CN101496898B - 一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗。该疫苗的活性成分为HP0762蛋白，所述HP0762蛋白的氨基酸序列如GenBank AccessionNo.ACM46115.1所示。首先通过反向疫苗学的方法从幽门螺杆菌基因组中筛选新的疫苗候选抗原，将筛选得到的候选抗原与粘膜佐剂CTB混合，鼻饲免疫BALB/c小鼠，口服幽门螺杆菌SS1攻毒，评价抗原的保护性。结果表明，HP0762有效地诱导了特异性sIgA的生成和血清中高效价的IgG，HP0762与粘膜佐剂CTB混合后免疫BALB/c小鼠，能够显著降低小鼠胃内菌体载量，具有明显的保护性。

Description

一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗

技术领域

本发明涉及一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是导致慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃腺癌和胃淋巴瘤的主要病原菌，被世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)列为I类致癌因子(Type I carcinogen)。临床上针对幽门螺杆菌使用的抗生素治疗手段有着诸多缺点，其疫苗的开发有着非常重要的意义。目前研究中应用的抗原如幽门螺杆菌全菌破碎物、尿素酶和过氧化氢酶等均不是十分理想，所以寻找新的有效的抗原成为人们关注的焦点之一。

幽门螺杆菌是通过粘附到胃粘膜上皮表面致病的，粘附素、外膜蛋白和分泌蛋白是重要的致病因子，同时也是疫苗候选抗原。幽门螺杆菌特殊的定植环境决定了粘膜免疫是较好的疫苗免疫方式，粘膜免疫不仅能够激发强烈的体液免疫，同时还能较好的诱导局部的IgA抗体水平的升高。现有的研究表明，幽门螺杆菌裂解物、尿素酶、过氧化氢酶以及热休克蛋白等许多抗原都能够通过粘膜免疫的方式显著地降低幽门螺杆菌在胃组织中的定植水平，表现出一定的保护作用(Prinz C，Nadia H，Voland P.Helicobacter pylori virulence factors and the host immune response：implications for therapeutic vaccination.Trends in Microbiology.2003.11：134-138.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗。

本发明所提供的预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗，其活性成分为HP0762蛋白；所述HP0762蛋白的氨基酸序列如GenBank Accession No.ACM46115.1所示。

上述疫苗中还可包括佐剂，所述佐剂具体可为霍乱毒素B亚单位。

上述疫苗中，所述HP0762蛋白和所述霍乱毒素B亚单位的质量比为(1-50)∶1，具体可为8∶1。

上述疫苗可以制成滴鼻剂、喷雾剂、口服胶囊、口服剂或皮下、皮内、肌肉注射剂。

本发明的另一个目的是提供HP0762蛋白在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗中的应用，所述HP0762蛋白的氨基酸序列如GenBank AccessionNo.ACM46115.1所示。

本发明通过反向疫苗学的方法从幽门螺杆菌基因组中筛选并表达得到新的疫苗候选抗原。首先，通过生物信息学分析方法从幽门螺杆菌26695和幽门螺杆菌J99的基因组中初步筛选得到43个候选基因，然后进一步在功能分析和文献调研的基础上主要考察功能未知或可能与幽门螺杆菌致病相关的基因，从中确定了19个候选基因进入下一阶段的抗原制备与评价；然后从幽门螺杆菌SS1的基因组中扩增了上述19个基因，以pET-28a表达系统为载体分别构建重组表达质粒，转化E.coliBL21(DE3)，经过诱导，有10个重组蛋白成功表达；考察上述候选抗原是否真正存在于幽门螺杆菌外膜蛋白组分中，是否参与了对细胞的粘附，为进一步的动物实验打下基础；最后将上述成功表达并经纯化的候选抗原与粘膜佐剂CTB混合，鼻饲免疫BALB/c小鼠，口服幽门螺杆菌SS1攻毒，评价抗原的保护性。

霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B，CTB)是一种优良的无毒的粘膜佐剂，可以根据与其配伍免疫的抗原性质的不同，或者激发粘膜免疫水平的提升(主要是sIgA)，加强对机体的保护，使机体免受病原微生物的侵害，或者诱导外周耐受，降低对自身抗原或致敏原的免疫反应强度(Holmgren J，CzerkinskyC.Mucosalimmunity and vaccines.Nat Med.2005.11(4Suppl)：S45-53.)。一些幽门螺杆菌免疫保护性研究结果表明，CTB作为佐剂能够与配伍抗原一起有效地促进机体粘膜和体液免疫水平的升高，显著地降低菌体载量(Kubota E，Joh T，Tanida S，et al.Oralvaccination against Helicobacter pylori withrecombinant cholera toxin B-subunit.Helicobacter.10(4)：345-352.Ruiz-Bustos E，Sierra-BeltranA，Romero MJ，et al.Protection of BALB/c mice against experimental Helicobacter pylori infectionby oralimmunisation with H pylori heparan sulphate-binding proteins coupled to choleratoxinbeta-subunit.J Med Microbiol.2000.49(6)：535-541.Lee A，Chen M.Successfulimmunizationagainst gastric infection with Helicobacter species：use of a cholera toxinB-subunit-whole-cellvaccine.Infect Immun.1994.62(8)：3594-7.)。虽然口服免疫和鼻饲免疫两种免疫途径都可以得到很好的免疫效果，但是Blanchard等认为使用重组CTB为佐剂时，口服免疫不能够提供对幽门螺杆菌攻毒的保护作用，而鼻饲免疫却可以(Blanchard TG，Lycke N，Czinn SJ，et al.Recombinant cholera toxin B subunitisnot an effective mucosal adjuvant for oral immunization of mice against Helicobacterfelis.Immunology.1998.94(1)：22-27.)。

本发明以重组CTB为粘膜佐剂，以鼻饲的方式分四次免疫BALB/c小鼠，并适当的加大了抗原的剂量(40μg)，希望获得较好的免疫效果。免疫血清中抗体水平的测定结果显示，HP0762抗原免疫组产生了高水平的IgG抗体，且效价很高，表明该蛋白具有非常好的免疫原性。

上述免疫过的小鼠粪便和小肠粘液中sIgA的测定结果显示，与CTB免疫对照组相比，HP0762组小鼠的sIgA水平明显升高，说明CTB作为粘膜佐剂是有效的。

通过对HP0762实验组与对照组胃组织的菌体载量统计分析，发现HP0762组的菌体载量与对照组相比显著下降，p＜0.05，表现出一定的保护性。目前关于Th1、Th2型免疫反应在针对幽门螺杆菌保护作用中的机制还不是十分明确。Mohammadi等认为Th1反应更多的是与幽门螺杆菌的致病联系在一起的，而Th2反应则起到了保护的作用(Mohammadi M，Czinn S，Redline R，et al.Helicobacter-specific cell-mediatedimmune responses display a predominant Th1 phenotype and promote delayed-typehypersensitivity response in the stomachs of mice.J.Immunol.1996.156：4729-4738.Mohammadi M，Nedrud J，Redline R，et al.Murine CD4T-cell response to Helicobacterinfection：Th1 cells enhance gastritis and Th2 cells reduce reduce bacterial load.Gastroentrology 1997.113：1848-1857.)。Gottwein等发现Th1、Th2反应都可以引起保护作用(Gottwein JM，Blanchard TG，Targoni OS，et al.Protective anti-Helicobacterimmunity is induced with aluminum hydroxide or complete Freund’s adjuvant bysystemic immunization.J.Infect.Dis 2001.184：308-314.)。Akhiani等的研究则表明IL-12、Th1型反应在针对幽门螺杆菌的保护中扮演了重要的角色(Akhiani AA，PappoJ，Kabok Z，et al.Protection against Helicobacter pylori infection followingimmunization is IL-12-dependent and mediated by Th1 cells.J.Immunol.2002.169：6977-6984.)。本发明中，HP0762不仅诱发了高水平的Th2体液免疫反应，同时也引发了高水平的Th1细胞免疫反应，可能Th1型免疫反应是幽门螺杆菌保护机制中必要的一部分。

以上结果表明，HP0762有效地诱导了特异性sIgA的生成和血清中高效价的IgG，HP0762与粘膜佐剂CTB混合后免疫BALB/c小鼠，能够显著降低小鼠胃内菌体载量，具有明显的保护性。HP0762经预测是一个脂蛋白，可能定位在外膜中，BLASTn序列比对发现，HP0762在幽门螺杆菌J99、幽门螺杆菌HPAG1和幽门螺杆菌SS1中都存在同源基因，且只存在于螺杆菌属的菌株中，可能为螺杆菌属所特有。HP0762是一个新的保护性疫苗候选抗原。

