CN105688204A - 肉鸭细小病毒灭活疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肉鸭细小病毒灭活疫苗，涉及疫苗领域，主要包括种毒、抗原制备、抗原的鉴定、灭活疫苗制备和疫苗检验，收集完成抗原之后，进行抗鸭细小病毒特异性血清制备，对抗原进行无菌和病毒含量检测，无菌检验合格，以实现对鸭细小病毒的预防的功能。

Description

肉鸭细小病毒灭活疫苗
技术领域
本发明涉及一种肉鸭细小病毒灭活疫苗，主要涉及疫苗领域。
背景技术
2014年11月以来，我国部分地区肉鸭流行一种以临床症状为鸭喙发育不良，舌头外露、肿胀、向下弯曲，发病率为10-30％，如无细菌、病毒继发感染，则死亡率一般低于3％。鸭发病表现为2个阶段，第一阶段为7～13日龄，症状为站立不稳，蹼外翻，强行驱赶时跛行或翻滚；第二阶段为21～28日龄，在第一阶段基础上，病鸭主要表现为运动障碍，跟不上大群，呈蹲坐式或侧卧，表现出喙短、舌头外露症状。患病鸭料肉比正常鸭高30％以上，同日龄出栏体重比正常鸭低20％以上，且发育不整齐，屠宰时易翅膀和腿骨折。禽病专家刁有祥等最先分离到病原，基因序列鉴定与鹅细小病毒同源性大于98％，与番鸭细小病毒同源性为77％左右，命名为鸭细小病毒。
该病无疫苗用于预防，常规的抗病毒和抗菌治疗方法基本无效，即使用肉鸭细小病毒特异性抗体进行治疗，虽然效果较好，但鸭子患病期间料肉比高，且会发生部分死亡，相应地提高了养殖成本等，屠宰后有喙短舌头外露的肉鸭酮体价格比正常鸭低10％，对鸭养殖业造成巨大经济损失。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提出一种预防肉鸭细小病毒的肉鸭细小病毒灭活疫苗。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：肉鸭细小病毒灭活疫苗，包括种毒、抗原制备、抗原的鉴定、灭活疫苗制备和疫苗检验，其特征在于，制备抗原之后，进行抗鸭细小病毒特异性血清制备，对抗原进行无菌和病毒含量检测，无菌检验合格、病毒含量大于等于10-6.0ELD50/0.1ml的抗原用终浓度为0.2％甲醛于室温灭活24小时，期间振摇3次，每次3分钟，进行无菌和灭活检验合格，按油相：水相1:1乳化，制成油乳剂灭活疫苗并检验合格，按如下免疫程序免疫健康鸭20只，用于制备抗鸭细小病毒特异性血清。
首免：腿部肌肉注射油乳剂灭活疫苗0.5ml。
二免：颈部皮下注射油乳剂灭活疫苗1.0ml。
三免：胸部肌肉分点注射油乳剂灭活疫苗1.5ml。
三免结束后21日，宰杀鸭子，收集血液，于4℃、12000rpm离心，分离血清，加入终浓度为0.1％甲醛于室温灭活24小时，期间振摇3次，每次3分钟，加入过滤除菌，进行无菌合格，检测鸭细小病毒琼扩抗体效价为1:32，结果同时也说明抗原的免疫原性良好。
进一步，灭活疫苗的制备为灭活抗原加入鸭白细胞介素2，使鸭白细胞介素2终浓度为5μg/ml，灭活前的鸭细小病毒含量大于等于10-6.50ELD50/0.1ml，分装，2-8℃保存，即为肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗。
本发明的技术效果如下：制备的肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗于2015年10月-2015年12月在山东聊城、菏泽等地的8个、曾经发生过该病的肉鸭养殖场进行了临床预防试验，共计34000羽樱桃谷肉鸭在2日龄进行了免疫，0.5ml/只，至全部鸭出栏，平均预防保护率96.45％，零星发生肉鸭细小病毒的鸭子按常规治疗方法效果较佳，基本无喙变短、舌头外露症状出现。
结果说明该疫苗的临床预防效果良好，零星发病的鸭子未能保护可能与接种疫苗过程中针头刺穿皮肤，导致部分疫苗外流，接种剂量不足。或是本身鸭子为弱雏，机体免疫反应较差，疫苗接种后保护性抗体产生较低，不足以抵抗野毒感染有关。即使鸭子发生细小病毒病，由于有部分抗体存在，在采取常规治疗方法时效果也较好，比这些养殖场未免疫过肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗以前发病后的治疗效果要好。
