，保护率90％以上，保护期长达3个月。种番鸭在开产前时颈部皮下注射免疫0.8-1.0ml,而后每隔3个月免疫1次，可使子代获得对番鸭肝炎病毒的先天免疫，保护期至少15日。且疫苗中作为免疫佐剂的重组鸡集落刺激因子有刺激机体免疫细胞发育作用，能非特异性增强机体免疫功能。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种应用番鸭肝炎病毒GS14株制备番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活 疫苗的制备方法,它以番鸭肝炎病毒GS14株为免疫原，以重组鸡集落刺激因子为佐剂，其具体步骤如下：
(1)制备抗原：将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水5000～10000倍稀释，经尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，0.1～0.2ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，然后于-20～-40℃保存；
(2)抗原灭活：将步骤(1)中的抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃下灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为36～40％；
(3)将步骤(2)中灭活后的抗原加入重组鸡集落刺激因子并补充注射用水，使重组鸡集落刺激因子为1μg/ml～2μg/ml、抗原灭活前的病毒含量为10-6.0ELD50/0.2ml～10-5.0ELD50/0.2ml，分装，然后-4℃保存；
所述番鸭肝炎病毒GS14株的保藏编号为CCTCC No:V201623。
进一步的，所述步骤(3)中重组鸡集落刺激因子为2μg/ml、抗原灭活前的病毒含量为10-5.0ELD50/0.2ml。
番鸭肝炎病毒GS14株经易感番鸭胚传代8代、鉴定，制备番鸭肝炎病毒重组集落刺激因子灭活疫苗，进行了临床预防试验。雏番鸭在3日龄及以下时皮下或肌肉注射疫苗0.3ml/只，在免疫后10天攻毒，可使雏番鸭得到保护，免疫保护期3个月，商品番鸭的饲养周期为80天-100天，该疫苗可基本保护番鸭整个生长周期；种番鸭在开产前时颈部皮下注射免疫0.8-1.0ml,而后每隔3个月免疫1次，可使子代获得对番鸭肝炎病毒的先天免疫，保护期至少15日。番鸭肝炎病毒重组集落刺激因子灭活疫苗为临床预防番鸭“白肝病”提供了有效手段。
还可以用本发明类似方法制备番鸭肝炎病毒油乳剂灭活疫苗或蜂胶佐剂灭活疫苗。但上述疫苗各有如下缺点，其一：油乳剂灭活疫苗一般推荐为皮下注射，如果不慎注射到肌肉里，易在注射部位形成肉芽肿，屠宰后的番鸭酮体有疫苗残留和肉芽肿，影响经济价值和食品安全；如注射部位为腿部，有一定比例的番鸭会因疫苗压迫神经或血管，导致番鸭腿部肌肉萎缩或瘸腿。其二：蜂胶灭活疫苗注射时应激较大，一般雏番鸭会有1天左右的采食量下降及零星死亡，影响成活率和延续出栏时间，进而影响养殖效益。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明中的集落刺激因子是一组功能很强的骨髓造血细胞增殖因子，根据其作用靶细胞，又分为很多种集落刺激因子，作用于粒细胞(G-CSF)即为其中一种，G-CSF具有刺激粒系母细胞的增殖和分化，并可增强成熟粒细胞功能的作用，在增强机体非特异性免疫过程中起重要作用。本发明用重组鸡集落刺激因子(基因工程G-CSF)经纯化后作为疫苗佐剂，起到非特异免疫增强剂作用。
本发明的疫苗在使用时可肌肉或皮下注射，疫苗吸收快，无肉芽肿形成，对雏番鸭基本无应激反应，与蜂胶、油佐剂疫苗比较具有更好的安全性。用于预防，保护率90％以上，保护期长达3个月。种番鸭在开产前时颈部皮下注射免疫0.8-1.0ml,而后每隔3个月免疫1次，可使子代获得对番鸭肝炎病毒的先天免疫，保护期至少15日。且疫苗中作为免疫佐剂的重组鸡集落刺激因子有刺激机体免疫细胞发育作用，能非特异性增强机体免疫功能。
具体实施方式
下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中的几个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、制备实施例：
原料：
1、番鸭肝炎病毒GS14株：于2016年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC No:V201623；
2、重组鸡集落刺激因子：由南京农业大学动物医学院预防兽医学系惠赠。
实施例1：
一种番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗的制备方法,它以番鸭肝炎病毒GS14株为免疫原，以重组鸡集落刺激因子为佐剂，其具体步骤如下：
(1)制备抗原：将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水10000倍稀释，经尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，0.2ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，然后于-40℃保存；
(2)抗原灭活：将步骤(1)中的抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃下灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为40％；