附图说明

图1为PCR扩增候选抗原基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为重组质粒的构建过程

图3为重组蛋白的表达情况

图4为可溶性表达的重组蛋白的定位分析结果

图5为纯化后的HP0762蛋白的SDS-PAGE检测结果

图6为HP0762蛋白免疫BALB/c小鼠后血清中的抗体水平

图7为全菌ELISA检测结果

图8为外膜蛋白ELISA检测结果

图9为预防免疫动物实验日程安排

图10为免疫血清中IgG效价

图11为免疫血清中IgG1、IgG2a分型的效价

图12为粪便中sIgA抗体的水平

图13为小肠中sIgA抗体的水平

图14为免疫组胃组织中幽门螺杆菌的菌体载量

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、候选抗原的表达纯化及抗体的制备

1、重组质粒的构建

将幽门螺杆菌SS1(购自中国疾病预防控制中心)接种于如下培养基中：含有空肠弯曲菌琼脂基础培养基43g/L(空肠弯曲菌琼脂基础培养基(购自中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心)、5％体积百分含量脱纤羊血(购自兰伯瑞生物技术有限公司)、10μg/ml万古霉素、5μg/ml两性霉素B和10U/ml多粘菌素B，微需氧环境(5％体积百分含量O₂、10％体积百分含量CO₂和85％体积百分含量N₂)下37℃培养48-72小时，然后用改良布氏肉汤(购自中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心)收获菌体进行传代。

提取幽门螺杆菌SS1的基因组DNA，并以其为模板，通过Primer Premier 5.0辅助设计引物，在PCR产物两端设计NdeI和XhoI限制性内切酶位点，分别进行PCR扩增，结果共得到19个PCR扩增产物。其中，扩增基因HP0762的引物及PCR反应条件如表1所示。

表1扩增HP0762基因的引物及反应条件

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。其中，1为基因HP0762的PCR扩增产物，2为DNA分子量标准，自上而下依次为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp。将上述19个PCR扩增产物和pET-28a质粒分别用限制性内切酶NdeI和XhoI(购自TaKaRa公司)进行双酶切，分别回收目的片段和5289bp的载体大片段，采用T4连接酶连接。连接产物分别转化E.coli Top10感受态细胞，将转化后的感受态细胞分别接种于含终浓度为30μg/ml Kan的LB平板上进行抗性选择，挑取单克隆，采用全菌PCR方法及重组质粒限制性酶切鉴定重组子。重组质粒酶切鉴定正确，经测序鉴定也正确，得到重组质粒。重组质粒的构建过程如图2所示。

2、重组蛋白的诱导表达、定位、纯化及定量

将上述步骤1得到的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆，接种于5ml含终浓度为30μg/ml Kan的LB培养基中，37℃、220rpm/min振荡培养14h，然后以1∶100的体积比接种于新鲜的LB培养基中，37℃、220rpm/min振荡培养2.5h，待菌体密度OD_600nm达到0.6左右时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导培养5h，收集菌体超声波破碎细胞壁，12,000rpm/min离心20min，将得到的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析，确定目的蛋白的表达状况。结果表明，重组蛋白HP0762为可溶性蛋白，重组蛋白HP0762的表达情况如图3所示。其中，1为重组蛋白HP0762，2为蛋白质分子量标准，3为对照(含有pET-28a质粒的E.coliBL21(DE3))。可溶性重组蛋白HP0762的定位分析结果如图4所示。其中，1为重组菌菌液用超声波破碎细胞壁后上清液的检测结果，2为重组菌菌液用超声波破碎细胞壁后沉淀的检测结果，3为蛋白质分子量标准，自上而下依次为94Kd、67Kd、45Kd、30Kd、20Kd和14.4Kd。对获得的HP0762蛋白进行BLASTn序列比对，结果表明，HP0762的氨基酸序列如GenBank Accession ACM46115.1所示。