具体实施方式
实施例
第一步种毒
从感染鸭细小病毒的病鸭肝脏中分离、鉴定，经易感鸭胚传代12代获得。
第二步抗原制备
将肉鸭细小病毒种毒用生理盐水20000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，0.1ml/胚，收集接种60～120小时死亡鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，于-40℃保存。同时取样进行无菌和病毒含量检测。
第三步抗鸭细小病毒特异性血清制备
无菌检验合格、病毒含量≥10-6.0ELD50/0.1ml的抗原用终浓度为0.2％甲醛于室温灭活24小时，期间振摇3次，每次3分钟，按现行《中国兽药典》进行无菌和灭活检验合格，按现行《中国兽药典》方法按油相：水相1:1乳化，制成油乳剂灭活疫苗并检验合格，按如下免疫程序免疫健康鸭20只。
首免：腿部肌肉注射油乳剂灭活疫苗0.5ml。
二免：颈部皮下注射油乳剂灭活疫苗1.0ml。
三免：胸部肌肉分点注射油乳剂灭活疫苗1.5ml。
三免结束后21日，宰杀鸭子，收集血液，于4℃、12000rpm离心，分离血清，加入终浓度为0.1％甲醛于室温灭活24小时，期间振摇3次，每次3分钟，加入过滤除菌，按现行《中国兽药典》进行无菌合格，按现行《中国兽药典》的琼脂扩散试验法检测鸭细小病毒琼扩抗体效价为1:32。
第四步抗原鉴定
1病毒含量
抗原用生理盐水10倍系列稀释，取10-5、10-6和10-73个稀释度接种9日龄易感鸭胚，每个稀释度各接种5枚，0.1ml/胚，用蜡封孔，于37.5℃静置孵化，24小时以前死亡的鸭胚弃去不计，收集24～168小时死亡鸭胚，按Reed-Muench法计算病毒含量为10-6.75ELD50/0.1ml。
2纯净性
抗原按照现行《中华人民共和国兽药典》进行细菌、支原体和外源病毒检验合格。
3特异性
抗原用生理盐水稀释至200ELD50/0.1ml，与等量抗鸭细小病毒特异性血清混合，37℃水浴中和1小时，尿囊腔接种9日龄易感鸭胚10枚，0.1ml/胚；同时设病毒对照10枚，接种同条件处理的病毒与生理盐水混合液0.1ml/枚，上述鸭胚用蜡封孔，于37℃静置孵育，观察至168小时。中和组鸭胚全部健活，对照组鸭胚全部死亡。说明抗原能被抗鸭细小病毒特异性血清中和。
4免疫原性
4.1抗原灭活
抗原加终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟。
4.2灭活检验
4.2.1无菌按照现行《中华人民共和国兽药典》检验，应无细菌生长。
4.2.2安全检验灭活抗原皮下或肌肉注射5日龄雏鸭10只，1.0ml/只。饲养观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
4.3免疫接种
3日龄健康雏鸭40只，分为2组，每组20只。第一组颈背部皮下注射灭活检验合格的抗原0.3ml；第二组为对照组，不做任何处理，两组雏鸭隔离饲养。在第一组免疫后15日，上述2组雏鸭肌肉注射肉鸭细小病毒0.5ml/只，观察20日，统计各组雏鸭发病死亡情况(鸭临床发病标准为：发病前期为鸭子拉稀，流泪，站立或行走困难；发病后期为发育迟缓，喙短，舌头露出等)。
4.4结果
第一组雏鸭在攻毒后健活，无临床发病症状；第二组雏鸭在攻毒后3天开始表现出临床发病症状，至攻毒后16天开始有7只鸭子表现出喙短、舌头外露症状，观察期内死亡2只，剖检症状主要为肠道轻微出血、浆膜炎(致死的主要原因为继发感染鸭疫里氏杆菌)。结果说明肉鸭细小病毒免疫原性良好。
第五步鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗制备
灭活抗原加入鸭白细胞介素2，使鸭白细胞介素2终浓度为5μg/ml，灭活前的鸭细小病毒含量≥10-6.50ELD50/0.1ml，分装，2-8℃保存，即为肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗。