(3)将步骤(2)中灭活后的抗原加入重组鸡集落刺激因子并补充注射用水，使重组鸡集落刺激因子为1μg/ml、抗原灭活前的病毒含量为10-5.0ELD50/0.2ml，-4℃保存。
实施例2：
一种番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗的制备方法,它以番鸭肝炎病毒GS14株为免疫原，以重组鸡集落刺激因子为佐剂，其具体步骤如下：
(1)制备抗原：将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水5000倍稀释，经尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，0.1ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，然后于-20℃保存；
(2)抗原灭活：将步骤(1)中的抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃下灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为36％；
(3)将步骤(2)中灭活后的抗原加入重组鸡集落刺激因子并补充注射用水，使重组鸡集落刺激因子为2μg/ml、抗原灭活前的病毒含量为10-5.0ELD50/0.2ml，-4℃保存。
实施例3：
一种番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗的制备方法,它以番鸭肝炎病毒GS14株为免疫原，以重组鸡集落刺激因子为佐剂，其具体步骤如下：
(1)制备抗原：将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水8000倍稀释，经尿囊腔接种12日龄易感番鸭胚，0.15ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，然后于-30℃保存；
(2)抗原灭活：将步骤(1)中的抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃下灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为38％；
(3)将步骤(2)中灭活后的抗原加入重组鸡集落刺激因子并补充注射用水，使重组鸡集落刺激因子为1μg/ml、抗原灭活前的病毒含量为10-6.0ELD50/0.2ml，-4℃保存。
实施例4：
一种番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗的制备方法,它以番鸭肝炎病毒GS14株为免疫原，以重组鸡集落刺激因子为佐剂，其具体步骤如下：
(1)制备抗原：将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水10000倍稀释，经尿 囊腔接种12日龄易感番鸭胚，0.2ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，然后于-40℃保存；
(2)抗原灭活：将步骤(1)中的抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃下灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为38％；
(3)将步骤(2)中灭活后的抗原加入重组鸡集落刺激因子并补充注射用水，使重组鸡集落刺激因子为2μg/ml、抗原灭活前的病毒含量为10-6.0ELD50/0.2ml，-4℃保存。
二、实验例：
1、将上述实施例1中制备的抗原进行鉴定，鉴定方法和结果如下：
1.1病毒含量
抗原用生理盐水10倍系列稀释，取10-5、10-6和10-73个稀释度接种12日龄易感番鸭胚，每个稀释度各接种5枚，0.2ml/胚，用蜡封孔，于37℃静置孵化，24小时以前死亡的番鸭胚弃去不计，收集24～168小时死亡番鸭胚，按Reed-Muench法计算病毒含量为10-6.50ELD50/0.2ml。
1.2毒力
抗原用生理盐水10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5和10-64个稀释度接种5日龄易感番鸭，每个稀释度各肌肉注射接种10只，0.5ml/只，上述番鸭分别隔离饲养，观察10日，统计各组番鸭死亡数，按Reed-Muench法计算病毒含量为10-4.40LD50/0.5ml。
1.3纯净性
抗原按照现行《中华人民共和国兽药典》进行细菌、支原体和外源病毒检验合格。
1.4特异性
抗原用生理盐水稀释至200ELD50/0.2ml，与等量抗番鸭肝炎病毒特异性血清混合，37℃水浴中和1小时，尿囊腔接种12日龄易感番鸭胚10枚，0.2ml/胚；同时设病毒对照10枚，接种同条件处理的病毒与生理盐水混合液0.2ml/枚，上述番鸭胚用蜡封孔，于37℃静置孵育，观察至168小时。中和组番鸭胚全部健活，对照组番鸭胚全部死亡。说明抗原能被抗番鸭肝炎病毒特异性血清中和。
1.5免疫原性
1.5.1抗原灭活
抗原加体积终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟。
1.5.2灭活检验
1.5.2.1无菌按照现行《中华人民共和国兽药典》检验，无细菌生长。
1.5.2.2安全检验灭活抗原皮下或肌肉注射5日龄番鸭10只，1.0ml/只。饲养观察14日，不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