将200ml表达上述可溶性重组蛋白HP0762的E.coli于4℃条件下6000rpm/min离心10min，收获菌体，用PBS洗涤一次，然后将菌体重悬在20ml结合缓冲液(含有终浓度为0.02M PB、终浓度为0.5M NaCl，pH7.4)中，超声破碎，4℃条件下12,000rpm/min离心20min，取上清。将上清用0.22μm的滤膜推滤，滤液用亲和层析进行纯化。使用Amersham公司的HiTrap 5ml chelating HP柱，通过重组蛋白N端的6×His标签与Ni的亲和作用纯化蛋白。先用结合缓冲液(含有终浓度为0.02MPB、终浓度为0.5M NaCl，pH7.4)平衡Ni柱，上样后，用上述结合缓冲液洗去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液(含有终浓度为0.02M PB、终浓度为0.5M NaCl、终浓度为250mM咪唑，pH7.4)将目的蛋白洗脱下来，收集目的蛋白峰，合并，用pH7.4的20mM PB透析，浓缩。

采用Lowry法测定上述纯化后的蛋白浓度。Lowry法中涉及的溶液的组成如下：

溶液A：0.5g CuSO₄·5H₂O、1g Na₃C₆H₅O₇·2H₂O，溶于100ml双蒸水中得到；

溶液B：20g Na₂CO₃、4g NaOH，溶于1000ml双蒸水中得到；

溶液C：溶液A和溶液B按1∶50的体积比混合得到；

溶液D：Folin-酚和双蒸水按1∶1的体积混合得到。

首先制作标准曲线，配制浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL和250μg/mL的BSA溶液，分别取50μl上述各浓度的BSA溶液，加入250μl溶液C，混匀，室温避光放置15-20min，然后再加入25μl溶液D，混匀，20-30min后，测定各溶液的OD_750nm值，每个浓度做3个重复，制作标准曲线。对上述获得的HP0762蛋白进行不同倍数的稀释后，按照上述方法测定OD_750nm值，计算获得的HP0762蛋白的浓度。结果表明，上述获得的HP0762蛋白的平均浓度为2.64mg/ml。

将纯化后的HP0762蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图5所示。其中，1为HP0762蛋白的SDS-PAGE检测结果，2为蛋白分子量标准，自上而下依次为94Kd、67Kd、45Kd、30Kd、20Kd、14.4Kd。

3、免疫血清的制备及抗体水平检测

用上述步骤2获得的HP0762蛋白免疫BALB/c雌性小鼠(军事医学科学院实验动物中心)，每次免疫5只小鼠，免疫剂量为100μg，每3周免疫一次，共免疫三次。其中基础免疫一次，将HP0762蛋白和等体积弗氏完全佐剂CFA(购自Sigma公司)混合，皮下多点注射；加强免疫两次，将HP0762蛋白和等体积弗氏不完全佐剂IFA(购自Sigma公司名称)混合，腹腔注射。最后一次免疫15天后，眼眶静脉从取血，制备血清，测定抗体效价。

将上述制备的血清40,000×稀释后作为一抗，同时以未免疫HP0762蛋白的小鼠血清作为对照。用包被液(含有2.93％质量百分含量的NaHCO₃和1.95％质量百分含量的Na₂CO₃的水溶液)将上述获得的HP0762蛋白充分混悬，调整浓度为5μg/ml，4℃条件下以每孔100μl的量包被过夜，PBST洗涤三次，每次三分钟。加入含有终浓度为1％(质量百分含量)BSA的PBST溶液200μl，37℃封闭3小时。再加入上述稀释后的一抗及对照血清各100μl，37℃孵育2小时，PBST洗涤三次，每次三分钟。然后加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，每次三分钟。再加入底物邻苯二胺(OPD)，室温避光显色数分钟后加入2mol/L的H₂SO₄50μl终止反应，测定OD_492nm，以P/N大于2为阳性，其中P代表用HP0762蛋白免疫小鼠获得的血清的检测结果、N代表对照血清的检测结果。实验设三次重复，HP0762蛋白免疫BALB/c小鼠，血清40,000×稀释后抗体的水平如图6所示。结果表明，HP0762蛋白免疫小鼠后得到的抗体效价达到40,000×以上。