第六步疫苗检验
1无菌检验
疫苗按现行《中华人民共和国兽药典》检验，均无细菌生长。
2安全性检验
疫苗皮下或肌肉注射5日龄健康雏鸭10只，1.0ml/只；同时设相同日龄和数量的生理盐水对照，接种生理盐水，剂量同疫苗。两组雏鸭分别隔离饲养观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗免疫接种剂量与保护率关系
1疫苗接种剂量与保护率关系
1.1方法
2日龄雏鸭40只，分为4组，每组10只，1-3组分别经颈部皮下注射疫苗0.2ml/只、0.3ml/只、0.5ml/只，4组为对照组，不做任何处理。在免疫后15天，对1-4组所有雏鸭肌肉注射肉鸭细小病毒0.5ml/只，观察10日，统计各组雏鸭发病死亡情况。
1.2结果
1组有2只雏鸭表现出肉鸭细小病毒感染后的临床发病症状，未死亡；2-3组均健活，未发病。4组均表现出肉鸭细小病毒感染后的临床发病症状，死亡1只，剖检症状为肠道轻微出血。结果说明肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗免疫≥0.3ml/只可100％保护。
2疫苗免疫后产生保护性抗体的最早时间
2.1方法
2日龄雏鸭80只，分为8组，每组10只，1-4组分别经颈部皮下注射疫苗0.3ml/只，5-8组分别经颈部皮下注射疫苗0.5ml/只。在免疫后6、7、8和10天时，对1-4组和5-8组所有雏鸭肌肉注射肉鸭细小病毒0.5ml/只，观察20日，统计各组雏鸭发病死亡情况。
2.2结果
1组和2组分别有2只和1只雏鸭表现出肉鸭细小病毒感染后的临床发病症状，未死亡。3-4组均健活，未发病。5组有1只表现出肉鸭细小病毒感染后的临床发病症状，未死亡只。6-8组均健活，未发病。免疫疫苗后攻毒再发病的雏鸭的临床症状与现地自然感染发病症状比较要轻很多，尤其是后期喙短舌头外露症状不明显。结果说明肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗免疫0.3ml/只和0.5ml/，分别在免疫后8天和7天可100％保护。
肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗免疫持续期试验
1方法
2日龄樱桃谷雏鸭100只，分为10组，每组10只，1-5组分别经肌肉注射免疫肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗0.5ml/只，6-10组为对照组，不做任何处理。在免疫后1、1.5、2、2.5、3个月时，分别对1和6组、2和7组、3和8组、4和9组、5和10组的所有鸭肌肉注射接种肉鸭细小病毒0.5ml/只，观察20日，统计各组雏鸭发病死亡情况。
2结果
攻毒对照组鸭发病率100％、死亡率≤10％，疫苗免疫组100％保护的持续期为3个月，可充分保护商品肉鸭整个饲养周期。具体结果见表2。
表2各组鸭发病率与保护率
分组 1 6 2 7 3 8 4 9 5 10
发病率％ 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100
死亡率％ 0 10 0 0 0 0 0 10 0 0
保护率％ 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0
鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗保存期试验
1方法
取于2-8℃保存的肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗，于保存6个月时接种10只2日龄樱桃谷雏鸭0.5ml/只，同时设10只对照，在接种疫苗后10日分别对免疫组和对照组鸭肌肉注射接种肉鸭细小病毒0.5ml/只，观察20日，统计各组雏鸭发病死亡情况。
2结果
对照组鸭发病率均为100％，死亡率10％，保存6个月疫苗接种组鸭100％保护。所以暂定疫苗保存期为：2-8℃保存，有效期6个月。更长的疫苗保存期有待于进一步研究。