1.5.2.3免疫接种
5日龄健康雏番鸭20只，分为2组，每组10只，1组番鸭颈部皮下接种灭活抗原接种0.5ml/只，2组为对照组不做任何处理，上述两组番鸭隔离饲养。接种灭活抗原后15日，1组和2组番鸭用200LD50的番鸭肝炎病毒GS14株攻毒，观察10日，统计2组番鸭发病和死亡情况。
结果：第1组番鸭全部健活。第2组番鸭全部发病，死亡40％。结果说明抗原免疫原性良好。
将上述实施例2、实施例3和实施例4中制备的抗原进行鉴定，鉴定方法和结果均同实施例1的鉴定结果一样。
2、将实施例1、实施例2和实施例3、实施例4制备的疫苗按下述方法进行检验：
2.1无菌检验
取疫苗，按按现行《中华人民共和国兽药典》检验，均应无细菌生长。
2.2安全性检验
取疫苗，分别皮下或肌肉注射5日龄健康番鸭10只，1.0ml/只。隔离饲养，观察14日，均未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
检验结果如下表1所示：
表1疫苗检验结果
3、疫苗与保护率关系的研究
3.1方法
实施例1疫苗
重组鸡集落刺激因子1μg/ml，抗原灭活前的病毒含量为10-5.0ELD50/0.2ml。
实施例2疫苗
重组鸡集落刺激因子2μg/ml，抗原灭活前的病毒含量为10-5.0ELD50/0.2ml。
实施例3疫苗
重组鸡集落刺激因子1μg/ml，抗原灭活前的病毒含量为10-6.0ELD50/0.2ml。
实施例4疫苗
重组鸡集落刺激因子2μg/ml，抗原灭活前的病毒含量为10-6.0ELD50/0.2ml。
3日龄健康番鸭雏100只，分为5组，每组20只，1-4组分别经肌肉注射上述实施例1疫苗、实施例2疫苗、实施例3疫苗、实施例4疫苗，0.3ml/只，5组为对照组，不做任何处理。在免疫后15天，对1-5组所有番鸭肌肉注射接种番鸭肝炎病毒GS14株100LD50/只，接种病毒后观察10天，统计各组番鸭发病及死亡情况。
3.2结果
当疫苗灭活前抗原的病毒含量≥10-5.0ELD50/0.2ml、重组鸡集落刺激因子含量2μg/ml时，可100％保护，具体结果见表2。
表2各组番鸭发病率与保护率
3.3结论
对3日龄番鸭的预防保护试验表明：接种相同剂量的番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗的预防保护率与抗原灭活前的病毒含量和重组鸡集落刺激因子含量有关。在抗原灭活前的病毒含量相同条件下，重组鸡集落刺激因子含量增加对提高疫苗保护率有明显作用。
4、番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗免疫后产生保护性抗体最早时间研究
4.1方法
3日龄健康番鸭雏120只，分为12组，每组10只，1-6组分别经肌肉注射免疫 实施例2制备的番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗0.3ml/只，7-12组为对照组，不做任何处理。在免疫后8、9、10、11、12、13天时，分别对1和7组、2和8组、3和9组、4和10组、5和11组、6和12组的所有番鸭肌肉注射接种番鸭肝炎病毒GS14株100LD50/只。上述各组接种病毒后观察10天，统计各组番鸭发病及死亡情况。
4.2结果
各攻毒对照组发病率100％、死亡率≥50％，免疫疫苗组100％保护是在免疫后10天，具体结果见表3。
表3各组番鸭发病率与保护率
5、番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗免疫持续期研究
5.1方法
3日龄健康番鸭雏80只，分为8组，每组10只，1-4组分别经肌肉注射免疫实施例2制备的番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗0.3ml/只，5-8组为对照组，不做任何处理。在免疫后1、2、3、4个月时，分别对1和5组、2和6组、3和7组、4和8组的所有番鸭肌肉注射接种番鸭肝炎病毒GS14株100LD50/只。上述各组接种病毒后观察10天，统计各组番鸭发病及死亡情况。
5.2结果
攻毒对照组番鸭发病率100％、死亡率≥60％，疫苗免疫组100％保护的持续期为3个月，具体结果见表4。
表4各组番鸭发病率与保护率
6、番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗保存期试验
6.1方法
取于2-8℃保存的实施例2制备的番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗，于保存6、8、10、12和15个月时分别接种10只3日龄健康番鸭0.3ml/只，同时设10只对照，在接种疫苗后12日分别对免疫组和对照组番鸭肌肉注射接种番鸭肝炎病毒GS14株100LD50/只，接种病毒后观察10天，统计各组番鸭发病及死亡情况。
6.2结果
对照组番鸭发病率均为100％，死亡率＞50％，保存6、8、10、12个月疫苗接种组番鸭100％保护，保存15个月的疫苗接种组有2只番鸭发病，但未死亡。所以确定疫苗保存期为：2-8℃保存，有效期12个月。
7、应用实施例2制备的番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗进行预防
(1)用于雏番鸭预防：
广东省肇庆市某番鸭养殖场，在2015年2月连续养殖2批次，各3500只/批，两批雏鸭间隔15天，雏番鸭均在11-15日开始发病，结合临床症状和实验室诊断为番鸭“白肝病”，死亡高峰期在发病后4-7天，死亡率均大于60％，剩余番鸭每天零星死亡至35日龄左右，至出栏时，存活的部分番鸭瘦弱，成品率分别为17.6％和22.4％，给养殖户造成了巨大经济损失。