实施例2、HP0762的体外评价

上述实施例1制备的HP0762蛋白来自于幽门螺杆菌基因组注释中对ORFs的预测，并不一定是幽门螺杆菌中真实表达的蛋白，因此需要验证该蛋白是否在幽门螺杆菌中存在。

1、全菌ELISA检测

按每孔100μl包被液(含有2.93％质量百分含量的NaHCO₃和1.95％质量百分含量的Na₂CO₃的水溶液)裂解5×10⁶CFU幽门螺杆菌SS1菌体细胞并包被96孔板，将上述实施例1获得的免疫血清1∶5000稀释作为一抗，以未免疫HP0762蛋白的小鼠血清1∶100稀释作为对照，加入上述96孔板中，然后再加入HRP标记的羊抗小鼠IgG 1∶5000作为二抗，进行ELISA检测，结果如图7所示。实验设三次重复，结果表明，上述实施例1获得的免疫血清与对照组血清相比，与全菌蛋白反应得到了很高的阳性结果，表明HP0762蛋白确实是幽门螺杆菌SS1中真实存在的蛋白。

2、幽门螺杆菌SS1外膜蛋白ELISA检测

以20mM Tris-HCl(pH7.5)收获幽门螺杆菌SS1，4℃条件下12,000×g离心20min，将菌体沉淀用PBS洗涤三次，超声破碎15min，功率30％，超5s，停5s。然后加入DNase和RNase(使之在PBS中的终浓度为20μg/mL)室温孵育30min，4℃12,000×g离心20min去除未破碎的菌体细胞；将上清液4℃40,000×g离心30min，获得的沉淀中含有膜蛋白，将沉淀重悬于含有终浓度为2.0％(质量百分含量)SKL(十二烷基肌氨酸钠)的20mM Tris-HCl(pH7.5)中，室温静置30min，4℃40,000×g离心30min，收集沉淀，用双蒸水洗涤两次，得到外膜蛋白。

将上述获得的外膜蛋白以10μg/ml包被96孔板，以实施例1获得的免疫血清1∶5000稀释作为一抗，以未免疫HP0762蛋白的小鼠血清1∶100稀释作为对照，然后再加入HRP标记羊抗小鼠IgG 1∶5000作为二抗，进行ELISA检测，Prism软件t检验，比较免疫血清组与对照血清组OD_492nm，实验设三次重复，结果如图8所示，其中，*表示p＜0.05。ELISA检测结果表明，上述实施例1获得的免疫血清与对照组血清差异显著，表明上述实施例1获得的免疫血清可以与外膜蛋白包被物特异结合，即HP0762可能存在于外膜组分中。

实施例3、HP0762的免疫保护性评价

1、预防免疫及攻毒实验

将上述实施例1制备的HP0762和粘膜佐剂CTB(张艳红、刘传暄、马清钧，免疫亲和层析法大量制备高纯度工程菌产霍乱毒素B亚单位，中华流行病学杂志，1992，13(suppl 2)：142-144.)以8∶1的质量比混合作为疫苗，鼻饲免疫雌性BALB/c小鼠，每组8只小鼠，免疫剂量为45μg/只小鼠，每周免疫一次，共免疫四次，同时以免疫相同剂量CTB的小鼠作为对照。最后一次免疫两周后，小鼠眼眶静脉丛取血，制备血清。同时最后一次免疫两周以后，对小鼠灌胃给予幽门螺杆菌SS1进行攻毒实验，每只小鼠灌胃给予8.0×10⁸CFU幽门螺杆菌SS1，隔天灌胃一次，共灌胃3次。攻毒两周后，处死小鼠，评价HP0762的免疫保护效果。免疫动物实验的具体日程安排如图9所示。

2、血清中IgG抗体的检测及IgG1、IgG2a的分型效价

将上述步骤1获得的免疫血清500×初始稀释，然后以2倍倍比依次稀释作为一抗，分别测定各稀释度的免疫血清的OD_492nm值。将各稀释度一抗的OD_492nm值与稀释倍数通过Curve Expert 1.3软件进行曲线拟和，以OD_492nm值大于对照组OD_492nm值平均值0.5倍对应的稀释度作为抗体的效价。IgG效价测定中，对照组血清采用1∶100稀释，IgG1、IgG2a分型效价测定中，对照组血清采用1∶50稀释。