鸭坦布苏病毒转移因子-白细胞介素2佐剂灭活疫苗质量标准
本品系用肉鸭细小病毒接种易感鸭胚培养，收获接种后60～120小时死亡鸭胚的尿囊液，灭活，添加鸭白细胞介素2，制成灭活疫苗。用于肉鸭细小病毒病的预防。
【性状】本品为微棕色至淡红色液体，久置瓶底有微量沉淀。
【无菌检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无细菌生长。
【支原体检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无支原体生长。
【外源病毒检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无外源病毒污染。
【安全检验】用2日龄健康樱桃谷雏鸭10只，每只皮下注射本品1.0ml，连续观察14日，雏鸭应全部健活。
【主要成分与含量】疫苗中含肉鸭细小病毒和鸭白细胞介素2。灭活前的肉鸭细小病毒含量≥10-6.0ELD50/0.1ml，鸭白细胞介素2终浓度为5μg/ml。
【甲醛残留】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应符合规定。
【贮藏与有效期】2～8℃贮存，有效期暂定为6个月。
肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗的使用说明
【作用与用途】用于预防樱桃谷肉鸭细小病毒病，免疫保护期为至少3个月。
【主要成分与含量】疫苗中含肉鸭细小病毒和鸭白细胞介素2。灭活前的肉鸭细小病毒含量≥10-6.0ELD50/0.1ml，鸭白细胞介素2终浓度为5μg/ml。
【性状】为微棕色至淡红色液体，久置瓶底有微量沉淀。
【用法与用量】皮下或肌肉注射。2日龄雏鸭，每只0.5ml。
【注意事项】
1、本品用于接种健康鸭。体质瘦弱、患有其他疾病者，不应使用。
2、使用前应先使疫苗恢复到常温并充分摇匀。
3、疫苗启封后，限当日用完。
4、本品不能冻结。
5、注射针头等用具，用前需经消毒，注射部位应涂擦5％碘酒消毒。
6、由于无鸭肝炎母源抗体的肉雏鸭在1日龄时通常要接种鸭肝炎抗体来预防鸭病毒性肝炎，所以在2日龄接种该疫苗时在饲料或饮水中添加适量多维，最好在天黑后1小时开始免疫接种，轻抓轻放，将应激程度降到最小，以防对雏鸭生长发育造成影响。或根据当地肉鸭细小病毒疫情发生情况和雏鸭健康状况，疫苗免疫时间适当推迟1-2天，与接种鸭肝抗体时间间隔2天以上，减小应激。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.肉鸭细小病毒灭活疫苗，包括种毒、抗原制备、抗原的鉴定、灭活疫苗制备和疫苗检验，其特征在于，制备抗原之后，进行抗鸭细小病毒特异性血清制备，对抗原进行无菌和病毒含量检测，无菌检验合格、病毒含量大于等于10-6.0ELD50/0.1ml的抗原用终浓度为0.2％甲醛于室温灭活24小时，期间振摇3次，每次3分钟，进行无菌和灭活检验合格，按油相：水相1:1乳化，制成油乳剂灭活疫苗并检验合格，按如下免疫程序免疫健康鸭20只，用于制备抗鸭细小病毒特异性血清；
首免：腿部肌肉注射油乳剂灭活疫苗0.5ml；
二免：颈部皮下注射油乳剂灭活疫苗1.0ml；
三免：胸部肌肉分点注射油乳剂灭活疫苗1.5ml；
三免结束后21日，宰杀鸭子，收集血液，于4℃、12000rpm离心，分离血清，加入终浓度为0.1％甲醛于室温灭活24小时，期间振摇3次，每次3分钟，加入过滤除菌，进行无菌合格，检测鸭细小病毒琼扩抗体效价为1:32，结果同时也说明抗原的免疫原性良好。
2.根据权利要求1所述的肉鸭细小病毒灭活疫苗，其特征在于：所述灭活疫苗的制备为灭活抗原加入鸭白细胞介素2，使鸭白细胞介素2终浓度为5μg/ml，灭活前的鸭细小病毒含量大于等于10-6.50ELD50/0.1ml，分装，2-8℃保存，即为肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗。
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