自2015年6月，该场经清场消毒后又连续进番鸭雏3000只2批，两批间隔15日，第一批雏番鸭在进场当天皮下注射番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗0.3ml/只，第二批没有注射该疫苗，第二批饲养至9天时出现个别雏鸭拉稀、脚软，跟不上大群，12天时爆发性死亡371只，随后5天内共死亡1170只，剖检症状与2月份发生的“白肝病”症状相同，第二群至雏鸭20日龄时死亡率71.6％,而第一批则健康、未发病。结果说明该疫苗预防效果良好。
(2)种鸭预防：
广东省高明市某番鸭养殖场的种番鸭2300只在开产前20日颈部皮下注射免疫1.0ml,而后每隔3个月免疫1次，该批种鸭所产部分种蛋孵化的雏番鸭37000只，分到周边16个养殖场，经跟踪调查，几乎未见发生番鸭“白肝病”症状，母源抗体 保护率98％以上。结果说明该疫苗免疫种鸭后对雏鸭有较好的保护率。
8、番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗质量标准
本品系用番鸭肝炎病毒GS14株接种番鸭胚培养，收获接种后60～168小时死亡番鸭胚的尿囊液，灭活，添加重组鸡集落刺激因子制成灭活疫苗。用于番鸭肝炎病毒(临床称为“白肝病”)的预防。
【性状】本品为微棕色至淡红色液体，久置瓶底有微量沉淀。
【无菌检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无细菌生长。
【支原体检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无支原体生长。
【外源病毒检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无外源病毒污染。
【安全检验】用5日龄健康番鸭10只，每只皮下注射本品1.0ml，连续观察14日，番鸭应全部健活。
【主要成分与含量】疫苗中含番鸭肝炎病毒GS14株和重组鸡集落刺激因子，灭活前的番鸭肝炎病毒含量≥10-6.0ELD50/0.2ml，重组鸡集落刺激因子含量2μg/ml。
【甲醛残留】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应符合规定。
【规格】250ml/瓶。
【贮藏与有效期】2～8℃贮存，有效期为12个月。
9、番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗使用说明
【作用与用途】用于预防番鸭肝炎病毒(临床称为“白肝病”)，免疫保护期为3个月。
【主要成分与含量】疫苗中含番鸭肝炎病毒GS14株和重组鸡集落刺激因子，灭活前的番鸭肝炎病毒含量≥10-6.0ELD50/0.2ml，重组鸡集落刺激因子含量2μg/ml。
【性状】为微棕色至淡红色液体，久置瓶底有微量沉淀。
【用法与用量】皮下或肌肉注射。3日龄及以内雏番鸭，0.3ml/羽；种番鸭开产前20天接种0.8-1.0ml/羽，而后每隔3个月免疫1次，可使子代获得对番鸭肝炎病毒的先天免疫。
【注意事项】
1、本品用于接种健康番鸭。体质瘦弱、患有其他疾病者，不应使用。
2、使用前应先使疫苗恢复到常温并充分摇匀。
3、疫苗启封后，限当日用完。
4、本品不能冻结。
5、注射针头等用具，用前需经消毒，注射部位应涂擦5％碘酒消毒。
【规格】250ml/瓶。
【贮藏与有效期】8～12℃贮存，有效期为12个月。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种应用番鸭肝炎病毒GS14株制备番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗的制备方法,其特征在于：它以番鸭肝炎病毒GS14株为免疫原，以重组鸡集落刺激因子为佐剂，其具体步骤如下：
(1)制备抗原：将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水5000～10000倍稀释，经尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，0.1～0.2ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，然后于-20～-40℃保存；
(2)抗原灭活：将步骤(1)中的抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃下灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为36～40％；
(3)将步骤(2)中灭活后的抗原加入重组鸡集落刺激因子并补充注射用水，使重组鸡集落刺激因子为1μg/ml～2μg/ml、抗原灭活前的病毒含量为10-6.0ELD50/0.2ml～10-5.0ELD50/0.2ml，分装，然后-4℃保存；
所述番鸭肝炎病毒GS14株的保藏编号为CCTCC No:V201623。
2.根据权利要求1所述的应用番鸭肝炎病毒GS14株制备番鸭肝炎病毒重组鸡集落刺激因子佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中重组鸡集落刺激因子为2μg/ml、抗原灭活前的病毒含量为≥10-5.0ELD50/0.2ml。
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