实验设三次重复，免疫血清中IgG抗体效价的测定结果如图10所示。结果表明，上述步骤1获得的免疫血清中产生了高效价的IgG抗体，抗体效价达到10⁵以上。

IgG1、IgG2a被认为是体现免疫系统Th1(IgG2a)和Th2(IgG1)反应水平的指标，采用ELISA方法测定上述步骤1获得的免疫血清中IgG1和IgG2a的效价，计算IgG1/IgG2a效价的比值，并对IgG1、IgG2a的效价取以10为底的对数。实验设三次重复，血清中IgG1、IgG2a分型效价的测定结果如表2和图11所示。

表2免疫血清中IgG1、IgG2a的效价和IgG1/IgG2a

IgG1和IgG2a抗体滴度通过ELISA方法检测。

结果表明，HP0762免疫小鼠可以激发机体产生高效价的IgG1(4.91-5.47)和IgG2a(3.86-4.87)；同时IgG1/IgG2a的比值也比较高，表现出Th2占主导的免疫反应。

3、粪便和小肠中sIgA的制备及其抗体水平检测

最后一次免疫两周后，每只小鼠取新鲜粪便2-4粒，在20ul含有终浓度为0.1％BSA、终浓度为1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)的PBS溶液中加入1mg上述小鼠粪便，彻底振荡混匀，4℃ 13,000×g离心20min，取上清，得到粪便中的sIgA溶液。

取上述步骤1处死的小鼠的一段小肠，称重，剪碎至糜状，在100ul含有终浓度为1mM PMSF、终浓度为0.05mol/L EDTA的PBS溶液中加入100mg小肠，4℃ 13,000×g离心20min，取上清，得到小肠中的sIgA溶液。

将上述实施例1制备的HP0762以10μg/ml的浓度包被96孔板，分别以上述获得的粪便和小肠中的sIgA作为一抗，以HRP标记的兔抗小鼠IgA(购自Sigma公司)为二抗，测定OD_492nm，同时以免疫相同剂量CTB的小鼠作为对照。实验设三次重复，小鼠粪便中sIgA水平的测定结果如图12所示，小肠中sIgA水平的测定结果如图13所示。

结果表明，HP0762和粘膜佐剂CTB混合后免疫小鼠，在小鼠的粪便中检测到相对于对照组明显升高的sIgA抗体(p＜0.05)；同样，也引起了小肠中sIgA水平的上升(p＜0.01)。

4、胃组织中幽门螺杆菌SS1的载量

取上述步骤1中处死的小鼠的胃组织，称重，在生理盐水中漂洗去除胃内残留的食物残渣，在玻璃研磨杵中加入1ml布氏肉汤，放入胃组织及进行研磨。将组织研磨液以10×倍比稀释，每个浓度梯度各取100μl涂布在如下培养基平板上：空肠弯曲菌琼脂基础43g/L(购自中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心)、5％体积百分含量脱纤羊血(购自兰伯瑞生物技术有限公司)、10μg/ml万古霉素、5μg/ml两性霉素B、10U/ml多粘菌素B和20μg/ml杆菌肽，37℃培养72-96小时，菌落计数，换算成CFU/g胃组织。采用Prism软件的Mann Whitney test比较免疫组与CTB对照组胃组织菌体载量，实验设三次重复，结果如图14所示。将保护性定义为：胃组织中菌体载量显著性降低(p＜0.05)。

结果表明，HP0762免疫组小鼠与CTB对照组小鼠胃组织中的菌体载量的差异有统计学意义(p＝0.014＜0.05)，HP0762对幽门螺杆菌SS1攻毒具有保护性，能显著降低小鼠胃组织中幽门螺杆菌SS1的菌体载量，具有一定的保护性作用，可以作为幽门螺杆菌疫苗抗原。

Claims (6)

1.一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗，其活性成分为HP0762蛋白，所述HP0762蛋白的氨基酸序列如GenBank Accession No.ACM46115.1所示；所述疫苗中还包括佐剂。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述佐剂为霍乱毒素B亚单位。

3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述HP0762蛋白和所述霍乱毒素B亚单位的质量比为(1-50)∶1。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述HP0762蛋白和所述霍乱毒素B亚单位的质量比为8∶1。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗的剂型为滴鼻剂、喷雾剂、口服剂、皮下注射剂、皮内注射剂或肌肉注射剂。

6.HP0762蛋白在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗中的应用，所述HP0762蛋白的氨基酸序列如GenBank Accession No.ACM46115.1所示。

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